四君子湯對(duì)脾虛大鼠骨骼肌細(xì)胞色素c氧化酶Ⅰ、ⅣmRNA及蛋白表達(dá)的影響

李嵐其，郭麗娜，陳肖家，季幸姝，鐘慧雅，宋雅芳

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心，廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州 510405；2.澳門大學(xué)中華醫(yī)藥研究院，中藥質(zhì)量研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，澳門 999078）

臟象學(xué)說是中醫(yī)理論體系的核心組成部分。脾者，諫議之官，為后天之本，氣血生化之源，在臟象學(xué)說中居于重要地位。同時(shí)，“脾主肌肉”也是中醫(yī)基礎(chǔ)學(xué)科研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。線粒體是三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的重要場(chǎng)所，在細(xì)胞的整個(gè)生命活動(dòng)中擔(dān)負(fù)著合成三磷酸腺苷（ATP）的重要職責(zé)。能量代謝的過程由一系列酶促反應(yīng)貫穿始終，細(xì)胞色素c氧化酶（COX）是線粒體呼吸鏈電子傳遞的限速酶，同時(shí)也是呼吸鏈終末氧化酶，在調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化、保障充足的能量供應(yīng)中起關(guān)鍵作用。它主要將細(xì)胞色素c上的4個(gè)電子傳遞給O2繼而生成H2O，然后借助于線粒體膜內(nèi)、外的電化學(xué)質(zhì)子梯度，啟動(dòng)ATP合成酶的催化作用，使二磷酸腺苷（ADP）磷酸化為ATP[1]。

研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，脾虛狀態(tài)下存在線粒體功能的改變，致使能量合成不足，脾主運(yùn)化失司，脾主肌肉失調(diào)，從而造成一系列的脾虛證候。本研究以線粒體能量代謝為切入點(diǎn)，通過對(duì)脾虛大鼠骨骼肌病理結(jié)果及線粒體COXⅠ、COXⅣmRNA和蛋白表達(dá)變化的研究，以探討脾虛證中線粒體能量代謝障礙機(jī)制及健脾益氣方藥對(duì)其的影響，從線粒體角度出發(fā)為脾虛證治療提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠（SPF級(jí)）42只，體質(zhì)量為（270±20）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2013-0020。所有大鼠在廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備四君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草組成，比例為2∶2∶2∶1，藥材購自廣州杏園春藥店。制備方法：將以上中藥材先加入生藥10倍量純水中浸泡4 h后煎煮，待水沸騰40 min后倒出藥液；再加8倍量水直接煎煮，水沸騰30 min后倒出藥液；將2次水提液合并，濃縮成為1 g生藥/mL四君子湯水提液，冷卻后4℃保存。

1.3 主要試劑利血平注射液（天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：1204191）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；熒光定量PCR試劑（日本TaKaRa公司）；PrimeScriptTMRT Reagent Kit（日本TaKaRa公司）；COXⅠ抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；COXⅣ抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（武漢博士德生物工程有限公司）；ElivisionTMplus鼠/兔試劑盒（福州Maxin生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.4 主要儀器EG1140H石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）；SHANDON-AS325型旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（英國Shandon公司）；普通PCR儀（美國Bio-Rad公司）；7300型熒光定量?jī)x（美國ABI公司）；Scanspeed 1730R型低溫離心機(jī)（丹麥Labogene公司）；VXE SERIES型超低溫冰箱（美國Thermo公司）。

1.5 分組、造模與給藥方法SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)至體質(zhì)量（320±30）g，先隨機(jī)分成2組，正常組10只，模型組32只。造模方法參照文獻(xiàn)研究[4]：模型組大鼠皮下注射利血平注射液0.5 mg·kg-1·d-1，正常組大鼠皮下注射等體積的生理鹽水，每日1次，持續(xù)8 d。

造模開始后，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)攝食量減少、明顯消瘦、嗜臥、瞇眼、喜蜷縮扎堆、大便稀溏、毛色枯槁不榮。參照沈自尹等[5-6]評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)確定造模成功。

