雙蛋白酶解法制備低抗原性乳清蛋白肽及其抗氧化性能研究

閆蓉蓉，張兆中，李書國(guó)

（河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，石家莊 050018）

0 引言

乳清蛋白作為乳品工業(yè)中最重要的一種副產(chǎn)物，其主要成分α-乳白蛋白（α-LA）和β-乳球蛋白（β-LG）會(huì)引發(fā)2歲以下的兒童出現(xiàn)牛乳蛋白過(guò)敏現(xiàn)象，嚴(yán)重阻礙了嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育與生命安全，且嬰幼兒中牛乳蛋白過(guò)敏的發(fā)病率逐年上升[1-3]。而乳清蛋白有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中生產(chǎn)增值營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，因此對(duì)于乳清蛋白的研究是很有必要的。目前脫敏技術(shù)主要有熱處理、輻照處理、糖基化修飾以及酶法水解等方法[4]，其中蛋白酶解能得到一些具有降血壓、降血糖、抗氧化和抗菌功能的肽段[5-6]。采用酶解法處理乳清蛋白，不僅可以減控原料中致敏蛋白含量，也可制備一些功能性肽段。

本文以乳清蛋白粉為原料，通過(guò)復(fù)合酶解工藝、將酶解產(chǎn)物超濾分離制備低抗原性和高抗氧化活性的乳清蛋白肽段，主要采用響應(yīng)面法對(duì)影響低抗原性、高抗氧化活性肽酶解的雙蛋白酶復(fù)配比例、p H值、酶解溫度、時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化，以期對(duì)低抗原性乳制品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

堿性蛋白酶Al kaline（200 000 U/g）、中性蛋白酶Dispase（60 000 U/g）、胰 蛋 白 酶Trypsin 1∶250（250 000 U/g）、木瓜蛋白酶Papain（800 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme（30 000 U/g）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；WPC80 HS濃縮乳清蛋白粉，德國(guó)WHEYCO；鐵氰化鉀，天津市博迪化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（分析純），梯希海（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；無(wú)水乙醇（分析純），天津市富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸（分析純），天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯化鐵、三氯乙酸均為分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S6型恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-B恒溫水浴振蕩器，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司，F(xiàn)RESCO 21冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛爾公司；TGL-16C高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；UV-5500PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；MSC300超濾杯，上海摩速科學(xué)器材有限公司；ST 2100型pH計(jì)，奧豪斯儀器（常州）有限公司；96孔可拆酶標(biāo)板，美國(guó)康寧；氮?dú)鉁p壓器，上海興立電器儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 水解乳清蛋白

單酶水解工藝流程：配制50 g/L的乳清蛋白溶液，于80℃下攪拌15 min，用1.0 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至水解酶所需p H值后，通過(guò)水浴振蕩進(jìn)行酶解反應(yīng)（期間維持反應(yīng)體系pH恒定），然后在95℃下保持10 min以滅酶，再用離心機(jī)以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心15 min，最后取上清液備用。

分步復(fù)合水解工藝：第一步酶解結(jié)束后立即滅酶，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系p H值并將溫度降至第二步水解酶的最適溫度，繼續(xù)水浴振蕩酶解，結(jié)束后滅酶分離取上清備用。

1.3.2 水解度的測(cè)定根據(jù)消耗的堿液量計(jì)算水解度[7]，即：

式中:B為NaOH體積，mL；M為NaOH濃度，mol/L；α為解離系數(shù)；Mp底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g；對(duì)于乳清蛋白htot取8.8 mmol/g。

