零乳糖乳酸菌發(fā)酵菌種的篩選及應(yīng)用研究

李理，余騰斐，周晴晴，柯雪琴，朱珺，林國棟，李言郡，陳蘇

（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司 浙江省食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

0 引言

酸奶和風(fēng)味發(fā)酵乳是目前乳制品市場的寵兒，因其具有良好的口感、風(fēng)味同時(shí)兼具一定促進(jìn)健康的作用，越來越受到消費(fèi)者接受和喜愛。與純奶相比，酸奶由于經(jīng)過發(fā)酵，其中20%～30%的乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖[1]，但是大多數(shù)市售的酸奶和風(fēng)味發(fā)酵乳中仍然有2.5～3.0 g/100g的乳糖，這樣的含量對于乳糖不耐人群仍然有較大風(fēng)險(xiǎn)。

我國約有70%的人患有不同程度的“乳糖不耐癥”，長期危害在兒童中易表現(xiàn)為鈣吸收不良、腹瀉、體重低下及生長發(fā)育遲緩，在老年人尤其是中老年婦女中易表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥狀[2]。低乳糖或無乳糖的乳制品是解決乳糖不耐受，增加乳品消費(fèi)的最佳解決方案。近幾年來，我國市場上涌現(xiàn)出了低或無乳糖的牛奶、酸奶都獲得了極大的成功。這些產(chǎn)品每年的銷量都以兩位數(shù)的速度增長，為企業(yè)帶來了良好的效益[1-3]。目前生產(chǎn)低或無乳糖乳制品多數(shù)采用乳糖酶水解技術(shù)，但該技術(shù)的設(shè)備和維護(hù)成本較高。與酶水解技術(shù)相比，快速且大量消耗乳糖的發(fā)酵菌種具有技術(shù)門檻低、生產(chǎn)成本少等優(yōu)勢。Kim等人[4]通過多級篩選獲得了自發(fā)突變的乳酸菌菌株，并通過菌株組合發(fā)酵獲得低乳糖和零乳糖的發(fā)酵乳。

本研究從我國西藏地區(qū)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離并篩選獲得一株能夠快速且大量消耗乳糖的德式乳桿菌保加利亞菌株。該菌株發(fā)酵所獲得的發(fā)酵乳中乳糖含量達(dá)到了《GB28050-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》中低乳糖和零乳糖的含量要求并可形成良好的感官品質(zhì)，是生產(chǎn)低/零乳糖發(fā)酵乳制品的理想菌株資源。特色發(fā)酵菌種的應(yīng)用為低乳糖或零乳糖發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)提供了新的技術(shù)路線，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

130份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，采集自我國西藏地區(qū)牧民自制發(fā)酵乳制品；MRS肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；M 17肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉、濃縮乳清蛋白，恒天然（中國）有限公司；牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸出粉，安琪酵母股份有限公司；乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma生物試劑有限公司；乙腈（色譜純），默克試劑；乳糖、精氨酸、半胱氨酸、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸二胺等，國產(chǎn)分析純試劑；番茄汁，自制。MRS、M 17固體培養(yǎng)基在肉湯中添加1.8%的技術(shù)瓊脂，MRS培養(yǎng)基用于乳酸桿菌的培養(yǎng)，M 17培養(yǎng)基用于乳酸球菌的培養(yǎng)。

恒溫培養(yǎng)箱，德國賽默飛世爾科技公司；MiniforsBacteria實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵罐，伊孚森生物技術(shù)（中國）有限公司；OptimaTMXPN超速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；Christ真空冷凍干燥機(jī)，北京博勵(lì)有限公司；1200液相色譜系統(tǒng)，安捷倫（中國）科技有限公司；Delta320p H計(jì)，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集

使用一次性無菌吸管和勺子取適量自制發(fā)酵乳制品，迅速放入已滅菌的容器內(nèi)，密封并標(biāo)號，放入低溫保溫箱中。采集后樣品于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。樣品采集信息表見?。

