電感耦合等離子體質譜法測定陽春砂中多種無機元素

覃挺紅，黃海波，鐘慧怡，黃嘉鳳，但俊，陳玉娥

（1.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東廣州 510006；2.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東廣州 510360）

陽春砂為姜科植物豆蔻屬陽春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果實，臨床上多用于濕濁中阻、脘痞不饑、脾胃虛寒、嘔吐泄瀉、妊娠惡阻、胎動不安等病證[1]。陽春砂主要產于廣東、廣西和云南，其中，廣東陽春地區(qū)是陽春砂的道地產區(qū)。近年來，無序引種導致陽春砂的市場來源愈加混亂，且暫無可靠的方法用于區(qū)別不同產地的陽春砂，因此，需建立一種可有效判別不同產地陽春砂的方法。

植物體內無機元素的組成和含量與其生長環(huán)境有直接的關聯(lián)性[2]。不同產地中藥材因水、土壤的結構和種類等自然因素以及施肥種類和農藥的使用等人為因素的差異，不同地域的同一品種藥材所含的元素組成和含量存在差異，以此可作為產地判別的依據。電感耦合等離子體質譜（ICPMS）法具有靈敏度高、檢測限低、線性范圍寬、干擾少等特點[3]，可對大部分元素進行同步分析，近年來應用于大米、果汁、金銀花、石斛等食品或中藥的無機元素測定[4-7]。本實驗以ICP-MS測定陽春砂中多種無機元素，對陽春砂無機元素進行分析，建立陽春砂產地判別模型，為陽春砂的安全性評價和產地判別提供參考數(shù)據，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試劑MDS-6G微波消解儀（上海新儀微波化學科技有限公司，配聚四氟乙烯消解罐）；iCAP-RQ電感耦合等離子體質譜儀（美國Thermo Fisher公司）；GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）；AUY120萬分之一分析天平（日本島津公司）?；旌蠘藴嗜芤篬含鋁（Al）、砷（As）、硼（B）、鋇（Ba）、鉍（Bi）、鈣（Ca）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鐵（Fe）、鎵（Ga）、汞（Hg）、鉀（K）、鋰（Li）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鉬（Mo）、鎳（Ni）、磷（P）、鉛（Pb）、銣（Rb）、銻（Sb）、硒（Se）、錫（Sn）、鍶（Sr）、釩（V）、鋅（Zn）]（GNM-M301629-2013，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，500 μg·mL-1）；銠（Rh）標準溶液（GNM-M30725-2013，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，100 μg·mL-1）；65%硝酸（優(yōu)級純，成都艾科達化學試劑有限公司）；30%過氧化氫（優(yōu)級純，廣州化學試劑廠）；調諧液（美國Thermo Fisher公司）；純氦氣（99.999%，廣州大成氣體有限公司）；高純氬氣（99.999%，廣州大成氣體有限公司）；超純水。

1.2 藥材本研究所收集的陽春砂干果來源于廣東、廣西和云南3個省區(qū)，樣品由廣州中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定為姜科植物陽春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果實，憑證標本保存于廣州中醫(yī)藥大學。所收集的干果用密封袋封裝，置于4℃冰箱中冷藏保存。樣品信息見表1。

表1 陽春砂樣品信息Table 1 Sample information of Amomum villosum Lour.

2 方法與結果

2.1 ICP-MS條件射頻功率為1 548 W；采樣深度為5 mm；蠕動泵轉速為40 r·min-1；噴霧室溫度為2.9℃；霧化器、輔助氣和冷氣流量分別為1.025 L·min-1、0.8 L·min-1和14 L·min-1；KED模式，測試前用調諧液進行調諧，掃描30次，采集點數(shù)和重復次數(shù)均為3次。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合標準品和內標溶液制備精密吸取1 mL混合標準品，用5%稀硝酸稀釋至5 mL得到濃度為100 μg·mL-1的混合標準品母液；精密吸取30 μL內標溶液，用稀硝酸稀釋至100 mL得到濃度為30 ng·mL-1的內標溶液，過0.45 μm水系濾膜。