造模成功后隨機(jī)抽取7只正常組大鼠及14只模型組大鼠，將模型組大鼠分為四君子湯組和脾虛模型組，每組各7只。參照前期研究[7]，四君子湯組給予最適劑量濃度1.0 g·mL-1·kg-1灌胃，脾虛模型組和正常組灌胃等量生理鹽水，每日1次，持續(xù)21 d，并記錄大鼠一般情況。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 一般狀況觀察各組大鼠的精神狀態(tài)，記錄體質(zhì)量、當(dāng)天攝食量、飲水量、大便質(zhì)地、毛發(fā)光澤度等。

1.6.2 對(duì)溴苯胺法檢測(cè)尿D-木糖排泄率各組灌胃四君子湯或生理鹽水21 d后，所有大鼠禁食不禁飲12 h，每只大鼠灌胃4 mL 3%D-木糖，收集5 h內(nèi)尿液，采用對(duì)溴苯胺法[8-9]測(cè)定尿D-木糖排泄率。

1.6.3 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察骨骼肌病理形態(tài)取大鼠骨骼肌組織，置于40 g/L多聚甲醛中，固定24 h后用PBS洗3次，依次使用由低到高濃度乙醇梯度脫水，用二甲苯溶液進(jìn)行透明，浸蠟后包埋處理。取骨骼肌橫、縱2個(gè)截面的連續(xù)切片，厚度約為5 μm，使用HE染色法進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝骨骼肌病理形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6.4 熒光定量PCR法檢測(cè)骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達(dá)采用TRIzol法提取骨骼肌組織RNA，計(jì)算濃度和純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件與時(shí)間：37℃持續(xù)15 min，溫度升高至85℃持續(xù)5 s，后降溫至4℃結(jié)束反應(yīng)。PCR反應(yīng)的條件與時(shí)間：93℃持續(xù)30 s，55℃持續(xù)15 s，72℃保溫30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)定量，計(jì)算復(fù)孔平均值。用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，COXⅠ的上游引物序列為5’-CT ATCACTGGCATCCGCTCA-3’，下游引物序列為5’-GACACCGTAGTCCACCAGCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度106 bp。COXⅣ的上游引物序列為5’-TCCAAT TGTACCGCATCCAG-3’，下游引物序列為5’-AA GCCGATGAAGAACATGGC-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度103 bp。

1.6.5 免疫組織化學(xué)Elivision法檢測(cè)骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)分離骨骼肌，取骨骼肌制作連續(xù)切片。低溫放置30 min，加入4℃丙酮固定10 min后，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，以100 μg/mL的牛血清白蛋白封閉，室溫孵育10 min。滴加兔抗人COXⅠ/COXⅣ第一抗體（1∶50稀釋），并設(shè)陰性對(duì)照組（使用PBS代替一抗），4℃孵育過夜。第2天取出切片滴加二抗，水浴箱37℃孵育30 min。甩掉二抗，PBS清洗5 min×3次，微微晾干，滴加辣根過氧化物酶，37℃水浴箱孵育20 min。隨后去除原液體，PBS清洗5 min×3次，滴加新鮮配制的3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色溶液30 s。PBS清洗5 min×3次，蘇木素染色40 s。自來水沖洗浸泡10 min，切片組織酒精梯度脫水后徹底晾干，滴加適量中性樹脂，蓋玻片封片，顯微鏡下觀察。參考文獻(xiàn)方法[10]對(duì)細(xì)胞著色進(jìn)行評(píng)分，見表1。本實(shí)驗(yàn)研究采用4級(jí)分法，兼顧細(xì)胞著色與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分，取兩者得分之和后，進(jìn)行判定。陰性為0分，輕度為1分、2分，中度為3分、4分，重度為5分、6分。

表1 細(xì)胞著色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Cell staining scoring criteria

1.6.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)取大鼠骨骼肌組織，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量。取蛋白質(zhì)樣品（30 mg），100℃條件下變性5 min，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。加入COXⅠ、COXⅣ一抗（1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜，清洗后加入二抗常溫孵育1 h。最后滴加發(fā)光液，曝光處理，應(yīng)用ImageJ軟件分析灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用IBM SPSS Statistics 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。如方差齊，則組間兩兩比較采用LSD法；如方差不齊，則采用Dunnett T3法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況開始造模后，脾虛模型組大鼠出現(xiàn)消瘦、攝食量減少、大便稀溏、毛色枯槁不榮、嗜臥、瞇眼、喜蜷縮扎堆，且體質(zhì)量較正常組顯著降低。停止造模后，脾虛模型組大鼠一般狀況好轉(zhuǎn)、體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，但仍顯著低于正常組，四君子湯組大鼠體質(zhì)量較脾虛模型組有上升趨勢(shì)。

