卵巢癌中MSI2蛋白表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

甄 娟，劉玉東，宋春紅，吳 莎，焦瑞芬

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，是發(fā)達(dá)國家婦科癌癥死亡的主要原因[1]。卵巢上皮性癌是最常見的病理類型，占所有類型卵巢癌的90%，由于卵巢位于盆腔內(nèi)，早期癥狀隱匿，早期診斷缺乏敏感性和特異性均較高的指標(biāo)，多數(shù)患者確診時已為晚期，且卵巢癌極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。卵巢癌患者標(biāo)準(zhǔn)治療方法是行腫瘤減滅術(shù)后接受鉑類化療，盡管一線治療方案已取得較大進(jìn)展，多數(shù)患者仍會復(fù)發(fā)，并對鉑類化療產(chǎn)生耐藥[2-3]。因此，提高卵巢癌早期檢出率和尋找有效的基因進(jìn)行靶向治療是提高卵巢癌患者生存率的最重要手段。近來研究發(fā)現(xiàn)，MSI2是造血干細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，在白血病和多種實體腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤低分化狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者不良預(yù)后密切相關(guān)[4-8]。由此可見MSI2作為腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮生物學(xué)作用，并對臨床評估患者的預(yù)后具有重要意義。然而MSI2在卵巢癌中的相關(guān)研究較少，本實驗采用免疫組化和Western blot法檢測MSI2在卵巢癌組織中的表達(dá)情況，分析MSI2表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性，尋找卵巢癌新的診斷、靶向治療和預(yù)后評估分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料收集2010年1月～2021年10月石家莊市第四醫(yī)院/河北醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院存檔的婦科手術(shù)切除標(biāo)本164例，其中卵巢癌75例，癌旁正常卵巢組織50例，輸卵管組織39例，所有患者術(shù)前均未接受藥物治療及放、化療。標(biāo)本石蠟包埋切片后經(jīng)HE染色后明確診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2020)卵巢腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)和FIGO分期系統(tǒng)。根據(jù)病理特征和分子遺傳學(xué)改變確定腫瘤類型(其中Ⅰ型卵巢癌36例和Ⅱ型卵巢癌39例)。術(shù)中同時留取同一患者的卵巢癌組織及癌旁正常卵巢組織和輸卵管組織，新鮮組織離體后取少量放入EP管立即凍存于液氮后，移入-80 ℃低溫冰箱保存，以備Western blot檢測。本實驗通過了本院倫理委員會審核，且獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑兔抗人MSI2單克隆抗體(ab76148)購自Abcam公司，免疫組化SP試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm厚連續(xù)切片。操作過程嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒說明書步驟進(jìn)行MSI2(1 ∶400)染色。觀察MSI2在卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中的表達(dá)部位。判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽性標(biāo)準(zhǔn)主要表現(xiàn)為細(xì)胞核/質(zhì)/膜出現(xiàn)清晰的著色及達(dá)到一定數(shù)量陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(400×)，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞。(1)按細(xì)胞著色深淺評分：無細(xì)胞著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。(2)按陽性細(xì)胞所占百分比評分：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。將上述兩項評分相乘作為最終結(jié)果：≥3分為陽性，<3分為陰性。

1.3.2Western blot法 將新鮮組織剪碎、裂解、再粉碎、勻漿、離心，提取上清液為總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，取80 μg蛋白樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，MSI2與內(nèi)參β-actin一抗4 ℃孵育過夜，第2天洗膜后與相應(yīng)二抗37 ℃孵育2 h，發(fā)光，掃描圖像并分析各條帶的光密度值，以目的蛋白與β-actin光密度值比值作為相對表達(dá)量。

