基于正交設(shè)計(jì)的姬松茸母種培養(yǎng)條件優(yōu)化

張琴,成文競

基于正交設(shè)計(jì)的姬松茸母種培養(yǎng)條件優(yōu)化

張琴,成文競*

上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 上海 201699

姬松茸（Murrill）是一種藥食同源食用真菌，其味道鮮美，別具香味，且其子實(shí)體內(nèi)富含多種氨基酸、脂肪、礦物質(zhì)、纖維素及微量元素等人體必需的營養(yǎng)成分，經(jīng)常食用還具有提升機(jī)體免疫力，延緩衰老等保健功效。本研究以姬松茸母種JS05為試驗(yàn)材料，考察溫度、光照、pH值和不同培養(yǎng)基對菌絲生長速度的影響，結(jié)果表明：24～30 ℃是菌株生長的最適溫度范圍，菌絲生長速度較高，其中在27 ℃條件下菌絲的生長速度最高，達(dá)到4.6 mm·d-1；當(dāng)培養(yǎng)基pH值為6時(shí)，菌絲的生長速度最高；在黑暗條件下，菌絲的生長速度較高；馬鈴薯培養(yǎng)基比玉米粉培養(yǎng)基更適合菌絲生長。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：采用加富培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為27 ℃，pH值為6的條件下，菌絲生長速度最高；pH值是影響姬松茸母種菌絲生長的最關(guān)鍵因素，在母種培養(yǎng)時(shí)應(yīng)著重加以注意。

姬松茸; 菌種培養(yǎng); 條件優(yōu)化

隨著生活水平的提高，人們越來越喜愛食用營養(yǎng)豐富，安全性好的菌菇類蔬菜。姬松茸原產(chǎn)巴西，又名巴西菇，是一種藥食同源食用真菌，其味道鮮美，別具香味，且其子實(shí)體內(nèi)富含多種氨基酸、脂肪、礦物質(zhì)、纖維素及微量元素等人體必需的營養(yǎng)成分，經(jīng)常食用還具有提升機(jī)體免疫力，延緩衰老等保健功效[1-3]。前人對姬松茸的營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行了較多研究，有很多研究都表明從姬松茸中提取的活性物質(zhì)對腫瘤有一定的防治作用，可以用于研制抗癌藥，能促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，活化產(chǎn)生刺激因子，破壞癌細(xì)胞活性，提高身體抗癌能力[4]。作為一種珍稀食藥用菌，姬松茸的發(fā)展前景十分廣闊。

姬松茸（Murrill）為真菌門，擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬，是一種草腐型、喜濕、好氧的菌類。其子實(shí)體菌蓋呈扁圓形到半球形，菌蓋表面密覆淡褐色至栗褐色纖維狀鱗片，蓋緣有菌幕的碎片；姬松茸菌肉呈白色，菌褶密布離生，菌柄圓柱形中實(shí)，菌環(huán)白色、膜質(zhì)，孢子暗褐色橢圓至球形，無芽孔，菌絲沒有鎖狀聯(lián)合[5-8]。優(yōu)良菌種是姬松茸栽培生產(chǎn)的關(guān)鍵生產(chǎn)資料，在菌種的繼代培養(yǎng)過程中，常常會出現(xiàn)菌絲生長速度減小，產(chǎn)量下降，抗逆性下降等退化現(xiàn)象，導(dǎo)致后續(xù)生產(chǎn)遭受不可避免的損失。前人對姬松茸培養(yǎng)基的篩選進(jìn)行了一些研究，但尚未系統(tǒng)對姬松茸的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究。由于常規(guī)姬松茸母種一般采用PDA培養(yǎng)基斜面保藏法，此法雖然具有簡單易行，無需專門的設(shè)備，并方便實(shí)時(shí)觀察菌種生長情況的優(yōu)點(diǎn)，但存在培養(yǎng)基不適合長期保藏菌種，易導(dǎo)致菌種的正常生理代謝途徑受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致菌種的變異或者退化的問題[9-12]。因此，優(yōu)化姬松茸母種的培養(yǎng)條件，避免母種在保存培養(yǎng)的過程中過早地發(fā)生退化或者變異的情況，有助于姬松茸生產(chǎn)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為姬松茸菌株JS05，為本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種材料，通過菌株無性分離法（即組織分離法）獲得。供試磷酸二氫鉀（KH2PO4，分析純）為天津市化學(xué)試劑六廠生產(chǎn)；硫酸鎂（MgSO4·7H2O，分析純）為天津市天河化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；供試葡萄糖、蔗糖、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等為東北制藥廠生產(chǎn)；供試馬鈴薯和玉米粉等為市售。主要采用的儀器設(shè)備有恒溫培養(yǎng)振蕩器、生化培養(yǎng)箱和光照培養(yǎng)箱等。