1.3.3 抗原抑制率的測(cè)定

采用ic-ELISA法測(cè)定乳清蛋白的抗原抑制率，即把包被抗原稀釋到一定的質(zhì)量濃度，以每孔100μL包被96孔酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜放置12 h，次日傾倒孔內(nèi)液體，加入150μL洗滌液PBST震蕩洗滌4次，每次不少于2 min，垂直甩干板內(nèi)洗滌液。按每孔100μL加1%BSA封閉液，37℃下封閉1 h，棄封閉液，PBST洗滌4次，垂直甩干板內(nèi)洗滌液。用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋?duì)?LG和α-LA，并與一定稀釋度的抗血清溶液均勻混合，檢測(cè)樣品以每孔100μL加入酶標(biāo)板，37℃反應(yīng)1.5 h，傾倒孔內(nèi)液體，PBST洗滌4次，垂直甩干板內(nèi)洗滌液。加入羊抗兔IgG辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體，每孔100μL，37℃反應(yīng)1 h，傾倒孔內(nèi)液體，PBST洗滌4次并甩干。加入新鮮預(yù)混的TMB雙組分顯色液，每孔100μL，37℃反應(yīng)10 min后，每孔加入50μL的2 mol/L H2SO4終止液終止反應(yīng)。

采用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)測(cè)定各孔的OD450和OD620值，實(shí)際OD=OD450-OD620；

樣品中抗原性大小通常用抗原抑制率表示[8]，本文理解為待測(cè)樣品中的β-LG和α-LA抑制酶標(biāo)板中的抗血清與包被在酶標(biāo)板上的蛋白結(jié)合能力的大小。抑制率越小，表明樣品中β-LG和α-LA含量越少，見式（2）：

式中：OD為被測(cè)樣品的吸光值；OD0為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)體系的吸光值。

1.3.4 抗氧化性測(cè)定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率計(jì)算參考文獻(xiàn)[9]并做一些改動(dòng)。配制濃度為1×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，4℃保存?zhèn)溆?。移? mL乳清蛋白酶解液與2 mL DPPH溶液于試管中震蕩混勻，即樣品組；再取2 mL乳清蛋白酶解液和2 m L蒸餾水混合均勻，即對(duì)照組；最后移取2 mL DPPH溶液和2 mL無(wú)水乙醇溶液混勻，即空白組；將3組試管放置常溫下避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm測(cè)定對(duì)應(yīng)吸光值，計(jì)算公式為

式中：Ai為樣品組吸光值；Aj為對(duì)照組吸光值；A0為空白組吸光值。

1.3.4.2 還原力測(cè)定

參照韓雪蘭測(cè)定方法[10]并做少許改動(dòng)。測(cè)定前配制濃度0.2 mol/L（pH值為6.6）的磷酸緩沖溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液，體積分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液。移取1 m L乳清蛋白酶解液和1 mL蒸餾水于2個(gè)試管，設(shè)置一組空白，分別加入2.5 m L磷酸緩沖溶液和2.5 mL鐵氰化鉀溶液震蕩混勻，50℃恒溫水浴20 min，迅速冷卻至室溫后，再次向2個(gè)試管中加入2.5 m L體積分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸，混勻后轉(zhuǎn)速為5 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，再分別加入2.5 mL蒸餾水與0.5 mL的FeCl3溶液，混勻靜置10 min，波長(zhǎng)700 nm讀數(shù)，樣品組減去空白組讀數(shù)即為還原力。

1.3.5 蛋白酶的篩選

在乳清蛋白溶液中分別加入堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，在合適的酶解條件下水解3 h，計(jì)算每種酶的水解度，并測(cè)定酶解產(chǎn)物的抗原性大小和抗氧化能力，綜合選擇一個(gè)最適蛋白酶作為兩步復(fù)合酶解的第一步酶。

1.3.6 蛋白酶組合的選擇

將確定的第一步水解酶與其余4種酶以相同酶活比復(fù)配后繼續(xù)酶解乳清蛋白溶液，測(cè)定每個(gè)組合的水解度、抗原抑制率、DPPH自由基清除率和還原力，通過(guò)比較4個(gè)組合的水解效率及其功能性，選擇最優(yōu)一組為復(fù)合蛋白酶組合。