2.2.2 供試品溶液制備樣品粉碎過50目篩，準確稱取0.2 g樣品粉末于聚四氟乙烯消解罐內，加入7 mL濃硝酸后蓋上密封，置于微波消解儀中并設置消解程序。第1步：150℃、10 min；第2步：180℃、20 min。待程序結束后降至室溫，于通風櫥內打開，用超純水潤洗密封蓋內面并將潤洗液倒入罐內。當無棕色煙冒出且溶液呈無色透明時將消解液定容至50 mL。所得溶液過0.45 μm水系濾膜。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系和檢測下限取濃度100 μg·mL-1混合標準溶液，用5%稀硝酸溶液為溶劑，逐級稀釋為5 000、2 000、1 000、500、200、100、50、20、10、5、2 ng·mL-1的系列混合標準溶液，用ICP-MS測定各個元素響應值，根據響應值和濃度計算出標準曲線。結果見表2。

表2 陽春砂各個無機元素檢測線性參數(shù)和檢測下限Table 2 Determination of linear parameters and detection lower limits of inorganic elements in Amomum villosum Lour.

2.3.2 重復性試驗取11號樣品粉末，準確稱定0.2 g，共6份，按“2.2.2”項方法制備樣品后，以“2.1”項儀器條件測量各元素含量，計算得各元素相對標準偏差（RSD）為1.85%~8.57%，結果表明該方法重復性良好。

2.3.3 精密度試驗取11號樣品粉末0.2 g，按“2.2.2”項下方法制備樣品，所得溶液用ICP-MS平行測定6次，測得各元素含量，計算得各元素RSD為0.80%~6.62%，結果表明儀器精密度良好。

2.3.4 加樣回收試驗因測量元素較多，本實驗選取陽春砂低、中、高含量共5個元素進行加樣回收試驗，即B、Mg、Ga、Ba、Fe。準確稱取已知含量的11號樣品粉末0.1 g，共30份，分別加入混合標準品溶液適量，每個元素平行6份。按“2.2.2”項下方法制備樣品，測定各元素含量，計算得到B、Mg、Ga、Ba、Fe的平均加樣回收率分別為105.83%、97.66%、99.48%、97.20%、103.32%，RSD分別為4.19%、3.12%、2.87%、5.52%、1.99%。

2.4 樣品測定根據實驗條件，檢測3個省份陽春砂樣品中Al、As、B、Ba、Bi、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Hg、K、Li、Mg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Rb、Sb、Se、Sn、Sr、V、Zn的含量，結果見表3。其中，Hg未檢出，表中無列出。

表3 陽春砂無機元素測定結果Table 3 Results of determination of inorganic elements in Amomum villosum Lour.（μg·g-1，n=3）

（續(xù)表3）

（續(xù)表3）

2.5 結果與分析

2.5.1 陽春砂無機元素特征分析從表4可知：陽春砂中K元素含量最高，3個省份陽春砂的平均含量均在40 000 μg·g-1以上；其次為P和Mg元素，平均含量高于3 000 μg·g-1；陽春砂中Cd、Sb、Bi、Mo、Sn、Pb、Se、As、Ga、Co、V和Li的含量較低，均小于2 μg·g-1。應用Kruskal-Wallis H檢驗（K-W檢驗）考察3個省份間各個元素含量的差異，并以k個獨立樣本的單因素方差分析對3個省份陽春砂中無機元素的含量進行兩兩比較。結果表明：3個省份間除了V、Co、Mo、Sb、Fe、Ba、Pb、Bi的含量無顯著性差異（P＞0.05），其他元素均存在顯著性差異。當P＜0.05時，廣東陽春砂中B、K、Ca、Cr、Cu、Zn、As、Rb、Sn的含量顯著高于廣西陽春砂，而Ni元素含量顯著低于廣西陽春砂；廣東陽春砂中Cd含量明顯高于云南陽春砂；云南陽春砂Li、B、Mg、Al、P、K、Ca、Cr、Cu、Zn、Ga、As、Se、Rb、Sr、Sn的含量顯著高于廣西陽春砂。

表4 3個省份陽春砂無機元素含量差異性分析Table 4 Analysis on the differences of contents of inorganic elements in Amomum villosum Lour.in three provinces （±s，μg·g-1）