2.2 各組大鼠尿D-木糖排泄率比較給藥3周結(jié)束時(shí)，脾虛模型組尿D-木糖排泄率低于正常組（P＜0.05），而四君子湯組尿D-木糖排泄率較脾虛組有所恢復(fù)（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠尿D-木糖排泄率比較Table 2 Comparison of D-xylose excretion rate in various groups of rats （±s，%）

表2 各組大鼠尿D-木糖排泄率比較Table 2 Comparison of D-xylose excretion rate in various groups of rats （±s，%）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組脾虛模型組四君子湯組D-木糖排泄率44.68±9.71 24.95±13.45①39.33±9.50②鼠數(shù)/只7 7 7

2.3 各組大鼠骨骼肌組織病理形態(tài)比較正常組大鼠骨骼肌形態(tài)：肌纖維排列整齊，結(jié)構(gòu)尚清晰，胞質(zhì)染色整體一致，細(xì)胞核均勻分布。脾虛模型組大鼠骨骼肌形態(tài)：肌纖維排列紊亂、連續(xù)性較差，間隙增寬，胞質(zhì)染色深淺不一，細(xì)胞核分布不均。與脾虛模型組比較，四君子湯組骨骼肌肌纖維排列較整齊，胞質(zhì)染色較一致，細(xì)胞核分布均勻。表明四君子湯治療后，脾虛大鼠骨骼肌病理損傷情況改善。見圖1。

圖1 各組大鼠骨骼肌組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of histopathological features of rat skeletal muscle in various groups（by HE staining，×200）

2.4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達(dá)比較與正常組比較，脾虛模型組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與脾虛模型組比較，四君子湯組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達(dá)比較Table 3 Comparison of mRNA expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （lg±lg s）

表3 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA表達(dá)比較Table 3 Comparison of mRNA expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （lg±lg s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組脾虛模型組四君子湯組COXⅣ4.86±0.43 3.61±1.21①4.33±0.50②鼠數(shù)/只7 7 7 COXⅠ5.04±0.64 3.96±0.87①4.24±0.54②

2.5 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)比較免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常組大鼠骨骼肌胞漿深度染色，出現(xiàn)棕黃色顆粒；與正常組比較，脾虛模型組胞漿染色淺，視野內(nèi)骨骼肌棕黃色顆粒明顯減少，脾虛模型組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；經(jīng)四君子湯治療后，與脾虛模型組比較，COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05或P＜0.01），骨骼肌胞漿染色較脾虛模型組深，見少量棕黃色顆粒分布，但仍低于正常對(duì)照組。見表4、圖2、圖3。蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示：與正常組相比較，脾虛模型組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；經(jīng)四君子湯治療后，與脾虛模型組相比較，COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見圖4。

圖3 各組大鼠骨骼肌COXⅣ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較（×100）Figure 3 Comparison of immunohistochemical staining results of COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats（×100）

圖4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白免疫印跡結(jié)果比較Figure 4 Comparison of Western Blot results of COXⅠ、COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats

表4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （±s，分）

表4 各組大鼠骨骼肌COXⅠ、COXⅣ蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expression of COXⅠand COXⅣin skeletal muscle in various groups of rats （±s，分）

①P＜0.01，與正常組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

COXⅣ1.60±0.45 0.54±0.19①0.93±0.21②組別正常組脾虛模型組四君子湯組鼠數(shù)/只7 7 7 COXⅠ2.20±0.26 0.76±0.19①1.47±0.28③

圖2 各組大鼠骨骼肌COXⅠ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較（×100）Figure 2 Comparison of immunohistochemical staining results of COXⅠin skeletal muscle in various groups of rats（×100）

