牛肉源假單胞菌的分離鑒定及菌株致腐能力差異比較

張若煜，羅欣，朱立賢，劉昀閣，陳雪，郝劍剛，黃鑫，張一敏*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安 271018）（2.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系烏拉蓋站，內(nèi)蒙古烏拉蓋管區(qū) 026321）（3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系延邊站，吉林延邊 133000）

牛肉因其較高的營養(yǎng)價值，廣受消費者的青睞。牛肉的腐敗主要是由于微生物的增長及其胞外酶分解代謝引起的。其中假單胞菌屬為有氧包裝條件下的冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌[1,2]，該菌屬多具有較強的產(chǎn)胞外蛋白酶與脂肪酶能力，能夠分解利用肉品中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等為自身的生命活動提供能量來源[3]。在此過程中，假單胞菌通過分泌胞外蛋白酶分解肌原纖維及肌漿蛋白[4]，并通過脫氨作用分解氨基酸并產(chǎn)生二甲基硫等具有腐臭氣味的硫化物等[5]，同時分泌脂肪酶催化脂肪等分解為脂肪酸、甘油等[6]，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，使牛肉變粘、變色，產(chǎn)生異味。

假單胞菌株對肉品的腐敗能力較強，其蛋白酶與脂肪酶活性較高。顧春濤等[7]發(fā)現(xiàn)冷鮮牛肉中致腐能力較強的假單胞菌株具有較強的胞外蛋白酶活性，主要作用于肌原纖維；Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)在雞肉中致腐能力較強的假單胞菌也具有較強的蛋白酶活性，使肌球蛋白、肌動蛋白、肌鈣蛋白發(fā)生了不同程度的降解；葛陽楊等[9]發(fā)現(xiàn)大黃魚中腐敗能力較強的菌株除具有較強的蛋白酶活性外，也具有較強的脂肪酶活性。目前具有較強致腐能力的菌株其胞外酶活性較強已得到證實，但具有較強酶活性的菌株是否對肉品具有較強致腐能力尚未得到明確的定論，因此為了明晰假單胞菌的產(chǎn)酶能力對牛肉的腐敗作用，本試驗篩選了產(chǎn)酶能力存在差異（3株強蛋白酶活性、3株強脂肪酶活性、1株弱蛋白酶及弱脂肪酶活性）的7株假單胞菌，研究 7株菌回歸污染后牛肉樣品的假單胞菌數(shù)量、TVB-N值及感官品質(zhì)的變化，旨在確定假單胞菌的產(chǎn)酶能力與牛肉腐敗的關(guān)系，為防控牛肉的腐敗提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經(jīng)檢疫合格的新鮮牛背最長肌，山東某肉牛屠宰企業(yè)；堿性蛋白酶活性測定試劑盒、脂肪酶活性測定試劑盒，索橋生物公司；假單胞菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基、假單胞菌CFC添加劑，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，BioFlux公司；PCR全套試劑，Takara公司；生理生化鑒定全套試劑，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，輻照技術(shù)由藍孚醫(yī)療科技（山東）有限公司完成。

1.2 儀器與設備

1300 SERIES A2生物安全柜，美國 Thermo Scientific公司；DHP系列智能型生化培養(yǎng)箱，上海一恒公司；CFX 96、PCR儀PTC-200實時PCR檢測系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；SpectraMax M5微孔板檢測系統(tǒng)，美國Molecular Devices公司；GeneQuant 100微量核酸蛋白測定儀，英國Biochrom公司；G15DWS蒸汽壓力滅菌鍋，廈門致微公司；5804R離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉源假單胞菌的分離與純化

將宰后48 h的牛背最長肌分割成9塊3 cm厚的牛排，隨機分配到托盤包裝中，TQBC-0775包裝托盤盒[23 ℃、0%相對濕度下，透氧率為10 cm3/(m224 h)，38 ℃、90%相對濕度下，水蒸氣透過率為15 g/(m224 h)]；Lid 1050/550密封阻隔膜[23 ℃、0%相對濕度下，透氧率為25 cm3/(m224 h)，4 ℃、100%相對濕度下，水蒸氣透過率：10 g/(m224 h)]，參考Yang等[10]的方法對4 ℃有氧貯藏0、3、7、14和21 d的牛肉進行假單胞菌計數(shù)，并隨機挑取最高稀釋度可計數(shù)平板的10%的菌株劃線純化兩次，純化后的單菌落于-80 ℃保存。