供試基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1000 mL，pH值自然。

1.2 方法

將姬松茸菌株JS05接種到PDA瓊脂培養(yǎng)基，室溫下純化培養(yǎng)。將純化后的菌株在室溫下活化24 h，然后接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基，在室溫下恒溫培養(yǎng)。

1.2.1 不同溫度對姬松茸菌絲生長的影響將JS05菌株接種到30 mL的PDA培養(yǎng)基上，分別在15，18，21，24，27，30，33，36 ℃條件下培養(yǎng)5 d后，考察不同培養(yǎng)溫度對姬松茸菌株生長速度的影響，每個(gè)溫度處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 不同光照條件對姬松茸菌絲生長的影響將JS05菌株接種到30 mL的PDA培養(yǎng)基上，設(shè)置光照培養(yǎng)箱的光照強(qiáng)度分別為0，5，10，15，20，25，30 lx，培養(yǎng)5 d后調(diào)查姬松茸菌絲的生長速度，考察不同光照強(qiáng)度對姬松茸菌絲生長的影響，每個(gè)光照強(qiáng)度處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 不同pH值對姬松茸菌絲生長的影響將JS05菌株接種到30 mL的PDA培養(yǎng)基上，采用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NAOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，設(shè)置培養(yǎng)基pH值分別為3，4，5，6，7，8，9和10，考察培養(yǎng)基不同pH值對姬松茸菌絲生長速度的影響，每個(gè)pH處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 不同培養(yǎng)基組成對姬松茸菌絲生長的影響 PDA瓊脂培養(yǎng)基的制作方法是將去皮馬鈴薯加水后加熱約30 min，用紗布過濾取得濾液，向?yàn)V液加入20 g瓊脂后，加熱攪拌直至瓊脂完全溶解，加水定容至1000 mL。加富PDA培養(yǎng)基的制作方法是將去皮馬鈴薯和麩皮加水后煮沸約30 min，用紗布過濾取得濾液，向?yàn)V液中加入20 g瓊脂后，加熱攪拌直至瓊脂完全溶解，最后加水定容至1000 mL。PDA綜合培養(yǎng)基的制作方法是在PDA瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中加入KH2PO4（2 g）、MgSO4·7H2O(0.5 g)。玉米粉培養(yǎng)基的制作方法是將玉米粉（80 g）、葡萄糖（20 g）、瓊脂（40 g）用2 L水加熱溶解混勻[13]。

將JS05菌株接種到30 mL供試培養(yǎng)基上，26 ℃在黑暗條件下培養(yǎng)5 d后測定菌絲長度，計(jì)算菌絲生長速度，考察不同培養(yǎng)基組成對姬松茸菌絲生長的影響，每個(gè)培養(yǎng)基處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化姬松茸母種培養(yǎng)條件根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]，考察不同培養(yǎng)溫度、pH值和培養(yǎng)基組合對姬松茸母種菌絲生長的影響，優(yōu)化姬松茸母種培養(yǎng)條件。各因素水平詳見表1。