1.3.3隨訪 對所有卵巢癌患者術(shù)后進(jìn)行定期隨訪，主要采用患者門診復(fù)查及電話隨訪等方式，平均每6個月隨訪1次，若隨訪期間出現(xiàn)患者死亡，規(guī)定其死亡時間為終止時間，亦納入生存分析。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中MSI2蛋白的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，卵巢及輸卵管組織中MSI2的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核(圖1)，其在卵巢癌中的陽性率(73.33%，55/75)高于癌旁正常卵巢組織(16.00%，8/50)及輸卵管組織(12.82%，5/39)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.448，P<0.001；χ2=37.686，P<0.001)。MSI2表達(dá)與Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P均<0.05，表1)。

表1 卵巢癌組織中MSI2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖1 MSI2在不同組織中的表達(dá)，SP法；A.漿液性癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽性；B.子宮內(nèi)膜樣癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽性；C.黏液性癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽性；D.透明細(xì)胞癌中MSI2呈彌漫強(qiáng)陽性；E.癌旁正常卵巢組織中MSI2呈陰性；F.輸卵管組織中MSI2呈陰性

2.2 新鮮卵巢組織及輸卵管組織中MSI2的表達(dá)量Western blot法檢測結(jié)果顯示，30例卵巢癌、30例癌旁正常卵巢組織和30例輸卵管組織中MSI2的相對表達(dá)量分別為1.14±0.19、0.38±0.06、0.33±0.08。卵巢癌中MSI2的相對表達(dá)量高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.702，P<0.001；t=21.271，P<0.001)(圖2)。

圖2 MSI2在卵巢癌組織、癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織中的表達(dá)：MSI2在卵巢癌組織(C1、C2)中的表達(dá)高于輸卵管組織(N1、N2)及癌旁正常卵巢組織(N3、N4)

2.3 MSI2表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系生存分析結(jié)果顯示，MSI2陽性患者中位生存時間為(45.00±4.364)個月；MSI2陰性患者中位生存時間為(60.00±2.137)個月。MSI2陽性患者生存時間及總生存率低于陰性患者(Log-rank檢驗Waldχ2=8.620，P=0.003，表2)。單因素和多因素分析結(jié)果表明，MSI2蛋白表達(dá)、腫瘤分型、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與患者預(yù)后相關(guān)(P均<0.05，表2，圖3)，MSI2蛋白表達(dá)水平是卵巢癌患者不良預(yù)后的可選預(yù)測因素之一(P=0.031，表3)。

表2 卵巢癌患者總生存率的單因素分析

表3 卵巢癌患者總生存率的多因素分析

圖3 卵巢癌主要臨床病理因素與患者預(yù)后的關(guān)系：A.MSI2表達(dá)；B.FIGO分期；C.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；D.腫瘤分型

3 討論

MSI(musashi)蛋白家族是高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在哺乳動物體內(nèi)，MSI家族有MSI1和MSI2兩個成員，MSI1和MSI2蛋白在N端有兩個高度保守的RNA結(jié)合域(RNA banding domains, RBDS)，其序列同源性接近90%，在較不保守的C末端區(qū)，顯示了約70%的序列同源性。MSI2基因定位于人染色體17q22，包含328個氨基酸，其編碼蛋白MSI2具有2個剪接體形式(MSI2L和MSI2S)，相對分子質(zhì)量分別為36.9×103和35.7×103，MSI2通過RNA識別結(jié)構(gòu)序列(RNA recognition motif, RRM)直接識別并與RNA結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯過程，調(diào)控細(xì)胞生長、分化、增殖及造血干細(xì)胞、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。最初研究發(fā)現(xiàn)，MSI2過表達(dá)會促進(jìn)白血病的發(fā)生、發(fā)展，隨后越來越多的研究結(jié)果證實MSI2在大部分實體腫瘤中過表達(dá)并在腫瘤的增殖、侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-14]。