3 討論

脾為五臟之使，氣血生化之源?！短绞セ莘健分杏涊d：“脾胃者，水谷之精，化為氣血，氣血充盛，營衛(wèi)流通，潤(rùn)養(yǎng)身形，榮于肌肉也?！薄端氖バ脑础吩唬骸凹∪庹撸⑼林?，脾氣盛則肌肉豐滿而充實(shí)?！逼⑽竿?，氣血化源充盛，水谷精微足以輸布全身充養(yǎng)肌肉，使得肌肉發(fā)達(dá)、豐滿、健壯。李杲《脾胃論》中亦指出：“脾虛則肌肉瘦削?！薄捌⑽钢?，怠惰嗜臥，四肢不收?！比粝忍炱⑽柑撊趸蚝筇炱⑽腹δ苁С?，脾不升清，胃不降濁，脾胃運(yùn)化功能失司，肌肉筋脈失于濡養(yǎng)，日久則見四肢乏力，肌肉痿軟，不耐勞作，甚則萎弱不用，發(fā)為痿證。故脾養(yǎng)四肢百骸，脾氣充則肌肉豐，脾氣虛則肌肉萎。

能量代謝是機(jī)體內(nèi)物質(zhì)代謝中能量釋放、轉(zhuǎn)移和利用的動(dòng)態(tài)過程，它與中醫(yī)“脾主運(yùn)化”“脾主肌肉”理論密不可分。脾主運(yùn)化，通過飲食水谷中攝取精微物質(zhì)，布散到臟腑組織中[11]。脾主肌肉，是以脾所運(yùn)化的水谷精微充養(yǎng)全身肌肉[12]。線粒體是一種集三大基本生命活動(dòng)（能量代謝、物質(zhì)代謝和遺傳變異）于一身的半自主性細(xì)胞器，是“細(xì)胞動(dòng)力站”。真核細(xì)胞能量生成主要來源于線粒體，其通過氧化磷酸化，消耗ADP和無機(jī)磷酸合成ATP，以滿足機(jī)體肌肉系統(tǒng)、腦等能量需求較大的器官[13]。

本課題組長(zhǎng)期從事“脾-線粒體”的相關(guān)研究，提出機(jī)體吸收營養(yǎng)物質(zhì)就是一個(gè)不斷消耗ATP，在生物線粒體內(nèi)發(fā)生氧化磷酸化并釋放能量的過程，此為闡明中醫(yī)“脾主運(yùn)化”的科學(xué)內(nèi)涵提供了新思路[14]。本課題組通過進(jìn)一步探討脾虛與線粒體能量代謝的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)脾虛模型組大鼠的骨骼肌、胃黏膜組織線粒體超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)空泡化、膜缺損、嵴斷裂等明顯損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，脾虛模型組大鼠ATP、琥珀酸脫氫酶（SDH）酶活性和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α（PGC-1α）的表達(dá)經(jīng)過四君子湯干預(yù)后，均得到了不同程度的提高，表明脾虛模型組大鼠骨骼肌線粒體存在能量代謝障礙，健脾益氣中藥可以使這種異常變化得到改善[7，16]。此外，有學(xué)者對(duì)脾與線粒體關(guān)系進(jìn)行探討，結(jié)果表明，脾氣虛大鼠骨骼肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，ATP含量顯著低于正常組，電針“足三里”健脾治療后上述癥狀得到改善[17]。艾灸健脾益氣俞穴后可恢復(fù)線粒體結(jié)構(gòu)，增加呼吸鏈酶含量，從而改善脾虛狀態(tài)[18]。上述脾虛相關(guān)研究涉及中藥、針灸、艾灸等多種手段，從線粒體結(jié)構(gòu)、功能多角度進(jìn)行探討，結(jié)果均表明健脾以提升機(jī)體運(yùn)化可改善線粒體結(jié)構(gòu)功能，調(diào)節(jié)能量代謝。本課題組在既往脾與線粒體相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了健脾益氣代表方四君子湯對(duì)脾虛大鼠骨骼肌線粒體COXⅠ和COXⅣ活性的影響。