表 1 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度對姬松茸菌絲生長的影響

由圖1可知，不同培養(yǎng)溫度條件下，姬松茸菌株的菌絲生長速度不同。24～30 ℃是菌株生長的最適溫度范圍，菌絲生長速率較高，其中在27 ℃條件下菌絲的生長速度最高，達(dá)到4.6 mm·d-1。當(dāng)培養(yǎng)溫度小于21 ℃，菌絲生長速度明顯降低，隨著培養(yǎng)溫度的降低，菌絲生長速度逐漸減小，15 ℃時(shí)，菌絲的生長速度最小。培養(yǎng)溫度超過33 ℃時(shí)，菌絲生長速度明顯降低。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對姬松茸菌絲生長的影響

2.2 不同pH值培養(yǎng)基對姬松茸菌絲生長的影響

由圖2可知，隨著培養(yǎng)基pH值的不斷增加，姬松茸菌絲生長速度呈先增加，后降低的變化趨勢。當(dāng)培養(yǎng)基pH值為6時(shí)，菌絲的生長速度最高，達(dá)到4.5mm·d-1。pH值小于5，大于7時(shí)，菌絲生長速度出現(xiàn)明顯下降。

圖 2 不同pH值對姬松茸菌絲生長的影響

2.3 不同光照條件對姬松茸菌絲生長的影響

由圖3可知，在黑暗條件下，姬松茸菌絲生長速度最快，達(dá)到4.1 mm?d-1。隨著光照強(qiáng)度的升高，姬松茸菌絲生長量呈逐漸下降的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)光照為30 lx時(shí)，姬松茸菌絲的生長速度降到1.2 mm?d-1，僅為黑暗條件下姬松茸菌絲生長速度的29%。

圖3 不同光照條件對姬松茸菌絲生長的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對姬松茸菌絲生長的影響

由表2可知，在馬鈴薯培養(yǎng)基上姬松茸母種菌絲生長較好，在玉米粉培養(yǎng)基上菌絲生長較弱。在馬鈴薯培養(yǎng)基中，PDA綜合培養(yǎng)基處理的菌絲生長速度最大，菌絲長度最長；加富PDA培養(yǎng)基處理的菌絲生長速度次之，兩者差距并不大。3個(gè)馬鈴薯培養(yǎng)基處理的菌落形態(tài)均表現(xiàn)為菌絲濃密。

表 2 不同培養(yǎng)基對姬松茸菌絲生長的影響

2.5 姬松茸母種培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析可知（表3），姬松茸母種培養(yǎng)的較優(yōu)條件組合為A2B2C2，即采用加富培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為27 ℃，pH值為6的條件下，菌絲生長速度最高。不同因素影響大小依次為：B（pH值）＞A（溫度）＞C（培養(yǎng)基）。

