骨康方君臣佐使藥治療骨質(zhì)疏松藥理機制探討

梁倩欣 董家銘 謝曼琳 鄒艷芳 涂興明,2 趙可偉,2*

1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006

2.廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨量低下，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加的疾病[1]。隨著世界人口的老齡化，OP發(fā)病率逐年上升，骨折是其導(dǎo)致的嚴重后果，給人民的健康帶來巨大傷害。目前臨床上治療OP的藥物以鈣劑和雌激素類藥物等為主，具有一定的臨床療效但有副作用不宜長期服用[2]。而中藥具有良好的臨床診療效果，并且其來源廣泛、成本低廉和不良反應(yīng)較小，實驗研究也表明中藥可提高骨密度，緩解疼痛等癥狀，在治療OP方面具有獨特的優(yōu)勢。

方劑是由多種中藥組成，具有多成分、多靶點的特點，不同中藥的配伍有著不同的功效，目前大多數(shù)的研究方法仍是選取某個中藥或成分進行研究，不能精準解釋方劑發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)及組方規(guī)律等問題[3]，而網(wǎng)絡(luò)藥理學的出現(xiàn)，可作為疾病與中藥方劑之間的橋梁，整體、系統(tǒng)地對方劑進行研究。方劑配伍組成的基本原則是君臣佐使，因此君臣佐使各藥物的配伍決定方劑治療及作用的方向。我院經(jīng)驗方骨康方，在臨床上可顯著緩解OP患者腰腿痛及腎陽虛癥狀，并且已有研究[4]證明骨康方具有抑制骨吸收和促進骨形成的雙重作用。骨康方中君藥(補骨脂)、臣藥(淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子和白芍)、佐藥(黃芪、丹參和當歸)和使藥(大棗)，據(jù)文獻檢索可知已有部分單味藥的機制研究，但骨康方藥整體的靶點機制異同并未進行系統(tǒng)研究。因此，本研究主要通過網(wǎng)絡(luò)藥理學來探討骨康方藥治療OP相關(guān)靶點及通路的異同，為深入研究骨康方中君臣佐使各藥組成的具體意義奠定堅實的基礎(chǔ)，同時也可為尋找骨康方的最佳組成提供參考的方向。

1 材料和方法

1.1 藥物活性成分及潛在靶點的篩選

通過中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)獲得骨康方君藥(補骨脂)的成分，使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)篩選其活性成分及其靶點(OB≥30%、DL≥0.18)；在TCMSP以相同條件分別篩選臣藥(淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子和白芍)、佐藥(黃芪、丹參和當歸)和使藥(大棗)的活性成分及其靶點；同時，通過文獻檢索補充不在篩選納入范圍內(nèi)但已有研究表明對OP有明確療效的活性成分及靶點。通過uniprot (2020年8月3日更新)進行Gene symbol的轉(zhuǎn)化，刪除非人類及無數(shù)據(jù)靶點。使用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2 OP靶點的獲取

分別在OMIM(2020年9月15日更新)、 TTD (2020年6月1日更新)以及DisGeNET (version:7.0)數(shù)據(jù)庫檢索疾病關(guān)鍵詞“Osteoporosis”，得到相應(yīng)的靶點，匯總?cè)齻€數(shù)據(jù)庫的靶點，去除重復(fù)靶點，得到OP靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 中藥-疾病交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

通過Venny 2.1將中藥靶點和疾病靶點進行比對，分別篩選君藥-OP交集靶點、臣藥-OP交集靶點、佐藥-OP交集靶點和使藥-OP交集靶點。利用STRING(version 11.0)分析交集基因間的相互作用，設(shè)置置信度>0.9并隱藏游離單結(jié)點，分別構(gòu)建交集靶點之間的PPI。

1.4 中藥-疾病關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

將PPI導(dǎo)入Cytoscape，分別以degree、closeness和betweenness分析PPI網(wǎng)絡(luò)，取其大于或等于中位數(shù)部分的交集，即為中藥-疾病的關(guān)鍵靶點，其中君藥的關(guān)鍵靶點不做篩選。使用David(version:6.8)對君臣佐使的關(guān)鍵靶點進行KEGG 通路分析，去除非骨相關(guān)的具體疾病名稱相關(guān)通路，使用Venny 2.1軟件對關(guān)鍵靶點的KEGG通路結(jié)果進行交集。取P<0.05為顯著富集的閾值，在R語言中使用ggplot2軟件進行處理。結(jié)果按P值大小順序排列，取前24的結(jié)果，氣泡大小代表通路的基因數(shù)量，P值代表富集的顯著程度。

2 結(jié)果

2.1 骨康方中藥的活性成分及作用靶點

通過數(shù)據(jù)庫和文獻檢索分別篩選得到君藥的活性成分4個，潛在靶點40個；臣藥的成分40個，靶點254個；佐藥的成分75個，靶點242個；使藥的成分19個，靶點202個。見圖1。

2.2 骨康方中藥-OP的交集靶點

通過數(shù)據(jù)庫對OP進行檢索，其中OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得42個OP靶點，TTD數(shù)據(jù)庫34個，DisGeNET數(shù)據(jù)庫1 098個，匯總?cè)ブ睾蠊驳玫絆P靶點1 152個。分別將骨康方中藥的潛在靶點與OP靶點進行交集，獲得君藥-OP的交集靶點12個、臣藥87個、佐藥86個、使藥80個。結(jié)果見圖2。