表1 采集樣品信息統(tǒng)計(jì)表

1.2.2 乳酸菌的分離、純化與保藏

無菌操作：1 mL或1 g樣品完全溶解于滅菌的生理鹽水中并進(jìn)行梯度稀釋。經(jīng)稀釋的樣品分別涂布于MRS和M 17固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48～72 h。觀察并記錄菌落特征。

從平板上挑取具有典型乳酸菌特征的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，將G+菌株繼續(xù)劃線于MRS和M 17固體培養(yǎng)基，直至確定為純培養(yǎng)物。將純化的菌株再次進(jìn)行革蘭氏染色并做H2O2酶試驗(yàn)。

純培養(yǎng)物分別接種于對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～24 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)2次，獲得的菌懸液加甘油作為保護(hù)劑，置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 乳酸菌的鑒定

取2 mL菌懸液至無菌EP管中后密封，冷藏寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測序鑒定。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵性能篩選

產(chǎn)酸性能測試。經(jīng)兩次傳代的菌懸液用培養(yǎng)基調(diào)整OD600至0.8，按2%（v/v）接種于100 m L滅菌復(fù)原脫脂乳中，37℃發(fā)酵12 h。冷卻至室溫，按照GB5413.34中方法檢測發(fā)酵乳中的總酸含量（以乳酸計(jì)）。

感官評價(jià)。發(fā)酵乳冷卻至室溫后，按表2中的評價(jià)指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)，由10名乳品研發(fā)人員（5男5女）對各發(fā)酵乳的風(fēng)味、口感、組織狀態(tài)、色澤進(jìn)行評價(jià)打分。每組10份樣品，評價(jià)完成后休息15 min再進(jìn)行下一組。

表2 感官評價(jià)指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[5]

1.2.5 發(fā)酵乳中乳糖含量的檢測

經(jīng)兩次傳代的菌懸液用培養(yǎng)基調(diào)整OD600至0.8，按2%（v/v）接種于100 m L滅菌復(fù)原脫脂乳中，37℃發(fā)酵12 h制備發(fā)酵乳，并按下述方法檢測其中乳糖含量。樣品前處理：準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g加入等質(zhì)量無水乙醇，震蕩30 s后，12 000 rmp低溫離心10 min，取適量上清，0.22μm濾膜過濾，-20℃?zhèn)溆?。色譜條件：液相色譜儀，Agilent 1200，色譜柱，Hypersil NH 2（4.6 mm×300 mm，5μm），流動(dòng)相，乙腈∶水=75∶25，流速，1.4 mL/min，檢測器，示差折光檢測器，洗脫時(shí)間，20 min，柱溫：30℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將乳糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的梯度濃度溶液，按照上述方法與色譜條件進(jìn)行測定。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，出峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 菌株高密度培養(yǎng)工藝優(yōu)化

1.2.6.1 碳源優(yōu)化

以乳糖為單一碳源，添加量分別為20、25、30、40、50 g/L，其他營養(yǎng)成分同MRS肉湯。經(jīng)兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于不同乳糖含量的培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵9.5 h，測定發(fā)酵液OD600和活菌數(shù)，確定乳糖的最佳添加量。

1.2.6.2 氮源優(yōu)化

前期氮源篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牛肉浸出粉、胰蛋白胨、牛骨蛋白胨對目標(biāo)菌株的生長有明顯的促進(jìn)作用，因此對這3種氮源的添加量進(jìn)行單因素優(yōu)化。

培養(yǎng)基中添加30 g/L乳糖和10 g/L胰蛋白胨，牛肉浸出粉分別添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他營養(yǎng)成分同MRS肉湯。

培養(yǎng)基中添加30 g/L乳糖和10 g/L牛肉浸出粉，胰蛋白胨分別添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他營養(yǎng)成分同MRS肉湯。

培養(yǎng)基中添加30 g/L乳糖、10 g/L牛肉浸出粉和15 g/L胰蛋白胨，牛骨蛋白胨分別添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他營養(yǎng)成分同MRS肉湯。