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

確定好最優(yōu)蛋白酶組合后，選擇雙酶復(fù)配比例、底物濃度、酶解溫度、酶解p H、酶解時(shí)間為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。其中，雙酶復(fù)配比設(shè)置為1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為3%、5%、7%、9%和11%，酶解溫度設(shè)定為40、45、50、55、60℃，酶解p H值設(shè)定為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,酶解時(shí)間設(shè)定為10，20，30，40，50，60 min。

1.3.8 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，雙酶復(fù)配比、酶解溫度與酶解p H對(duì)水解度的影響最顯著，而DPPH自由基清除率和還原力都能表示乳清蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，由圖2、圖3可知，DPPH自由基清除率可以更明顯地表達(dá)出乳清蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性，因此按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選擇雙酶的復(fù)配比、第二步蛋白酶的酶解溫度和p H值得3個(gè)因素為自變量，分別以抗原抑制率和DPPH自由基清除率為檢測(cè)指標(biāo)，采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

圖1 不同反應(yīng)條件對(duì)水解度的影響

圖2 不同蛋白酶對(duì)酶解產(chǎn)物功能性的影響

表1 兩步酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

圖3 不同蛋白酶組合對(duì)酶解產(chǎn)物功能性的影響

1.3.9 乳清蛋白酶解液的分離純化

選取3、5、10 ku 3個(gè)不同分子截留量超濾膜，采用超濾杯分離純化乳清蛋白酶解產(chǎn)物，得到不同分子量范圍的肽段，進(jìn)而分析各個(gè)肽段的抗原性和抗氧化能力。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

水解度可直接反映了乳清蛋白的水解程度，故可作為篩選最佳水解蛋白酶的一個(gè)直觀指標(biāo)。圖4為5種蛋白酶分別水解乳清蛋白的水解度變化，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。其中Alkaline和Dispase在2 h內(nèi)漲幅較大，Trypsin和Papain增長(zhǎng)較為緩慢。Alkaline作用底物范圍廣泛，因此其水解效率相較其余4種酶最高，3 h后可達(dá)到28.85%。Dispase水解度略低于Alkaline，而Flavourzyme、Trypsin和Papain作用范圍更小，只能水解一些特定氨基酸的羧基，故水解效率相對(duì)較低。

圖4 不同蛋白酶對(duì)乳清蛋白水解度的影響

除此之外，乳清蛋白酶解產(chǎn)物的抗原性以及抗氧化性也可間接反映蛋白酶的水解效率?？乖种坡士杀硎緲悠房乖缘拇笮。瑑烧叱收汝P(guān)系。如圖2所示，水解度較高的酶的水解產(chǎn)物抑制率也較小，因此Alkaline水解后的樣品抑制率最低，僅為15.4%，其次是Flavourzyme和Dispase，Trypsin和Papain的水解效率較低，裂解抗原表位能力有限，故兩者抗原抑制率都較大。

本文通過(guò)DPPH自由基清除率和還原力來(lái)表征乳清蛋白肽的抗氧化能力，這兩者數(shù)值越大表明酶解肽段的抗氧化活性越大。圖2中，Alkaline的水解后產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和還原力最大，Papain的最小，表明水解度越大，其DPPH自由基清除率和還原力也越大，反之亦然。這可能是由于水解過(guò)程中釋放了較多的氨基酸殘基、寡肽和多肽，提高了自由基清除活性和還原能力。綜合考慮水解度和抗原抑制率以及抗氧化活性這3個(gè)指標(biāo)，Alkaline的水解效率最高，作用底物更廣泛，水解產(chǎn)物抗原性最小，抗氧化活性最高，因此選擇Alkaline為分步復(fù)合酶解的第一步水解酶。