1.3.2 假單胞菌產(chǎn)蛋白酶能力的研究

將分離純化的假單胞菌株點樣于脫脂乳平板（脫脂乳粉5%、瓊脂2%）上，28 ℃培養(yǎng)48 h后，測量菌落直徑與透明圈直徑[11]，通過比較H/C（透明圈直徑與菌落直徑之比）來初步測定菌株產(chǎn)蛋白酶能力的強弱。篩選H/C較大的菌株參照堿性蛋白酶活性測定試劑盒的方法對菌株進行堿性蛋白酶活性的測定[12]。

1.3.3 假單胞菌產(chǎn)脂肪酶能力的研究

將分離純化的假單胞菌株點樣于 Tween-80瓊脂平板（蛋白胨1%、酵母膏0.5%、NaCl 0.5%、CaCl20.01%、Tween-80 0.1%、瓊脂2%），28 ℃培養(yǎng)48 h后，測量D/C（沉淀圈與菌落直徑之比）[13]，通過D/C值來初步測定菌株產(chǎn)脂肪酶能力的強弱。篩選沉淀圈與菌落直徑的比值較大的菌株參照脂肪酶活性測定試劑盒的方法對菌株進行脂肪酶活性的測定[14]。

1.3.4 假單胞菌的生理生化鑒定

通過蛋白酶活性與脂肪酶活性的實驗篩選出3株強蛋白酶菌株、3株強脂肪酶菌株、1株弱蛋白酶弱脂肪酶菌株作為對照進行后續(xù)實驗。

對7株菌進行糖醇類發(fā)酵實驗，氧化酶反應，淀粉水解，硝酸鹽產(chǎn)氣，明膠液化，42 ℃生長實驗等生理生化實驗[15,16]。

1.3.5 假單胞菌的分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

細菌基因組DNA的提?。簠⒄誃ioFlux公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取。

16S rDNA的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增：PCR擴增引物采用細菌通用引物 27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTAYGACTT-3’）進行擴增。反應條件為：94 ℃預變性 30 s，98 ℃變性 10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。將測定的16S rDNA序列登陸NCBI進行BLAST比對，使用MEGA 7軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 7株菌的回歸污染

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌液稀釋至105CFU/mL，將經(jīng)過輻照滅菌制備的無菌牛肉（3 cm×3 cm×3 cm）在菌液中浸漬2 s，之后托盤包裝于4 ℃貯藏，在貯藏的第0、2、4、6和8 d時測定假單胞菌數(shù)量、揮發(fā)性鹽基氮，并進行感官評價。

1.3.6.1 假單胞菌數(shù)

假單胞菌數(shù)參照1.3.1假單胞菌數(shù)的計數(shù)方法。

1.3.6.2 TVB-N測定

揮發(fā)性鹽基氮的測定方法參照GB 5009.228-2016方法中的自動凱氏定氮儀法[17]。

1.3.6.3 感官品質(zhì)

參照Zhang等[18]的方法對冷藏期間的生鮮牛肉按照1-9分值進行感官評定，評定小組由10名經(jīng)過培訓的小組成員組成，從樣品的色澤、氣味、嫩度、黏性等方面綜合評定其整體可接受性，9分為最好，1分為最差，低于6分時被判定為不可接受。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2007和SigmaPlot 12進行數(shù)據(jù)處理和作圖，假單胞菌數(shù)、TVB-N值、感官品質(zhì)利用SAS軟件（Version 9.0）的混合模型交互作用進行數(shù)據(jù)分析，p<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

在有氧貯藏條件下的冷鮮牛肉中，于 0、3、7、14和21 d共篩出216株假單胞菌，用于后續(xù)實驗。貯藏前期（0~3 d）分離的假單胞菌數(shù)較少，共計31株，貯藏中后期（7~21 d）分離假單胞菌數(shù)較多，共計185株。

2.1 產(chǎn)酶較高菌株的酶活性的測定

2.1.1 產(chǎn)蛋白酶較高菌株的蛋白酶活性的測定

表1 產(chǎn)蛋白酶能力較強菌株的H/CTable 1 H/C of the strain with strong protease production ability

