鳳型大曲培曲階段不同部位理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化及微生物群落演替規(guī)律分析

張 艷，孟勤燕，楊美媛，白莉圓，徐 晨，張永利，閆宗科

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406）

中國(guó)白酒以其悠久的釀造歷史和獨(dú)特的釀造工藝形成了多個(gè)獨(dú)一無(wú)二的中國(guó)蒸餾酒品牌，因原料種類、工藝特點(diǎn)、主體香型等的不同被分為濃香型、鳳香型、醬香型、清香型、芝麻香型等品類。中國(guó)名優(yōu)白酒都是開(kāi)放式自然發(fā)酵[1]，通過(guò)自然富集篩選環(huán)境中的微生物而制得的大曲是白酒釀造中復(fù)雜微生物菌群的重要來(lái)源，作為白酒生產(chǎn)關(guān)鍵的糖化劑、發(fā)酵劑、生香劑，對(duì)出酒率及基酒的質(zhì)量直接發(fā)揮影響作用[2-3]。濃香型白酒[4]、清香型白酒[5]、醬香型白酒[6]等在大曲理化功能、微生物體系、大曲與白酒風(fēng)味間的關(guān)聯(lián)關(guān)系等方面已做了大量研究，全面了解了大曲培曲過(guò)程中各項(xiàng)指標(biāo)變化規(guī)律，直接或間接證明了大曲在白酒生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵作用。然而目前對(duì)鳳型大曲培曲過(guò)程中各理化指標(biāo)與微生物動(dòng)態(tài)變化更替之間的關(guān)系并不明了。因此，了解鳳型大曲培養(yǎng)過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律，進(jìn)而關(guān)聯(lián)到大曲的物理、化學(xué)指標(biāo)，摸索微生物與曲質(zhì)量之間的關(guān)系尤為重要。本研究將對(duì)鳳型大曲培曲過(guò)程進(jìn)行全程跟蹤，全面了解其理化指標(biāo)變化和微生物菌群結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，為鳳型大曲生產(chǎn)工藝調(diào)整和質(zhì)量評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

鳳型大曲：選擇2019 年8 月下旬入房的38#、64#兩房大曲進(jìn)行跟蹤研究。

試劑：三羥甲基氨基甲烷、酒石酸鉀鈉、三氯乙酸、乳酸、干酪素、己酸、丙酸辛酯等均為分析純。

儀器設(shè)備：冷凍高速離心機(jī)DH-2000R，上海德洋意邦儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)TU-1810S，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；生化培養(yǎng)箱SPX-250-Ⅱ，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；恒溫水浴鍋SYG-2S，常州朗越儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣

以0 d（入房）、2 d、6 d、10 d、14 d、18 d、22 d、28 d（出房）共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，選擇靠近門(mén)、窗和中間三個(gè)位置作為取樣點(diǎn)，取曲塊外圍3 cm 樣品粉碎后作為曲皮樣，曲塊中心3 cm 半徑內(nèi)樣品粉碎后作為曲心樣，具體取樣范圍如圖1 所示。采用四分法取樣，-20 ℃冷藏備用。

圖1 大曲取樣位點(diǎn)示意圖

1.2.2 理化指標(biāo)檢測(cè)

溫度：將溫度計(jì)直接插入曲塊中心測(cè)量曲心溫度。

其他指標(biāo)檢測(cè)：水分、酸度、淀粉、糖化力、發(fā)酵力、液化力、酯化力測(cè)定，參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.2.3 微生物群落多樣性檢測(cè)

大曲樣品送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

2.1.1 曲心溫度變化規(guī)律

制曲溫度不同，產(chǎn)生的高級(jí)醇、醛類、酚類等風(fēng)味物質(zhì)種類也會(huì)有所不同，進(jìn)而影響白酒風(fēng)格[7-8]。從圖2 可知，大曲發(fā)酵時(shí)曲心溫度整體表現(xiàn)為前緩中挺后緩落，從第8 天以后進(jìn)入大火期，維持4 d 左右，而后進(jìn)入后火期，溫度逐漸降低，第18 天降至26 ℃，直至出房曲心溫度只是小幅波動(dòng)。圖3 中64#房大曲曲心溫度變化趨勢(shì)和38#房相似。