2.2 復(fù)合酶組合的確定

分步復(fù)合酶解法相較一步復(fù)合酶解法可以更好地發(fā)揮每種酶的水解特異性，達(dá)到更高的水解效率，而一步復(fù)合水解難以保證兩種酶的最適酶解條件。因此將Alkaline分別與Dispase、Trypsin、Papain和Flavourzyme復(fù)配，由于堿性蛋白酶水解2 h后水解度變化緩慢，為了在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到更好的水解效果，將Alkaline水解2 h后立即滅酶并加入另外一種蛋白酶繼續(xù)水解。

如圖3和圖5所示，經(jīng)分步酶解法水解乳清蛋白的水解度相較單酶水解度都明顯提高，同時(shí)酶解產(chǎn)物的抗原抑制率下降，抗氧化活性提高。其中Alkaline+Flavourzyme組合后水解度高達(dá)32.0%，DPPH自由基清除率和還原力也是達(dá)到4種組合中的最大值，而抗原抑制率低至12.17%，Alkaline+Dispase組合后水解度也有30.80%，抑制率僅有12.09%，DPPH自由基清除率和還原力與Alkaline+Flavourzyme組合相差甚微。其余兩種組合的水解效率以及功能性遠(yuǎn)不及前兩種。Dispase與Alkaline都屬于內(nèi)肽酶，酶解后易形成小分子的苦味肽[11]，而Flavourzyme屬內(nèi)、外肽酶，外肽酶可以有效切除疏水性氨基酸，使肽的苦味明顯下降[12]。因此綜合考慮酶解效率、酶解產(chǎn)物的抗原性、抗氧化活性以及滋味，最終選取Alkaline為第一步水解酶，F(xiàn)lavourzyme為第二步水解酶。

圖5 不同蛋白酶組合對(duì)乳清蛋白水解度的影響

2.3 不同反應(yīng)條件對(duì)水解度的影響

為了得到低抗原性和高抗氧化活性的乳清蛋白肽，在Alkaline和Flavourzyme組合的基礎(chǔ)上進(jìn)行單因素試驗(yàn)，由于加入第二步水解酶后，其酶解產(chǎn)物功能性變化較大，因此本文主要控制第二種水解酶的單因素條件。

（1）雙酶復(fù)配比對(duì)水解度的影響：復(fù)合水解中兩種酶的復(fù)配比例對(duì)水解效率有一定影響，由圖1（a）可得，隨著復(fù)配比例增加，水解度呈先增大后減小趨勢(shì)。當(dāng)Alkaline和Flavourzyme酶活比為1∶0.8時(shí)，水解度達(dá)到最大，此時(shí)酶與底物充分反應(yīng)，達(dá)到最高的酶解效率，但隨著Flavourzyme加酶量的增加，酶解達(dá)到飽和，水解度降低，酶解效率也隨之下降。故選擇1∶0.8為Alkaline和Flavourzyme最佳復(fù)配比例。

（2）底物濃度對(duì)水解度的影響：底物濃度反映了原料中乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從圖1（b）可得到，在加酶量固定后，底物濃度較低時(shí)，酶解速率隨著濃度增大而急劇上升，底物濃度達(dá)到5%后水解度最大。但隨著底物濃度繼續(xù)增加，水解度基本保持不變，說(shuō)明酶與底物反應(yīng)達(dá)到飽和，不再反應(yīng)，因此選擇5%為最佳底物濃度。

（3）溫度對(duì)水解度的影響：如圖1（c）所示，隨著酶解溫度的升高，水解度先緩慢增加再急劇增加最后緩慢下降。在較低溫度時(shí)，酶活性較低，水解底物速率較慢。當(dāng)溫度上升55℃時(shí)，水解度迅速達(dá)到最高，此時(shí)酶活達(dá)到最大。繼續(xù)升高溫度會(huì)抑制酶的活性，導(dǎo)致水解效率降低。因此選擇55℃為Flavourzyme最佳水解溫度。