通過脫脂乳平板實驗，從分離純化的菌株中初步篩選出了16株H/C較大的菌株，結(jié)果如表1所示，篩選的16株菌的 H/C均大于 3.00，其中 PP3413、PP754、PP2142、PP1438和PP7410的H/C大于3.2，分別為3.38、3.30、3.29、3.26和3.23，產(chǎn)蛋白酶能力高于其他產(chǎn)蛋白酶菌株。PP3413的H/C最大。16株產(chǎn)蛋白酶能力強的菌株大多分離于冷鮮牛肉貯藏后期，表明在貯藏中后期，假單胞菌能夠利用肉品中的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)蛋白酶能力強的菌株逐漸占據(jù)優(yōu)勢地位。Casaburi等[19]認為葡萄糖是假單胞菌優(yōu)先利用的能量物質(zhì)，當牛肉中游離的葡萄糖、乳酸鹽等物質(zhì)不足以為假單胞菌的生長提供充足的能量時，假單胞菌開始分解蛋白質(zhì)利用氨基酸等物質(zhì)生成含硫化物、酯、酸等異味物質(zhì)，產(chǎn)蛋白酶能力較強的假單胞菌在貯藏后期通過蛋白水解能力深入肉中利用新的營養(yǎng)物質(zhì)[20]。

Andreani等[21]認為假單胞菌于低溫環(huán)境下分泌的蛋白酶主要為AprX堿性金屬蛋白酶家族，在多數(shù)熒光假單胞菌中，AprX堿性金屬蛋白酶家族被認為是參與食品腐敗的唯一蛋白酶家族。利用福林酚顯色法測定了以上16株菌株粗酶液堿性蛋白酶的活性，按堿性蛋白酶活性從大到小的排序方式排序，結(jié)果如圖 1所示。16株菌在24 h時的堿性蛋白酶活性均在8.00 U/mL~12.00 U/mL之間，PP3413、PP754和PP1438的堿性蛋白酶活性大于10 U/mL，分別為11.3 U/mL、10.06 U/mL和10.05 U/mL，其中PP3413的堿性蛋白酶活性最高。同樣，顧春濤等[7]研究發(fā)現(xiàn)在貯藏15 d的冷鮮牛肉汁中，有3株優(yōu)勢腐敗假單胞菌具有較高的蛋白酶活性，均高于10.62 U/mL。因此篩選產(chǎn)蛋白酶能力較強，堿性蛋白酶活性較大的PP3413、PP754、PP1438用于后續(xù)實驗。

2.1.2 產(chǎn)脂肪酶能力較高菌株的脂肪酶活性測定

表2 產(chǎn)脂肪酶能力較強菌株的D/CTable 2 D/C of the strains with higher lipase production ability

通過Tween-80瓊脂平板實驗，從分離純化的菌株中初步篩選出了20株產(chǎn)脂肪酶能力較強的菌株，結(jié)果如表2所示，20株菌的D/C值均在1.30以上，PL2115、PL2133、PL1459、PL1415、PL2136和PL347的D/C值均大于1.40，分別為1.44、1.62、1.75、1.41、1.48和1.53，其中PL1459的D/C值高于其他5株菌。20株產(chǎn)脂肪酶能力強的菌株也多分離于牛肉貯藏后期，表明隨著肉品的腐敗，菌株亦通過對脂肪的分解利用為自身生長代謝提供能量，產(chǎn)脂肪酶能力強的菌株比例呈上升趨勢。

利用銅皂法測定各菌株粗酶液中脂肪酶的活性，按脂肪酶活性從大到小的排序方式排序，結(jié)果如圖 2所示。20株菌在 24 h時的脂肪酶活性均在 0.6~1.2 U/mL之間，PL347、PL1415、PL1459和PL2133的脂肪酶活性大于1.1 U/mL，分別為1.19、1.15、1.14、1.10 U/mL，其中PL347的脂肪酶活性最高。而戴金岳等[22]測得冷鮮豬肉中的特定腐敗假單胞菌（P.koreensis）的脂肪酶在3 d時活性最強，達到51.85 U/g，不同來源的假單胞菌其脂肪酶活性存在較大差異可能與假單胞菌的菌種及其利用的脂肪種類密切相關(guān)。假單胞菌的分泌的脂肪酶屬于α/β型水解酶超家族[23]，Ramani等[24]認為假單胞菌的脂肪酶對牛脂底物利用能力較強。因此篩選產(chǎn)脂肪酶能力較強，脂肪酶活性較大的PL347、PL1415、PL1459用于后續(xù)實驗。

2.2 假單胞菌種水平的鑒定

通過蛋白酶與脂肪酶實驗篩選出1株產(chǎn)蛋白酶及脂肪酶能力都較弱的菌株，命名為P011，將P011與產(chǎn)蛋白酶能力強的菌株P(guān)P3413、PP754、PP1438及產(chǎn)脂肪酶能力強的菌株 PL347、PL1415、PL1459用于后續(xù)實驗。