圖2 38#房曲心溫度變化

圖3 64#房曲心溫度變化

2.1.2 水分變化規(guī)律

水在微生物代謝活動(dòng)中是不可或缺的營(yíng)養(yǎng)要素，大曲中水分的變化影響著微生物生長(zhǎng)代謝和相關(guān)功能酶系的合成[9]。從圖4、圖5 可看出，38#曲房和64#曲房曲皮曲心水分變化基本一致。發(fā)酵前期至大火期曲皮水分迅速降低，大火期后直至出房水分變化不大；發(fā)酵初期曲心水分短暫上升后迅速降低，大火期后水分依舊降低，但速率明顯下降；整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中水分由外向里逐漸擴(kuò)散，曲心始終高于曲皮。

圖4 38#房曲皮曲心水分變化

圖5 64#房曲皮曲心水分變化

2.1.3 淀粉含量變化規(guī)律

淀粉是大曲培養(yǎng)過(guò)程中微生物生長(zhǎng)繁殖、新陳代謝的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，大曲中淀粉含量變化在一定程度上反映了微生物對(duì)淀粉的利用情況[10]。從圖6、圖7 可看出，發(fā)酵前期，微生物大量繁殖，曲皮曲心中淀粉被快速利用，但淀粉消耗速率有所差異。入房時(shí)強(qiáng)化菌液（霉菌、酵母菌的強(qiáng)化功能菌稀釋液）僅噴灑于曲皮，加之曲皮與空氣直接接觸，入房后曲皮微生物大量繁殖造成淀粉含量明顯下降；而曲心因內(nèi)部供氧不足，微生物生長(zhǎng)緩慢，淀粉利用速率較低。進(jìn)入大火期后，高溫使曲皮曲心中大量微生物死亡，僅有耐高溫的得以存活，淀粉含量基本保持不變；收火后，品溫下降，部分細(xì)菌芽孢和霉菌的孢子開(kāi)始逐漸萌發(fā)；直至后期，隨著溫度下降至室溫，細(xì)菌、酵母、霉菌、放線菌等微生物開(kāi)始生長(zhǎng)繁殖，但由于后期大曲中水分含量較少，微生物生長(zhǎng)受限，淀粉含量變化不明顯。

圖6 38#房曲皮曲心淀粉含量變化

圖7 64#房曲皮曲心淀粉含量變化

圖8 38#房曲皮曲心酸度變化

圖9 64#房曲皮曲心酸度變化

大曲酸度形成來(lái)源于兩方面，一是生酸微生物代謝生成有機(jī)酸，二是微生物通過(guò)TCA 循環(huán)降解蛋白質(zhì)、脂肪和淀粉形成各種酸類物質(zhì)[11]。適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵酸度，既能抑制病原菌和腐敗微生物，又能保證功能微生物的生長(zhǎng)、糖化和發(fā)酵[12]。64#房大曲入房培養(yǎng)的第2～6 天曲皮酸度處于較高水平，主要原因是乳酸菌（豐度占比為51.75%～68.6%）大量繁殖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，發(fā)酵前期38#房大曲曲皮曲心酸度較高也是乳酸菌造成的。兩房大曲曲皮酸度在發(fā)酵初期迅速升高，大火期間隨著微生物大量消亡又迅速下降，而后曲皮酸度波動(dòng)變化，曲心趨于穩(wěn)定，主要是曲皮微生物在后期能繼續(xù)繁殖，曲心微生物生長(zhǎng)受限所致。