（4）p H值對(duì)水解度的影響：酶解過(guò)程中pH值對(duì)水解度也有較大的影響，由圖1（d）可得，水解度隨著溶液p H值增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，表明過(guò)酸或過(guò)堿可導(dǎo)致Flavourzyme活性降低，底物蛋白質(zhì)水解不完全。當(dāng)p H值為7.5時(shí)，水解度為30.44%達(dá)到最大，因此第二步水解過(guò)程中選擇7.5作為最佳酶解p H值。

（5）酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響：如圖1（e）所示，前20 min內(nèi)底物被酶快速催化，水解度迅速增大，隨著時(shí)間的增加，水解度變化緩慢。當(dāng)30 min以后，底物與酶反應(yīng)基本飽和，水解度變化甚微，為了加快整個(gè)酶解反應(yīng)進(jìn)程，選擇酶解時(shí)間為30 min。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，底物濃度和酶解時(shí)間在乳清蛋白水解過(guò)程中變化相對(duì)比較穩(wěn)定，故固定底物濃度為5%，酶解時(shí)間為30 min，選擇對(duì)乳清蛋白酶解影響較大的三個(gè)因素：復(fù)配比（A）、溫度（B）、p H值（C）為評(píng)價(jià)因素，根據(jù)2.1和2.2中篩選結(jié)果表明，酶解后的乳清蛋白肽的DPPH自由基清除率和還原力呈現(xiàn)正相關(guān)，因此選擇其一作為響應(yīng)面試驗(yàn)中抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)即可，故分別以抗原抑制率（Y1）和DPPH自由基清除率（Y2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 乳清蛋白酶解液的抗原性

以抗原抑制率指標(biāo)建立二次響應(yīng)面模型Y=11.50.9550A+1.19B+1.01C-0.4375AB+0.6125AC-0.1950C-0.1690A2+2.25B2+0.9535C2，回歸與方差分析結(jié)果如表3所示。

從表3得到該模型回歸極其顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著，且該模型R2=0.9871，R2Adj=0.9705，說(shuō)明該模型具有較好的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，可較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中雙酶復(fù)配比（A）、酶解溫度（B）、酶解p H（C）極顯著；二次項(xiàng)B2極顯著，C2顯著；交互項(xiàng)AB、AC顯著。由響應(yīng)曲面圖6分析可得，隨著各因素水平的升高或增大，乳清蛋白肽的抗原抑制率均呈現(xiàn)先減小后增大的變化特征。a、c圖中溫度等差線相比復(fù)配比和p H更加密集，表明溫度對(duì)抗原抑制率影響相比另外兩個(gè)因素更加顯著，并且與表3中F值大小得到影響抗原抑制率的各因素主次順序一致。

圖6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)各因素對(duì)抗原抑制率的影響

表3 抗原抑制率方差分析結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，回歸模型預(yù)測(cè)Al kaline和Flavourzyme復(fù)合后最佳酶解條件在復(fù)配比例1∶1，酶解溫度53.98℃，p H值7.06下酶解，乳清蛋白肽的抗原抑制率僅僅為9.63%。在此條件下酶解進(jìn)行驗(yàn)證，為保證試驗(yàn)可操作性，將酶解溫度設(shè)為54℃，p H值調(diào)至7.1，水解后檢測(cè)產(chǎn)物的抗原抑制率為10.02%。

2.4.2 低抗原性乳清蛋白溶液抗氧化活性

通過(guò)數(shù)據(jù)分析，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)建立二次響應(yīng)面模型為Y=70.19+0.3463A-3.29B-4.54C-0.1500AB-0.4675AC-2.82BC-2.78A2-0.8418B2-4.30C2，回歸與方差分析結(jié)和曲面圖如表4。