2.2.1 生理生化鑒定結(jié)果

參考《伯杰細菌手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，結(jié)合表3結(jié)果，初步鑒定分離菌株P(guān)011不液化明膠，42 ℃不生長，不能利用阿拉伯糖等與惡臭假單胞菌（P. putida）鑒定特征接近，分離菌株P(guān)P3413、PP754、PL1415能利用葡萄糖、果糖、蔗糖，不能利用麥芽糖為唯一碳源等與熒光假單胞菌（P.fluorescens）鑒定特征相接近，PP1438硝酸鹽產(chǎn)氣等與P. salomonii鑒定特征相近，PL347利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖醇等與草假單胞菌（P. poae）與其生理生化特征相似，PL1459不利用果糖、蔗糖等與P.libanensis生理生化特征相近。

表3 7株菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical identification results of 7 strains

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由圖3可知，將篩選的7株菌以總DNA為模板PCR擴增后經(jīng)電泳檢測，均得到了1500 bp左右的條帶，將PCR產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果登錄NCBI網(wǎng)站，進行Blast序列比對，發(fā)現(xiàn)PP3413、PP754、PL1415與熒光假單胞菌的16S rDNA同源性達99%以上，結(jié)合生理生化試驗的結(jié)果，可判定 PP3413、PP754、PL1415為熒光假單胞菌。此外，結(jié)合16S rDNA與生理生化結(jié)果將P011、PL347、PP1438、L1459分別判定為惡臭假單胞菌、草假單胞菌、P. salomonii、P.libanensis。

有學者研究表明在冷藏肉中，熒光假單胞菌占初始假單胞菌數(shù)量的 60%以上，腐敗時占細菌總數(shù)的90%[25,26]，惡臭假單胞菌是有氧冷藏牛肉腐敗初期中常見的假單胞菌種之一[27]，而草假單胞菌、P.salomonii、P. libanensis在牛肉中分離較少，草假單胞菌曾在羊奶中被檢出[28]，P. salomonii、P. libanensis多分離于土壤、植物、水源等。因此PL347、PP1438、PL1459的來源可能是牛飼養(yǎng)過程中的土壤、飼料以及水源等。

值得注意的是，肉品中常被檢出的熒光假單胞菌與惡臭假單胞菌分離時期不同，惡臭假單胞菌多分離于貯藏初期[29]而熒光假單胞菌在腐敗末期也常被檢出[4,7]。且兩種菌的蛋白酶與脂肪酶活性差異較大，本試驗中，熒光假單胞菌PP754、PP3413具有較強的蛋白酶活性，熒光假單胞菌PL1415具有較強的脂肪酶活性，而惡臭假單胞菌 P011不具有蛋白酶活性及脂肪酶活性。Reichler等[30]測定不同假單胞菌種的蛋白酶及脂肪酶活性，結(jié)果表明熒光假單胞菌部分菌株具有蛋白酶活性與脂肪酶活性，而惡臭假單胞菌不具有蛋白酶活性，因此假單胞菌蛋白酶與脂肪酶的分泌可能與假單胞菌的菌種相關(guān)。惡臭假單胞菌在肉品貯藏后期檢出較少，可能與其較弱的蛋白酶、脂肪酶活性，從而無法較好的利用肉品中的蛋白質(zhì)、氨基酸脂肪等密切相關(guān)，熒光假單胞菌則因其較強的蛋白酶與脂肪酶活性使其成為肉品中的優(yōu)勢腐敗菌。

2.3 假單胞菌的回歸污染

2.3.1 假單胞菌計數(shù)