研究者利用BioExpress數(shù)據(jù)庫和MethHC數(shù)據(jù)庫，分析人類癌癥TCGA的基因表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)癌旁正常組織相比，許多人類癌癥包括子宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌和甲狀腺癌等組織中MSI2 mRNA表達(dá)增高。隨后在子宮頸癌中做了一系列表型實驗，發(fā)現(xiàn)MSI2過表達(dá)促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞集落形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖和侵襲遷移，敲低MSI2的表達(dá)后，出現(xiàn)相反的結(jié)果[15]。Liu等[16]研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，與正常子宮頸組織相比，MSI2在子宮頸癌中的表達(dá)明顯增高，且與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MSI2陽性患者總生存率和無進(jìn)展生存率明顯下降，Cox回歸分析結(jié)果表明，MSI2是子宮頸癌總生存期和無瘤生存期的獨立預(yù)測因素。Fang等[17]的研究結(jié)果表明，MSI2在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)MSI2后，腫瘤細(xì)胞集落形成和存活率明顯增加，腫瘤細(xì)胞凋亡下降，Ki-67表達(dá)增高，此外，敲低MSI2表達(dá)后，細(xì)胞對索拉非尼敏感性增加，表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞存活率和集落形成數(shù)量減少，凋亡升高，Ki-67表達(dá)下降。說明MSI2過表達(dá)或敲低改變了腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)、自我更新以及肝癌細(xì)胞系對化療的抵抗性，在小鼠異種移植模型中，過表達(dá)MSI2能顯著增加腫瘤的體積和質(zhì)量。同時MSI2過表達(dá)導(dǎo)致lin28a水平上調(diào)，MSI2和lin28a水平與肝癌患者的臨床嚴(yán)重程度和預(yù)后呈正相關(guān)。Zhao等[18]研究發(fā)現(xiàn)MSI2在前列腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，并且與腫瘤分級呈相關(guān)性。MSI2在雄激素敏感和不敏感前列腺癌細(xì)胞中的下調(diào)均能抑制體內(nèi)腫瘤的形成和體外細(xì)胞生長，敲低MSI2后腫瘤細(xì)胞集落形成減少，增殖能力下降，移植鼠腫瘤生成速率和生長速度均減慢，推測MSI2在腫瘤形成和生長過程中發(fā)揮重要作用，過表達(dá)的AR能夠扭轉(zhuǎn)MSI2敲除后的腫瘤抑制作用，MSI2與AR呈密切正相關(guān)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中MSI2高表達(dá)，MSI2基因沉默或過表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖有明顯影響。在異種移植模型中，MSI2表達(dá)沉默可明顯抑制O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)的表達(dá)和腫瘤生長，并逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的耐藥性[19]。在結(jié)腸癌、膽管癌和食管癌中的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，MSI2高表達(dá)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為有關(guān)。MSI2高表達(dá)患者的總生存率和無瘤生存期縮短，并且其是總生存率和無瘤生存期的獨立預(yù)測因素[20-22]。由此可見，MSI2作為腫瘤促進(jìn)因子在多種惡性腫瘤的發(fā)生及惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，且與患者不良預(yù)后相關(guān)。在卵巢癌中MSI2是否也發(fā)揮同樣的促癌作用呢？本組Western blot實驗檢測結(jié)果示，MSI2在卵巢癌組織中的蛋白表達(dá)量高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織。與之一致的是，免疫組化結(jié)果亦顯示，在卵巢癌組織中MSI2的陽性率高于癌旁正常卵巢組織及輸卵管組織，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，MSI2表達(dá)與Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，由此推測MSI2可能作為癌基因在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。本實驗進(jìn)一步結(jié)合患者的臨床資料進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的MSI2、Ⅱ型卵巢癌、高FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者總生存率下降，生存期縮短，Cox多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，MSI2的蛋白表達(dá)水平是卵巢癌患者不良預(yù)后的可選預(yù)測因素之一。

綜上，本實驗結(jié)果表明，MSI2作為促瘤因子在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后評估過程中發(fā)揮重要作用。推測MSI2具有成為卵巢癌診斷標(biāo)志物和治療靶點的潛在可能，同時為臨床評估患者的預(yù)后提供理論依據(jù)，然而本實驗只是初步驗證，其在卵巢癌中的具體機(jī)制有待積累大樣本進(jìn)行深入探究。