2.1.5 糖化力變化規(guī)律

圖10 38#房曲皮曲心糖化力變化

圖11 64#房曲皮曲心糖化力變化

糖化力是糖化型淀粉酶將淀粉糖化生成葡萄糖的過(guò)程，其活力的高低直接關(guān)系到釀酒過(guò)程中淀粉的轉(zhuǎn)化率[13]。大曲入房時(shí)曲皮糖化力高達(dá)612 U，主要是因?yàn)榇笄鸀樯习l(fā)酵，大麥小麥豌豆自身就含有一定量的糖化酶。但原料中的糖化力易受溫度影響，不夠穩(wěn)定[14]。入房前2天曲溫逐步上升，原料自身的糖化力下降，霉菌在曲皮表面大量繁殖，但尚未產(chǎn)生一定量的糖化酶[15]，所以糖化力有所下降。曲心霉菌在發(fā)酵前期較少且生長(zhǎng)緩慢，原料中的糖化力不穩(wěn)定，導(dǎo)致曲心糖化力出現(xiàn)大幅下降。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，品溫升高，曲皮表面水分迅速散失，不利于霉菌的生長(zhǎng)代謝，導(dǎo)致曲皮糖化力出現(xiàn)一定幅度的下降；曲心溫度雖不斷升高，但由于曲心內(nèi)部水分依舊高于20 %，嗜熱子囊菌繼續(xù)生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生β-葡聚糖酶[16]，致使糖化力出現(xiàn)升高現(xiàn)象。發(fā)酵后期，曲皮環(huán)境依舊不利于霉菌的生長(zhǎng)，糖化力呈下降態(tài)勢(shì)，進(jìn)入晾架期后，少數(shù)耐干燥的微生物尚能發(fā)育，曲皮糖化力再次回升。由于發(fā)酵后期曲心水分不斷下降，環(huán)境惡劣，大部分微生物停止生長(zhǎng)，直至出房，曲心糖化力處于較低水平。

2.1.6 發(fā)酵力變化規(guī)律

圖12 38#房曲皮曲心發(fā)酵力變化

圖13 64#房曲皮曲心發(fā)酵力變化

發(fā)酵力是大曲中酶系將糖類發(fā)酵后生成二氧化碳和酒精強(qiáng)弱的評(píng)價(jià)，主要受酵母菌影響[17]。在整個(gè)發(fā)酵階段，兩房大曲曲皮與曲心發(fā)酵力變化趨勢(shì)基本一致。入房時(shí)曲心發(fā)酵力主要與大曲原料本身含有的酵母菌有關(guān)，曲皮發(fā)酵力與大曲原糧、曲房微生物環(huán)境以及噴灑強(qiáng)化菌種有關(guān)。發(fā)酵前期，曲塊溫度適宜，水分氧氣充足，酵母菌等微生物大量繁殖，曲皮、曲心發(fā)酵力迅速升高。隨后曲心溫度逐漸升高，酵母活力下降，曲心發(fā)酵力迅速下降，進(jìn)入大火期，曲心發(fā)酵力降至最低；曲皮升溫幅度較曲心小，對(duì)酵母菌影響不劇烈，發(fā)酵力出現(xiàn)小幅度下降。發(fā)酵后期，雖然曲心溫度和室溫逐漸降低，但由于曲塊整體含水量較低，不適宜酵母菌大量繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵力波動(dòng)變化且處于較低水平。從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程來(lái)看，曲皮發(fā)酵力略高于曲心發(fā)酵力。

2.1.7 酯化力變化規(guī)律

圖14 38#房曲皮曲心酯化力變化

圖15 64#房曲皮曲心酯化力變化

酯化力是大曲發(fā)酵后形成的催化生酯的能力。從培曲過(guò)程來(lái)看，曲皮曲心酯化力變化規(guī)律基本一致。發(fā)酵前期，霉菌、酵母菌大量增殖，此時(shí)曲皮與曲心酯化力處于較低水平，進(jìn)入潮火期后細(xì)菌代謝酶系增強(qiáng)，酯化力迅速升高，且38#房升高幅度大于64#房。兩房曲酯化力在第18 天左右達(dá)到最大，而后略微降低逐漸趨于平穩(wěn)，直至出房，酯化力無(wú)較大變化，后期曲心酯化力高于曲皮。