經(jīng)兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于不同氮源含量的培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵9.5 h，測定發(fā)酵液OD600和活菌數(shù)，確定復(fù)合氮源的最佳添加量。

1.2.6.3 生長因子優(yōu)化

前期生長因子篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，番茄汁和精氨酸對目標(biāo)菌株的生長有明顯的促進(jìn)作用，因此對這兩種生長因子的添加量進(jìn)行單因素優(yōu)化。

碳源和氮源按優(yōu)化結(jié)果添加，番茄汁分別添加0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 g/L，其他營養(yǎng)成分同MRS肉湯。

碳源和氮源按優(yōu)化結(jié)果添加，番茄汁添加1.5 g/L，精氨酸分別0.02、0.05、0.08、0.10、0.15 g/L，添加其他營養(yǎng)成分同MRS肉湯。

經(jīng)兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于不同生長因子的培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵9.5 h，測定發(fā)酵液OD600和活菌數(shù)，確定生長因子的最佳添加量。

1.2.6.4 發(fā)酵恒定p H值優(yōu)化

以優(yōu)化結(jié)果配置發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中p H值分別控制為4.8、5.0、5.2、5.5、6.0，用氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。經(jīng)兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵9.5 h，測定發(fā)酵液OD600和活菌數(shù)，確定最佳的發(fā)酵恒定p H值。

1.2.6.5 發(fā)酵恒定溫度優(yōu)化

以優(yōu)化結(jié)果配置發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵溫度分別控制為30、37、40、43℃，p H值控制為優(yōu)化結(jié)果。經(jīng)兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于培養(yǎng)基中發(fā)酵9.5 h，測定發(fā)酵液OD600和活菌數(shù)，確定最佳的發(fā)酵恒定溫度。

1.2.7 低/零乳糖發(fā)酵乳的制備

以菌株WHH 3887的凍干菌粉為直投式發(fā)酵劑，發(fā)酵基料為復(fù)原的脫脂乳，并添加適量的濃縮乳清蛋白，調(diào)整蛋白含量值≥2.9 g/100g，乳糖含量為3.22 g/100g?；辖?jīng)過剪切、均質(zhì)、分裝、巴氏殺菌處理后，冷卻至40℃左右，稱取適量凍干菌粉無菌操作接入基料中，混勻后至于40℃恒溫發(fā)酵10 h和24 h。破乳終止發(fā)酵，檢測各發(fā)酵乳的p H值、酸度、活菌數(shù)、乳糖含量，并進(jìn)行感官評價(jià)，以市售冷鏈酸奶為對照。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析

測定指標(biāo)均表示為3次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯著性分析采用軟件SPSS 17.0中的Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行，顯著水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌的分離、鑒定

從130份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中共計(jì)分離等到392株菌。經(jīng)革蘭氏染色鑒定、H2O2酶試驗(yàn)和16S rDNA序列測序后得到387株乳酸菌和5株酵母菌。乳酸菌菌株光學(xué)顯微鏡下觀察分別呈現(xiàn)球狀、鏈球狀和桿狀。部分分離菌株經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察的細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。

圖1 乳酸菌分離株革蘭氏染色顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.2 乳酸菌的發(fā)酵性能篩選

乳酸菌發(fā)酵時(shí)可以利用乳糖經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，乳酸菌產(chǎn)酸能力與菌體細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷沒的量相關(guān)[6]。因此可以根據(jù)產(chǎn)生乳酸的多少間接衡量菌株對乳糖的利用情況。對387株乳酸菌在復(fù)原脫脂乳發(fā)酵12 h后的總酸含量進(jìn)行測定，同時(shí)對發(fā)酵乳的感官品質(zhì)進(jìn)行評價(jià)打分。結(jié)果顯示，387株乳酸菌中有26株乳酸菌發(fā)酵后所得發(fā)酵乳的總酸含量≥10.0 g/L（以乳酸計(jì)）且感官評價(jià)打分高于80分，說明這些菌株對乳糖的利用較好，同時(shí)能夠形成良好的發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，結(jié)果表3所示。