表4 3個省份陽春砂無機元素含量差異性分析Table 4 Analysis on the differences of contents of inorganic elements in Amomum villosum Lour.in three provinces （±s，μg·g-1）

注：同行不同小寫字母表示存在顯著性差異（P＜0.05）

元素鋰（Li）硼（B）鎂（Mg）鋁（Al）磷（P）鉀（K）鈣（Ca）釩（V）鉻（Cr）錳（Mn）鐵（Fe）鈷（Co）鎳（Ni）銅（Cu）鋅（Zn）鈣（Ga）砷（As）硒（Se）銣（Rb）鍶（Sr）鉬（Mo）鎘（Cd）錫（Sn）銻（Sb）鋇（Ba）鉛（Pb）鉍（Bi）云南（n=17）0.484±0.492a 35.934±22.307a 21 223.496±14 221.612a 3 087.918±4 732.564a 30 208.718±23 976.056a 378 421.708±284 608.816a 3 035.964±2 018.232a 1.274±1.057a 175.199±71.656a 1 199.935±690.055a 579.100±323.265a 0.628±0.301a 12.577±6.209ab 18.900±2.634a 158.773±40.319a 0.481±0.508a 0.499±0.223a 0.415±0.227a 173.138±175.612a 57.273±46.981a 0.310±0.199a 0.026±0.015b 0.597±0.352a 0.028±0.013a 39.723±30.999a 0.238±0.376a 0.005±0.007a廣西（n=12）0.136±0.069b 9.851±5.554b 4 477.267±2 142.143b 472.599±468.173b 3 443.246±3 212.649b 48 335.919±49 859.719b 567.899±454.326b 0.951±1.050a 40.038±42.944b 680.478±725.313a 298.414±180.868a 0.819±0.349a 13.340±3.482a 13.833±1.653b 100.844±34.267b 0.164±0.130b 0.214±0.222b 0.211±0.176b 34.944±16.252b 21.457±19.848b 0.217±0.156a 0.031±0.162ab 0.079±0.116b 0.018±0.011a 33.417±35.707a 0.551±0.538a 0.004±0.005a廣東（n=10）0.301±0.261ab 30.610±19.248a 16 225.791±13 711.109ab 1 824.642±1 636.648ab 23 972.539±21 438.648ab 262 653.100±214 153.384a 2 300.354±1 792.625a 0.957±0.511a 148.459±75.786a 1 486.673±1 077.045a 458.783±221.191a 0.771±0.246a 8.440±2.515b 18.402±3.603a 170.543±56.244a 0.345±0.217ab 0.565±0.353a 0.459±0.558a 207.272±212.522a 64.327±56.400a 0.190±0.148a 0.047±0.026a 0.565±0.344a 0.036±0.025a 48.518±46.230a 0.507±0.507a 0.005±0.003a

2.5.2 陽春砂重金屬含量分析《藥用植物及制劑外經貿綠色行業(yè)標準》[8]中規(guī)定：Hg≤0.2 mg·kg-1，Pb≤5.0 mg·kg-1，As≤2.0 mg·kg-1，Cd≤0.3 mg·kg-1，Cu≤20.0 mg·kg-1。從表3可知：3個省份的陽春砂均未檢測出Hg，Pb、As、Cd在規(guī)定的限量范圍內。廣東和云南有部分樣品的Cu超標，廣東陽春砂Cu含量在12.18～25.52 mg·kg-1之間，有30%的樣品超標；云南陽春砂Cu含量在13.45～23.35 mg·kg-1之間，有35%的樣品超標。Cu含量超標的原因不僅與當?shù)赝寥酪蛩赜嘘P，還可能與含銅殺蟲劑的長期大量使用和城市污泥堆肥利用有關[9]；果實、種子類中藥材生長周期短，重金屬在其體內富集時間較短[10]，故陽春砂中Cu含量超標量不高。