2.2 鳳型大曲培曲階段微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律分析

2.2.1 真菌

水利建設(shè)工程由施工準(zhǔn)備開(kāi)始到竣工交付使用，要經(jīng)過(guò)若干工序、工種的配合施工，而工程質(zhì)量的形成不僅取決于原材料、構(gòu)配件，同時(shí)也取決于各工種、工序的作業(yè)質(zhì)量。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)工程全方位、全過(guò)程的質(zhì)量控制，按工程的形成過(guò)程，考慮設(shè)計(jì)的布局、施工布置等因素，將水利建設(shè)工程依次分為單位工程、分部工程、單元工程。項(xiàng)目劃分貫穿于工程建設(shè)的始終。

2.2.1.1 Alpha 多樣性分析

(1)培曲大曲中真菌的Alpha多樣性指數(shù)

通過(guò)Illumina高通量測(cè)序?qū)契l(fā)酵過(guò)程中的8 個(gè)樣本進(jìn)行真菌多樣性分析，在97%相似度水平下對(duì)序列聚類并對(duì)OTU劃分，結(jié)果如下。

Alpha 多樣性是指一個(gè)特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，主要用來(lái)反映單個(gè)樣品的物種多樣性、豐富度以及均勻度。表1中coverage是所有樣本序列的覆蓋率，其數(shù)值在0.999838～0.999999 之間，表明本次測(cè)序結(jié)果能完整反映培曲階段大曲中真菌菌群組成的真實(shí)情況。Chao1 和Observed_species 指數(shù)主要表征樣本中物種豐富度，其數(shù)值越大，表明樣本中包含物種的數(shù)目越多；Shannon 和simpson 指數(shù)主要表征樣本中物種多樣性，值越高表明樣本的多樣性越高[18-19]。

表1 培曲大曲中真菌的Alpha多樣性指數(shù)

由表1 可知，鳳型大曲培曲階段曲皮和曲心中真菌多樣性和豐富度隨著培曲時(shí)間的變化呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。入房大曲曲皮（Q0P）中真菌豐富度和多樣性明顯高于后期培曲階段，這是因?yàn)槿敕看笄谢烊氪罅縼?lái)自原料、環(huán)境、水中的真菌，使得曲塊中真菌豐富度和多樣性高；培曲的2～10 d 曲皮霉菌和酵母菌大量繁殖，曲塊溫度迅速上升，酸度也快速升高，此時(shí)部分不耐酸不耐熱的微生物大量衰亡或受到抑制，真菌多樣性和豐富度降低；培曲10 d 以后，霉菌和酵母菌增殖緩慢，大部分酵母菌衰亡，曲塊溫度和酸度逐漸降低后趨于穩(wěn)定，部分細(xì)菌開(kāi)始增殖，曲塊中微生物結(jié)構(gòu)在經(jīng)歷環(huán)境的淘汰選擇后逐漸平穩(wěn)，因此曲塊中真菌群落多樣性和豐富度在培曲的后期相對(duì)穩(wěn)定。入房時(shí)曲心微生物多樣性低于曲皮，主要因?yàn)榍け砻鎳姙⒘藦?qiáng)化菌液且大量接觸環(huán)境，表明了環(huán)境微生物對(duì)大曲培養(yǎng)的重要作用；培曲前期曲心水分流失速度較緩，酸度上升幅度小，真菌種群豐富度和多樣性要高于曲皮；后期由于曲心內(nèi)部溫度較高，含氧量不足等原因使得曲心真菌的微生物多樣性又低于曲皮。出房混合樣的真菌多樣性和豐富度要高于曲皮和曲心，這可能是因?yàn)榍ず颓臉颖局荒艽泶笄鷫K表皮和最中心部位，而曲皮和曲心的中間過(guò)渡部位中微生物多樣性豐富。