表4 DPPH自由基清除率方差分析

由表4得出該模型回歸極其顯著（P＜0.0001），R2=0.9880，R2Adj=0.9725，表明該模型可較好地對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)酶解溫度（B）和酶解p H（C）極顯著；二次項(xiàng)C2極顯著，A2顯著；交互項(xiàng)BC顯著，根據(jù)F值大小得到影響DPPH自由基清除率的各因素主次順序?yàn)閜 H（C）＞溫度（B）＞復(fù)配比（A）。通過(guò)圖7中3組響應(yīng)面及等高線的形狀分析，a、b中溫度和pH值等差線相比復(fù)配比更加密集，表明這兩者相較復(fù)配比對(duì)DPPH自由基清除率影響更大。同時(shí)響應(yīng)曲面越陡峭，等高線越偏向橢圓，表明兩因素交互作用越顯著，因此交互項(xiàng)BC對(duì)DPPH自由基清除率具有顯著性。

圖7 各因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響

針對(duì)DPPH自由基清除率回歸模型預(yù)測(cè)最佳酶解工藝條件是復(fù)配比1∶0.8，溫度50℃，pH值7.40，并且DPPH自由基清除率可達(dá)到72.84%。在此條件下平行實(shí)驗(yàn)3次驗(yàn)證，得到乳清蛋白肽段的DPPH自由基清除率為71.69%，兩者相對(duì)誤差僅有1.58%。

2.5 不同分子量乳清蛋白肽段的功能性

通過(guò)不同截流量的超濾膜分離乳清蛋白肽，得到小于3 ku，3～5 ku，5～10 ku和大于10 ku的4種肽段并測(cè)其功能性，其中抗原性大小和抗氧化活性分別在其最優(yōu)酶解條件下酶解得到的水解產(chǎn)物中測(cè)定。

如圖8所示，不同分子量范圍的乳清蛋白肽的抗原抑制率相差甚大，其中分子量越小，抗原抑制率越小，反之亦然。當(dāng)分子質(zhì)量小于3 000 u，此時(shí)抗原抑制率僅有7.44%，而分子質(zhì)量大于10 000 u時(shí)，抑制率可高達(dá)70.0%。這說(shuō)明大分子量乳清蛋白肽段仍然存在較多的抗原表位，而分子量較小的酶解產(chǎn)物中氨基酸和短肽鏈居多，抗原表位較少，因此抗原抑制率較低。

圖8 不同分子質(zhì)量肽段的抗原抑制率

如圖9所示，分子質(zhì)量越小的肽段抗氧化能力越強(qiáng)，小于3 ku的肽段DPPH自由基清除率和還原力都達(dá)到最大。此前有研究證明，分子量小于3 ku的多肽具有較高的抗氧化活性，更有效的清除HO·自由基[6]。這是由于分子量較小的肽段中暴露了較多的氨基酸殘基從而終止自由基鏈反應(yīng)，進(jìn)而提高了清除自由基活力，而還原能力也可能是小分子質(zhì)量肽段中存在較多的抗氧化活性多肽，因此表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性。

圖9 不同分子質(zhì)量肽段的抗氧化活性

3 結(jié)束語(yǔ)

本文主要研究了復(fù)合酶法水解乳清蛋白工藝并獲得低抗原性和高抗氧化活性肽段的方法。以水解度、抗原性和抗氧化活性為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察酶解溫度、加酶量、酶解p H值、雙酶復(fù)配比的影響，在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)乳清蛋白低抗原性肽的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，復(fù)配比為1∶1，酶解溫度為54℃，p H值為7.1的條件下水解時(shí)，水解產(chǎn)物抗原抑制率最低；當(dāng)復(fù)配比為1∶0.8，溫度50℃，pH值7.40條件下水解時(shí)，DPPH自由基清除率最高，并得出乳清蛋白肽分子量越小，其抗原性越低，抗氧化能力越強(qiáng)的結(jié)論。本文提出的雙蛋白酶酶解法可有效降低乳清蛋白中地抗原性，并獲得低抗原性和高抗氧化活性的乳清蛋白肽，可為后期低過(guò)敏性功能性乳制品開發(fā)應(yīng)用提供一種思路。