表3 發(fā)酵性能較優(yōu)的乳酸菌發(fā)酵乳的酸度及感官評價(jià)

（續(xù)表3）

2.3 乳酸菌消耗乳糖的能力篩選

對初篩得到的26株乳酸菌37℃發(fā)酵復(fù)原脫脂乳12 h后所得發(fā)酵乳中的乳糖含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示。

表4 26株乳酸菌發(fā)酵乳中乳糖含量

由表4可以看出，菌株WHH 3887經(jīng)發(fā)酵后乳糖殘留量最低，僅為1.41±0.02 g/100g，達(dá)到了GB28050-2011中對低乳糖乳制品中乳糖含量的限制要求。伍桃英[7]采用不同型號的乳糖酶水解乳糖制備低乳糖乳品中乳糖的含量為0.696 g/100g，該結(jié)果說明菌株WHH 3887作為生產(chǎn)低乳糖的發(fā)酵乳制品是非常有潛力的。

2.4 菌株WHH3887的高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.4.1 碳源、氮源優(yōu)化

培養(yǎng)基中的碳源、氮源種類和添加量是影響菌株生長的重要因素，同時(shí)有研究報(bào)道指出[2]，乳糖酶作為一種誘導(dǎo)酶，底物的存在會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)。以乳糖作為菌株3887發(fā)酵的單一碳源，考察不同添加量對其生長的影響，結(jié)果如圖2(a)所示。當(dāng)乳糖為單一碳源時(shí)，隨添加量逐漸增加，菌株WHH 3887菌懸液的OD值和活菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)添加量為30 g/L，OD值和活菌數(shù)均達(dá)到最高，且顯著高于其他添加濃度（P＜0.05），因此，后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)乳糖的添加量為30 g/L。

以單因素實(shí)驗(yàn)考察菌株WHH 3887高密度發(fā)酵的最佳復(fù)合氮源，結(jié)果如圖2(b)～2(d)所示。牛肉浸出粉的添加量為10 g/L和15 g/L時(shí)，菌懸液的OD值和活菌數(shù)較高，差別不顯著（P=0.083），繼續(xù)增加反而下降。胰蛋白胨和牛骨蛋白對影響菌體生長情況與牛肉浸出粉的影響相似，添加量分別為為15 g/L和20 g/L時(shí)，菌株的生長最好，且顯著優(yōu)于其他添加濃度（P＜0.05）。綜合優(yōu)化結(jié)果和生產(chǎn)成本，菌株WHH 3887高密度發(fā)酵的復(fù)合氮源為牛肉浸出粉10 g/L、胰蛋白胨15 g/L、牛骨蛋白胨為20 g/L。經(jīng)過碳源和氮源的優(yōu)化后，發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到了8.9×108CFU/m L，較優(yōu)化前提高了4.63倍。

圖2 菌株WHH3887碳源、氮源添加量優(yōu)化

2.4.2 生長因子優(yōu)化

經(jīng)過碳源和氮源的優(yōu)化，菌株WHH 3887的生長有所改善。根據(jù)前期生長因子的篩選結(jié)果，對番茄汁和精氨酸的添加量進(jìn)行優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)添加番茄汁1.5 g/L和精氨酸0.1g/L的效果最優(yōu)圖3(a)和3(b)。李佳[8]的研究指出，1%的番茄汁對保加利亞乳桿菌LB5的生長有明顯的促進(jìn)作用；侯聚敏[9]也指出番茄汁可以促進(jìn)乳酸菌的增殖。

圖3 菌株WHH3887生長因子優(yōu)化

2.4.3 恒定p H值、培養(yǎng)溫度優(yōu)化

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株WHH 3887在培養(yǎng)時(shí)控制p H和不控制p H值的生長情況差別顯著，這是由于乳桿菌在培養(yǎng)過程中大量產(chǎn)酸，從而會(huì)對菌體的生長產(chǎn)生抑制。本研究中，不控制pH值時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)僅為7.35×108CFU/mL，p H值控制為5.5時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)顯著提高到1.37×109CFU/mL（圖4a）。黃良昌等[10]通過研究發(fā)現(xiàn)了控制p H值為5.8時(shí)，培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)也較未控制p H值時(shí)有顯著的提高。