(2)稀疏曲線

圖16 為鳳型大曲培曲階段真菌群落稀疏曲線，橫坐標(biāo)為測(cè)序深度，縱坐標(biāo)為OTU 數(shù)。曲線的平緩程度反映了測(cè)序深度對(duì)觀測(cè)樣本多樣性影響程度，通過(guò)稀疏曲線可以在相同測(cè)序深度下比較不同樣本中OTU 數(shù)量的多少，進(jìn)而衡量每個(gè)樣本中物種多樣性高低[20]。由圖16 可知，測(cè)序深度在10000 以后樣本中0TU 數(shù)量增加趨勢(shì)平緩，稀疏曲線都已進(jìn)入平臺(tái)期，表明測(cè)序深度合理，結(jié)果真實(shí)可靠。圖17 中入房大曲曲皮和曲心中真菌群落多樣性最高。

圖16 培曲大曲中真菌稀疏曲線

圖17 培曲大曲中屬水平真菌組成分布

2.2.1.2 物種分類學(xué)分析

大曲作為多菌種微生態(tài)制品，其所含微生物的種類和數(shù)量直接影響著白酒的產(chǎn)質(zhì)量和風(fēng)格特征[21]。從圖17 可看出，曲坯入房時(shí)真菌種類較多，第0 天曲皮與曲心在種群豐富度及占比關(guān)系上存在一定差異，曲皮以伊薩酵母屬（Issatchenkia）、鏈格孢屬（Alternaria）和威克漢姆酵母屬（Wicherhamomyces）為主，曲心以伊薩酵母屬、鏈格孢屬和畢赤酵母屬（Pichia）為主。兩者之間的差異主要由于曲坯入房后會(huì)在曲皮表面噴灑強(qiáng)化菌液，菌液難以立即滲入曲心。經(jīng)過(guò)上霉階段，曲皮以伊薩酵母屬和畢赤酵母屬為主，曲心以伊薩酵母屬和哈薩克斯坦酵母屬（Kazachstania）為主。第6 天，曲皮曲心主要以伊薩酵母屬為主。溫度持續(xù)升高，大火期時(shí)，由于曲心溫度達(dá)到60 ℃，耐高溫的嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）占主導(dǎo)地位，而曲皮較曲心升溫速度慢，此時(shí)依舊以伊薩酵母屬為主，但嗜熱子囊菌屬所占比例逐漸升高。大火期結(jié)束時(shí)，曲心除嗜熱子囊菌屬外，其他真菌基本死亡，此時(shí)曲皮除了伊薩酵母屬和嗜熱子囊菌屬外，還有一定量的根霉（Rhizopus）。隨后溫度逐漸下降，其他真菌逐漸開(kāi)始生長(zhǎng)，曲皮曲心中嗜熱子囊菌屬相對(duì)豐度逐漸降低。從第22 天直至出房，曲皮以伊薩酵母屬和嗜熱子囊菌屬為主，還有一定量的曲霉屬（Aspergillus），此時(shí)，曲心溫度降至25 ℃左右，曲霉屬生長(zhǎng)條件較適宜，開(kāi)始大量繁殖。從出房混合大曲樣來(lái)看，其主要以嗜熱子囊菌屬、伊薩酵母屬和曲霉屬為主。從整個(gè)大曲發(fā)酵過(guò)程上來(lái)看，曲皮中優(yōu)勢(shì)菌種主要為伊薩酵母，曲心在大火期之前優(yōu)勢(shì)菌種為伊薩酵母，經(jīng)過(guò)大火煉菌，嗜熱子囊菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌種，在發(fā)酵后期，曲霉屬開(kāi)始大量繁殖，至大曲出房，曲心優(yōu)勢(shì)菌種為嗜熱子囊菌屬和曲霉屬。嗜熱子囊菌屬、威克漢姆酵母屬對(duì)大曲糖化力和液化力的提升有積極作用，根霉對(duì)提升大曲酯化力作用明顯[22]。