2.5.3 3個省份的陽春砂產地判別分析采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件對測定結果進行逐步判別分析。從27種元素中篩選出具有顯著性差異的無機元素。將39份陽春砂樣品按照廣西、廣東、云南分為3組，構建3個省份陽春砂產地判別模型，獲得3個省份的分類函數(shù)：廣西組=-0.053×Cr+0.391×Ni+1.482×Cu+0.083×Zn-17.094；廣 東組=-0.001×Cr-0.06×Ni+2.346×Cu+0.053×Zn-26.864；云南組=0.066×Cr+0.147×Ni+2.766×Cu-0.059×Zn-29.219。由函數(shù)可知，共有4種元素被引入到判別模型中，分別為Cr、Cu、Zn、Ni的含量值。利用建立的判別模型，3個省份判別分析的整體回判檢驗正確率和交叉驗證率分別為87.2%和84.6%。具體結果見表5。

表5 3個省份陽春砂的判別結果Table 5 Discriminant results of Amomum villosum Lour.in three provinces （%）

2.5.4 4個采集地的陽春砂產地判別分析進一步選取樣品數(shù)較多的4個采集地陽春砂（陽春、崇左、文山和西雙版納）進行逐步判別分析，獲得4個分類函數(shù)：陽春組=0.057×Ni+2.813×Cu-8.399×Sn-26.223；崇左組=0.681×Ni+2.094×Cu-2.831×Sn-21.843；文山組=0.154×Ni+2.332×Cu-2.831×Sn-21.843；西雙版納組=0.501×Ni+2.987×Cu-11.642×Sn-32.983。由函數(shù)可知共有3種元素被引入到判別模型中，分別為Cu、Ni、Sn的含量值。4個采集地判別分析的回判檢驗正確率和交叉驗證率分別為79.3%和72.4%。具體結果見表6。

表6 陽春砂4個采集樣地無機元素判別結果Table 6 Discrimination results of inorganic elements in Amomum villosum Lour.from 4 habitats （%）

3 討論

目前，用于產地溯源的技術主要包括穩(wěn)定同位素分析技術、無機元素分析技術和有機化合物分析技術等[11]。本研究K-W檢驗和逐步判別分析表明，不同產地陽春砂中無機元素含量存在差異，可以根據差異構建陽春砂的判別模型。以3個省份逐步判別分析篩選出的4個差異性指標可對3個省份陽春砂有較好區(qū)分結果；以4個采集地（陽春、崇左、文山和西雙版納）篩選出的3個差異性指標建立的產地判別模型總體準確率不高，但崇左和文山產區(qū)具有較好的判別結果，回判檢驗和交叉驗證的正確率均在85%以上。說明以無機元素建立陽春砂的產地判別模型對不同產地陽春砂進行區(qū)分具有一定的應用潛力。為提高產地判別模型的準確性，前人將穩(wěn)定同位素分析技術、無機元素分析技術或有機化合物分析技術等結合應用，以獲得更多差異性指標，并取得一定的成果[12-14]，提示結合多種產地溯源技術構建具有更準確的陽春砂產地判別模型的可能性。

本實驗前期曾通過正交設計探討固液比、過氧化氫和濃硝酸的比例及消解時間對陽春砂消解處理的影響，從中發(fā)現(xiàn)固液比對樣品的消解程度影響較大，較多消解溶劑與樣品充分反應能更徹底地裂解有機物而提高含量測定的準確率。最終優(yōu)選的陽春砂消解條件為0.2 g樣品中加入7 mL濃硝酸，180℃下消解時間為20 min。

應用ICP-MS法測定陽春砂中28種無機元素，檢測限低，精密度和重復性良好，可用于同時對陽春砂中多種無機元素的快速檢測。由于工作條件等原因，本研究僅以陽春砂中無機元素的含量進行產地判別。但植物中無機元素的含量不僅與產地土壤相關，還可能受農藥、施肥等栽培管理的影響[15]。研究表明，陽春砂栽培中會施加含多種元素的肥料以及防治病蟲害的農藥[16-18]。不同種類及含量的農藥、肥料的應用可能會影響陽春砂無機元素的積累。提示未來應進一步收集不同產地土壤樣本及開展種植實驗，探討陽春砂中無機元素的富集效應以及肥料、農藥等栽培管理因素對陽春砂中無機元素含量的影響，以解決銅超標問題，提高陽春砂品質。