COX位于線粒體內(nèi)膜，是由nDNA基因組和mtDNA基因組分別編碼，是線粒體內(nèi)呼吸鏈電子傳遞的限速酶，處于調(diào)節(jié)線粒體氧化能力的關(guān)鍵地位，其數(shù)量的多寡與線粒體呼吸鏈功能密切相關(guān)[19]。其在氧化磷酸化和由活性氧簇（ROS）調(diào)控的代謝中起中心作用[20]。脾虛證時(shí)線粒體結(jié)構(gòu)受損，伴隨功能障礙，從而影響能量代謝的關(guān)鍵過程。COX（Ⅰ、Ⅳ）是線粒體的標(biāo)志酶，其酶的活性和含量的變化可直接影響整個(gè)呼吸鏈的功能，且其具有不穩(wěn)定、易受損的特點(diǎn)，極易受自由基造成的氧化損傷，導(dǎo)致給氧分子傳遞電子的數(shù)量降低，效率下降，自由基生成增多，進(jìn)而加重?fù)p傷[21]。

COXⅠ是由mtDNA編碼的最大的COX亞單位，該酶的作用是將NADH上得到的2個(gè)高勢(shì)能電子轉(zhuǎn)移至鐵硫蛋白上，再將電子傳遞給輔酶Q。其具有酶催化活性，被認(rèn)為是mtDNA質(zhì)量的標(biāo)志，因其僅在線粒體表達(dá)，可在一定程度上反映線粒體的功能[22]。

COXⅣ是COX組成的重要亞基，對(duì)維持COX分子的結(jié)構(gòu)及功能起關(guān)鍵作用，其存在的2種異構(gòu)體可以結(jié)合ATP，在ADP/ATP比例升高時(shí)使COX活性變構(gòu)性激活，COXⅣ表達(dá)正常與否直接影響整條呼吸鏈的功能狀態(tài)以及細(xì)胞的能量供應(yīng)[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型功能性消化不良大鼠肝臟COXⅣ蛋白和基因表達(dá)降低，經(jīng)脾虛1號(hào)方（六君子湯加延胡索、枳殼等）治療后，可顯著上調(diào)COXⅣmRNA和蛋白的表達(dá)[24]。電針足三里穴，可通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝提升脾氣虛模型組大鼠心肌、胃肌、骨骼肌組織中COX4的mRNA和蛋白的表達(dá)[25]。亦有研究表明，在脾氣虛證到脾不統(tǒng)血的不同階段，大鼠骨骼肌線粒體的4種呼吸鏈酶復(fù)合物活性均低于正常對(duì)照組，并說明這種變化是2種證型差異的重要指征[26]。脾虛證大鼠經(jīng)健脾類方治療后，其骨骼肌線粒體琥珀酸脫氫酶（SDH）及Ca2+-ATPase等表達(dá)均升高[27]。脾虛大鼠心肌線粒體存在超微結(jié)構(gòu)的改變及少量線粒體自噬體出現(xiàn)[28]。有學(xué)者對(duì)AS巴馬小型豬肝臟組織84個(gè)與線粒體能量代謝密切相關(guān)的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：在17個(gè)變化基因中，有16個(gè)基因分別與COXⅠ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ亞基相關(guān)[29]。以上研究提示，COXⅠ、COXⅣ蛋白的表達(dá)與脾虛證線粒體能量代謝障礙密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，脾虛大鼠骨骼肌病理形態(tài)顯示肌纖維損傷，肌肉組織排列紊亂、間隙增大，肌細(xì)胞胞質(zhì)染色、胞核分布不均勻，骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA及蛋白表達(dá)水平均降低。表明脾虛大鼠線粒體結(jié)構(gòu)與功能受損，氧化磷酸化功能障礙，提示脾虛證與線粒體損傷密切相關(guān)。脾為后天之本，氣血生化之源，脾虛則健運(yùn)失司，氣血無以化生，肌肉失養(yǎng)，線粒體呼吸鏈中的細(xì)胞色素氧化酶亞基的蛋白合成受阻，氧化磷酸化功能障礙，從而影響能量的合成，造成能量代謝障礙。經(jīng)四君子湯治療后，脾虛大鼠骨骼肌病理形態(tài)改善，肌纖維排列整齊，細(xì)胞核分布較均勻，骨骼肌COXⅠ、COXⅣmRNA及蛋白表達(dá)增加，其機(jī)制可能與四君子湯改善脾虛引起的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，提高線粒體氧化磷酸化功能，從而減輕線粒體損傷，改善機(jī)體能量代謝有關(guān)。