2.2.1.3 物種組成熱圖

圖18 為大曲培曲過(guò)程中真菌組成熱圖，紅色越深表明物種豐度越大，藍(lán)色越深表明物種豐度越小[23]。由圖18可知，入房大曲的微生物組成與發(fā)酵期存在明顯區(qū)別，0 d 時(shí)大曲曲皮曲心中真菌種類較多，發(fā)酵開(kāi)始后，大曲中真菌多樣性和豐富度迅速降低。入房曲坯中真菌種類繁多，來(lái)源于環(huán)境、原料、水等，發(fā)酵開(kāi)始后，部分微生物因不適應(yīng)曲房環(huán)境迅速衰亡，此時(shí)霉菌和酵母菌大量增殖；中后期隨著曲坯品溫升高，只有一些耐高溫的細(xì)菌及少量霉菌存活，大曲培養(yǎng)階段微生物菌群結(jié)構(gòu)在與環(huán)境的淘汰和適應(yīng)過(guò)程中逐漸穩(wěn)定。

圖18 培曲大曲中屬水平真菌組成熱圖

2.2.2 細(xì)菌

2.2.2.1 Alpha 多樣性分析

(1)培曲大曲中細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)

通過(guò)Illumina高通量測(cè)序?qū)契l(fā)酵過(guò)程中的8 個(gè)樣本進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。在97 %相似度水平下對(duì)序列聚類并對(duì)OTU劃分，結(jié)果如下。

培曲階段大曲中細(xì)菌群落多樣性及豐富度隨培養(yǎng)時(shí)間的不同有所變化。入房曲坯曲皮和曲心的Chao1 指數(shù)和Observed_species 指數(shù)都比較高，表明入房大曲中細(xì)菌多樣性高，培養(yǎng)2 d 后由于霉菌、酵母菌的大量增殖，曲塊酸度和溫度上升，部分細(xì)菌因不適應(yīng)環(huán)境而大量衰亡，多樣性減小[24]。培養(yǎng)的6～18 d 是細(xì)菌大量繁殖時(shí)期，此時(shí)細(xì)菌菌落豐富度逐漸增大，種類增多；整體看大曲曲皮細(xì)菌多樣性和豐富度要高于曲心。

表2 培曲大曲中細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)

（2）稀疏曲線

圖19 為培曲階段大曲中細(xì)菌稀疏曲線，圖中曲線逐漸趨于平坦，表明測(cè)序深度基本合理，足以代表所有樣本信息。由圖19 可以看出，同一測(cè)序深度下，曲皮微生物多樣性要高于曲心。

圖19 培曲大曲中細(xì)菌稀疏曲線

2.2.2.2 物種分類學(xué)分析

相對(duì)于大曲中真菌的物種組成，細(xì)菌更為復(fù)雜。曲坯剛?cè)敕繒r(shí)，曲皮曲心物種組成差別較小。經(jīng)過(guò)上霉階段，曲皮與曲心中羅斯伯里氏菌屬（Romboutsia）相對(duì)豐度增大，曲心醋酸桿菌屬（Acetobacter）相對(duì)豐度迅速提高，此時(shí)曲房?jī)?nèi)能夠明顯聞到酸味。大曲繼續(xù)培養(yǎng)，毛螺菌科NK4A136（Lachnospiraceae NK4A136）群組繼續(xù)繁殖，相對(duì)豐度繼續(xù)提高。大火期，曲心中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）大量死亡，相對(duì)豐度明顯降低，取而代之的為狹義的梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、貪銅菌屬（Cupriavidus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus），其中梭菌屬代謝生成的乙醇脫氫酶是參與乙醇生成的重要酶之一[25]。由于曲皮升溫速度低于曲心，除羅斯伯里氏菌屬相對(duì)豐度提高外，其他物種組成無(wú)明顯變化。大火期結(jié)束時(shí)，曲心中耐高溫的葡萄球菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，此外還含有一定量的乳酸桿菌屬和狹義的梭菌屬等。曲皮乳酸桿菌相對(duì)豐度也明顯降低，魏斯氏菌屬（Weissella）明顯提高。大曲后火期，曲皮中魏斯氏菌屬相對(duì)豐度也處于較高水平。出房時(shí)，曲心中螺桿菌屬（Helicobacter）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，此外還含有大量的魏斯氏菌屬、葡萄球菌屬、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）、乳酸桿菌屬和短桿菌屬（Brevibacterium）。曲皮中乳酸桿菌成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，此外還含有大量貪銅菌屬、螺桿菌屬、魏斯氏菌屬、醋酸桿菌屬和鏈霉菌屬（Streptomyces）。出房混合大曲樣中乳酸桿菌屬為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種，此外還含有大量的魏斯氏菌屬、毛螺菌科NK4A136群屬和瘤胃梭菌屬（Ruminococcus），出房混合樣中細(xì)菌組成主要為桿菌屬。