保加利亞乳桿菌屬于嗜溫乳酸菌，優(yōu)化溫度范圍選擇30～43℃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30℃和43℃時(shí)菌株的生長明顯受到抑制，40℃最佳且差異極顯著（P≤0.01），活菌數(shù)最高達(dá)到1.89×109CFU/mL（圖4b）。

圖4 不同pH值和培養(yǎng)溫度對菌株3887生長的影響

經(jīng)過碳源、氮源、生長因子、發(fā)酵條件等一系列關(guān)鍵工藝條件的優(yōu)化，菌株WHH 3887的發(fā)酵液活菌數(shù)由初始的1.92×108CFU/mL提高到了1.89×109CFU，培養(yǎng)優(yōu)化效果顯著。

2.5 低/零乳糖發(fā)酵乳制備及穩(wěn)定性跟蹤

按照優(yōu)化工藝對菌株WHH 3887進(jìn)行高密度培養(yǎng)并制備凍干菌粉，作為發(fā)酵劑使用。分別發(fā)酵10 h和24 h后終止發(fā)酵，得到的發(fā)酵乳10℃后熟12 h，進(jìn)行測試，結(jié)果如表5所示。

由表5中結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，使用菌株WHH 3887制備的發(fā)酵乳在pH值、酸度、活菌數(shù)和感官評分方面的指標(biāo)與3份市售發(fā)酵乳基本一致，其中使用菌株WHH 3887自制的發(fā)酵乳比市售酸奶的活菌數(shù)高，但發(fā)酵24 h后的酸度明顯偏高，從而影響了口感，導(dǎo)致感官評分較低。乳糖含量方面，3份市售酸奶的乳糖含量均在3%左右，而采用菌株WHH 3887制備的發(fā)酵乳，發(fā)酵10 h后，乳糖含量為1.83 g/100 g，達(dá)到了國標(biāo)GB28050-2011中低乳糖含量的宣稱，繼續(xù)發(fā)酵24 h，乳糖含量進(jìn)一步下降至0.44 g/100 g，達(dá)到了國標(biāo)GB28050-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》中零乳糖含量的宣稱。

表5 不同發(fā)酵乳樣品測試指標(biāo)

3 結(jié)論

本研究經(jīng)過發(fā)酵性能初篩和乳糖消耗能力復(fù)篩，獲得一株能夠良好發(fā)酵牛乳同時(shí)大量消耗乳糖的乳酸菌，經(jīng)過鑒定該菌株為德式乳桿菌保加利亞亞種，并命名為WHH 3887。經(jīng)過碳源、氮源、生長因子及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，菌株3887的活菌數(shù)顯著提高，經(jīng)優(yōu)化后發(fā)酵液的活菌數(shù)可達(dá)到1.89×109CFU/mL，經(jīng)冷凍干燥后菌粉的活菌數(shù)達(dá)到了1.93×1011CFU/g。以凍干粉為直投式發(fā)酵劑制備的發(fā)酵乳，發(fā)酵10 h后乳糖含量為1.83 g/100 g，發(fā)酵24 h后乳糖含量為0.44 g/100 g，分別達(dá)到了國標(biāo)GB28050-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》中零乳糖含量的宣稱。同時(shí)，發(fā)酵乳在PH值、酸度、活菌數(shù)和感官品質(zhì)方面與市售的冷鏈酸奶基本一致，說明該菌株是生產(chǎn)低乳糖或零乳糖發(fā)酵乳制品的理想發(fā)酵菌種。后期研究可將菌株WHH 3887與嗜熱鏈球菌或乳酸乳球菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，以改善零乳糖發(fā)酵乳酸度較高的問題，提升特色發(fā)酵劑菌株的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。