2.3 骨康方中藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

君藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有6節(jié)點、8個作用關(guān)聯(lián)；臣藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有78節(jié)點、288個作用關(guān)聯(lián)；佐藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有76節(jié)點、328個作用關(guān)聯(lián)；使藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有72節(jié)點、258個作用關(guān)聯(lián)。見圖3。

2.4 骨康方中藥-OP關(guān)鍵靶點的KEGG通路富集分析

利用Cytoscape軟件獲得君藥-OP關(guān)鍵靶點有6個、臣藥有30個、佐藥有31個和使藥有30個，結(jié)果按degree大小順序排列，見表1。然后分別對關(guān)鍵靶點進行KEGG通路富集分析，結(jié)果見圖4。將君臣佐使各藥關(guān)鍵靶點的KEGG通路結(jié)果進行交集后發(fā)現(xiàn)共同通路有9條、君藥特有的通路有7條、臣藥有2條和使藥有1條，而佐藥無特有的通路。結(jié)果見表2、圖5。

表2 KEGG通路交集結(jié)果Table 2 Intersection results of KEGG pathway

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學對骨康方中君臣佐使各藥的具體靶點及通路進行探討，以對比君臣佐使各藥對OP具體作用的異同，試圖通過中藥分子作用機制解釋君臣佐使組成及配伍的具體意義。通過構(gòu)建不同交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)后分別篩選出關(guān)鍵靶點，發(fā)現(xiàn)君藥的部分關(guān)鍵靶點在臣佐使藥中也分別存在，說明臣佐使藥可能通過這些共同的關(guān)鍵靶點輔佐君藥發(fā)揮其主要的作用治療OP，同時我們對關(guān)鍵靶點進行degree排序后發(fā)現(xiàn)君臣佐使的共同關(guān)鍵靶點排序有所不同，那么君臣佐使各藥可能治療OP的側(cè)重點有所不同，符合君臣佐使在方劑中負責的部分不同。

本研究通過對骨康方中君臣佐使各藥關(guān)鍵靶點的KEGG通路結(jié)果進行交集，發(fā)現(xiàn)一共有9條通路為君臣佐使各藥的共同通路，其中雌激素信號通路與OP過程密切相關(guān)，有研究表明部分中藥具有類雌激素作用，可通過雌激素受體作用于相關(guān)的骨代謝過程進而影響OP的進程[5]；其他的共同通路雖與OP沒有直接的關(guān)系，但通過KEGG官網(wǎng)對共同通路進行搜索發(fā)現(xiàn)，它們大多參與細胞生長、死亡及環(huán)境[6-7]、調(diào)控激素影響內(nèi)分泌系統(tǒng)及生長發(fā)育[8]以及調(diào)節(jié)鈣離子[9]等，特別值得注意的是這些通路與MAPK通路有聯(lián)系，而文獻檢索顯示MAPK通路可調(diào)控成骨細胞的增殖分化[10]，雌激素受體信號通路在MAPK信號通路的上游[11]，所以推測骨康方的君臣佐使各藥可能通過MAPK通路對OP進行調(diào)控。同時交集結(jié)果顯示君藥有7條獨特的通路、臣藥有2條、使藥有2條，而佐藥無自己獨特的通路。其中君藥的7條通路與Ca離子信號通路有關(guān)[12-13]，鈣是構(gòu)成骨骼的重要物質(zhì)[14]，對鈣離子通路的調(diào)控可影響骨代謝過程，有研究表明左歸丸可通過上調(diào)腎鈣和骨鈣轉(zhuǎn)運通路中相關(guān)蛋白的表達來發(fā)揮抗OP的作用[15]，那么君藥可能通過調(diào)節(jié)鈣離子通路促進骨形成從而影響OP的進展。臣藥的2條獨特通路主要與免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)通路有關(guān)[16]，淋巴細胞的部分增殖分化過程在骨髓內(nèi)進行，與骨髓造血共享同一個微環(huán)境，可共享微環(huán)境中的各種物質(zhì)，所以免疫因子、通路的變化可影響共享的微環(huán)境，從而影響骨細胞的相關(guān)過程[17]。使藥的1條獨特通路與細胞間粘附連接過程有關(guān)，這過程對維持組織結(jié)構(gòu)和細胞極性非常重要，并且可以限制細胞的移動和增殖[18]。綜上，君臣佐使各藥具有獨特的通路，并且它們影響的細胞過程也不同。君藥主要集中于鈣離子通路，可能通過鈣離子通路促進骨形成，從而緩解OP的主要癥狀——疼痛；臣藥主要與免疫微環(huán)境相關(guān)，可能通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境間接影響骨代謝過程，從而輔助君藥緩解疼痛的癥狀；而使藥則是對基礎(chǔ)的細胞過程起作用，起到調(diào)和諸藥的作用，符合君臣佐使的相關(guān)理論。

綜上所述，骨康方的君臣佐使各藥有共同的作用靶點及相關(guān)的通路，證明了它們作用時密切相關(guān)、相互輔佐，可能通過MAPK通路共同完成對OP的治療作用，與此同時，它們又各自具有一定治療特點的靶點及通路，發(fā)揮自己獨特的作用。