2.2.2.3 物種組成熱圖

大曲培曲過(guò)程中細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成對(duì)大曲酸度、酯化力等生化性能影響較大[26-27]。圖21 為鳳型大曲培曲過(guò)程中前20的細(xì)菌組成熱圖，紅色代表該屬在該樣本中豐度較高，藍(lán)色代表該屬在該樣本中豐度較低。熱圖組成可直觀反映發(fā)酵周期與主要細(xì)菌的相關(guān)性大小。由圖21 可知，大曲培養(yǎng)0～6 d 時(shí)，細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成較為相似，此時(shí)曲坯中細(xì)菌增殖緩慢，主要為霉菌和酵母菌的生長(zhǎng)；培養(yǎng)6 d 之后大曲中細(xì)菌開(kāi)始大量增殖，多樣性增加，曲皮曲心細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成存在差異。

圖20 培曲大曲中屬水平細(xì)菌組成分布

圖21 培曲大曲中屬水平細(xì)菌組成熱圖

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究了鳳型大曲培曲過(guò)程中理化指標(biāo)變化和微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律。結(jié)果表明，培曲過(guò)程中大曲理化指標(biāo)變化與微生物群落結(jié)構(gòu)演替關(guān)系密切。曲心溫度變化呈現(xiàn)“前緩中挺后緩落”趨勢(shì)，主要是微生物生長(zhǎng)代謝釋放熱量，同時(shí)微生物對(duì)水分的利用使得曲坯中水分含量持續(xù)降低，且曲皮始終低于曲心；微生物增殖對(duì)淀粉的利用率在10%左右，曲皮消耗速率高于曲心；前期伊薩酵母的大量增殖使得曲坯酸度迅速升高，中后期酵母菌大量消亡，酸度降低；培曲過(guò)程中隨著微生物的消長(zhǎng)，大曲糖化力、發(fā)酵力波動(dòng)變化，曲皮整體高于曲心；酯化力在培曲的后期迅速升高，主要與后期細(xì)菌大量增殖有關(guān)。高通量測(cè)序結(jié)果顯示培曲大曲中細(xì)菌物種豐富度和多樣性大于真菌，曲皮細(xì)菌始終以Lactobacillus為主導(dǎo)，曲心優(yōu)勢(shì)細(xì)菌不同時(shí)期有所不同；曲皮真菌以Issatchenkia為主，曲心前期以Issatchenkia為主，后期Thermoascus迅速增殖成為優(yōu)勢(shì)菌；α-多樣性進(jìn)一步表明大曲培曲過(guò)程中不同時(shí)期、不同部位微生物豐富度和多樣性存在差異。本文通過(guò)探究鳳型大曲培曲過(guò)程中不同部位理化指標(biāo)和微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律變化，為鳳型大曲質(zhì)量把控和品質(zhì)提升奠定了理論基礎(chǔ)，將進(jìn)一步科學(xué)指導(dǎo)西鳳酒的生產(chǎn)，提升其品質(zhì)。