表 3 姬松茸母種培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論與結(jié)論

姬松茸是一種適宜生活在高溫、多濕和通風(fēng)環(huán)境中的腐生菌。姬松茸具有杏仁的香味，不僅口感脆嫩，菌柄脆、菌蓋嫩、口感極好，而且其藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值都極高，尤其是具有較強(qiáng)的抗癌作用，是一種食藥兼用的保健菇。前人研究表明，姬松茸含有至少17種常見的氨基酸，其中人體必需氨基酸占近一半。姬松茸新鮮子實(shí)體粗蛋白含量較高（54.32%，以干重計(jì)），干制后含量雖略有下降，但差異不大[15]。姬松茸中還含有人體必需的多種常量元素和微量元素，如鈣、鎂、磷和鋅、鐵、錳、銅等[16]。姬松茸提取物（ABE）通過激活ROS/JNK介導(dǎo)的線粒體途徑和抑制核因子活化而誘導(dǎo)人白血病THP-1細(xì)胞凋亡[17]。適宜的環(huán)境條件是菌種進(jìn)行正常生理代謝活動(dòng)、合成特色營養(yǎng)物質(zhì)、表現(xiàn)菌種優(yōu)良性狀的必要條件。為了保證獲得優(yōu)良菌種而進(jìn)行的母種培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，有利于姬松茸母種的母種保存以及原種和后續(xù)生產(chǎn)的順利進(jìn)行。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種適用于對試驗(yàn)結(jié)果有影響的因素較多、考察試驗(yàn)結(jié)果的指標(biāo)較多或者各因素之間互相有影響的比較復(fù)雜的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法就是用一套規(guī)格化的表（正交表）安排多個(gè)影響因素試驗(yàn)的方法，是一種簡單方便、省時(shí)省力的科學(xué)方法，在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。史紅鴿等[19]采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了香菇母種培養(yǎng)基組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)木屑、葡萄糖、瓊脂粉、馬鈴薯是香菇母種培養(yǎng)基的較優(yōu)組成。謝婷等[20]以香菇“森源16”為試驗(yàn)材料，以菌絲生物量、菌絲球密度和直徑為評價(jià)指標(biāo)項(xiàng)目，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了香菇搖瓶液體發(fā)酵工藝。嚴(yán)燕兵等[13]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出金針菇菌絲體發(fā)酵的較優(yōu)液體培養(yǎng)基組成。鄧超等[14]采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了茶樹菇深層發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，促進(jìn)了茶樹菇多糖產(chǎn)量的提升。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，24～30 ℃是姬松茸母種菌株生長的最適溫度范圍，菌絲生長速率較高，其中在27 ℃條件下菌絲的生長速度最高，達(dá)到4.6 mm?d-1。隨著培養(yǎng)基pH值的不斷增加，姬松茸菌絲生長速度呈先增加，后降低的變化趨勢。當(dāng)培養(yǎng)基pH值為6時(shí)，菌絲的生長速度最高，達(dá)到4.5mm·d-1。在黑暗條件下，姬松茸菌絲生長速度較快。馬鈴薯培養(yǎng)基是適合姬松茸母種菌絲生長的較優(yōu)培養(yǎng)基。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，采用加富培養(yǎng)基在培養(yǎng)溫度為27 ℃，pH值為6的條件下，菌絲生長速度最高；pH值是影響姬松茸母種菌絲生長的最關(guān)鍵因素，在母種培養(yǎng)時(shí)應(yīng)著重加以注意。

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Culture Conditions ofMurrill by the Orthogonal Test

ZHANG Qin, CHENG Wen-jing*

201699,

Murrill has natural edible and medicinal value. It is a kind of natural probiotics, especially in medicine. It has a good preventive and therapeutic effect on cancer and tumor. In this study, theMurrill strain JS05 was used as material, in order to investigate effects of temperature, illumination intensity, pH value and culture medium on strain growth. The results showed that 24-30 ℃ were suitable toMurrill strain，and the optimal temperature was 27 ℃ with the strain growth rate of 4.6 mm·d-1. The strain growth rate was the highest under the treatment of culture medium pH = 6. The strain grew better in the dark compared to in the light. The JS05 strain grew better in the potato culture media than that in the corn powder culture medium. The results of orthogonal experiment showed that the JS05 strain grew better in enriched PDA culture medium, when the culture temperature was 27 ℃ and the pH value was 6, resulting the maximum strain growth rate. Among the three factors, the pH value was the most important factors related to the growth ofMurrill strain JS05.

Murrill; culture; condition optimum

S646

A

1000-2324(2022)01-0029-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.01.005

2021-06-05

2021-07-29

上海市“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”農(nóng)業(yè)領(lǐng)域項(xiàng)目(20392001300)

張琴(1983-),女,碩士,講師,研究方向：蔬菜專業(yè)，植物生理生化方向. E-mail:zhangqin1260810@126.com

Author for correspondence. E-mail:chengwenjing1983@126.com