菌株種類和貯藏時間的交互作用顯著影響牛肉中假單胞菌數(shù)（p<0.05）。隨著貯藏時間的延長，各處理組中假單胞菌落數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢，而對照組中未檢出假單胞菌（檢出限為10.00 CFU/g），表明回歸接種前的牛肉樣品未受到假單胞菌的污染。接種 P011、PL347的牛肉樣品中假單胞菌落數(shù)從第四天時開始顯著低于其他處理組（p<0.05），分別為5.60 log CFU/g、5.03 log CFU/g，在貯藏第八天時分別達到 6.59 log CFU/g和6.25 log CFU/g。而其他處理組中假單胞菌的生長較快，在貯藏第四天時就已超過6.80 log CFU/g，PP754、PP3413、PP1438、PL1415及PL1459分別為7.63、8.26、6.87、7.42、7.72 log CFU/g；貯藏至第八天時，分別達到了 9.65、9.33、8.29、8.97、9.15 log CFU/g，能較好的利用牛肉的營養(yǎng)物質(zhì)來滿足自身生長需求。其中接種PP754的樣品在第八天時假單胞菌數(shù)最高，生長能力最強。值得注意的是，有學者發(fā)現(xiàn)在冷鮮雞肉中具有較強蛋白酶活性的莓實假單胞菌其數(shù)量在第七天時已經(jīng)達到了10.20 log CFU/g[4]；在冷鮮牛肉中具有較強蛋白酶活性的假單胞菌其數(shù)量在第六天時已經(jīng)超過了7.23 log CFU/g[7]，本實驗中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶能力較強的兩株菌PP754、PP3413處理組的假單胞菌數(shù)在第八天時高于其他假單胞菌處理組，因此蛋白酶活性強的假單胞菌在牛肉中的生長能力可能強于脂肪酶活性強的假單胞菌。

假單胞菌在冷鮮牛肉上的生長能力與其腐敗能力存在一定的相關(guān)性，除PL347（第八天時，假單胞菌數(shù)量為6.25 log CFU/g）外，其他5株產(chǎn)酶能力較強的菌株在冷鮮牛肉中具有較強的生長能力（第八天時，假單胞菌數(shù)量均高于8.20 log CFU/g）。底物可能是影響假單胞菌脂肪酶分解能力的關(guān)鍵因素之一[31]。而產(chǎn)脂肪酶能力較強的PL347在牛肉中生長能力較弱，可能是由于 PL347分泌的脂肪酶對牛脂的分解能力較差。劉武[32]認為假單胞菌分泌的脂肪酶對不同底物的分解能力有較大差異，在p-NP辛酸酯與p-NP葵酸酯不同底物中的脂肪酶活性分別為100.00%與71.30%。Borch等[33]認為與細菌生長相關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)利用情況會影響食品的腐敗速度，這5株產(chǎn)酶能力較強的菌株在牛肉中具有較強的生長能力可能是由于能較好地利用牛肉中的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，產(chǎn)酶能力較強的菌株在牛肉中的生長能力不一定較強，能否較好的利用相應類別的底物與其生長繁殖密切相關(guān)。

2.3.2 TVB-N值

TVB-N是評價肉質(zhì)新鮮度的重要指標之一。菌株和貯藏時間的交互作用顯著影響TVB-N值（p<0.05）。所有樣品的初始TVB-N值在10.64 mg/100 g左右，隨著貯藏時間的延長，均呈現(xiàn)上升的趨勢，其中接種PP754、PP3413、PL1459、PL1415的牛肉樣品其TVB-N值增長速率最快，貯藏第八天時顯著高于其他處理組（p<0.05，圖6），分別為25.02、22.06、21.80、20.35 mg/100 g。在第六天時，接種PP754、PP3413、PL1415、PL1459的牛肉樣品就已超過GB 2707-2016限量標準（15 mg/100 g），分別為 20.63、19.04、15.28、15.23 mg/100 g。其中接種PP754牛肉樣品的TVB-N值從第四天時顯著高于其他處理組（p<0.05），為14.99 mg/100 g；在腐敗末期（第八天）達到了25.02 mg/100 g。對照組在整個貯藏期間TVB-N值增長較?。?.67~12.68 mg/100 g）。

本研究結(jié)果表明，接種產(chǎn)酶能力較強的菌株如PP754、PP3413（在體外蛋白酶活性較強）和PL1459、PL1415（體外脂肪酶活性較強）使牛肉中的 TVB-N值顯著升高，該結(jié)果與上述假單胞菌數(shù)結(jié)果相一致。黃林等[34]也發(fā)現(xiàn)在冷鮮豬肉中，TVB-N值與假單胞菌數(shù)量也存在正相關(guān)性[35]，當假單胞菌達到 8.30 log CFU/g時，其TVB-N值已超過25.00 mg/100 g。然而，具有較強脂肪酶活性的PL347使接種后牛肉在貯藏第八天時的TVB-N值為13.95 mg/100 g，顯著低于其他產(chǎn)酶活性較強的假單胞菌（p<0.05）。同樣，PP1438（具有強蛋白酶活性）處理組在貯藏第八天時的TVB-N也處于較低水平為15.82 mg/100 g。與該結(jié)果相類似，Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)在冷鮮雞肉中具有較強蛋白酶活性、可降解肌鈣蛋白與肌動蛋白的殺鮭氣單胞菌因在肉中生長能力較低而樣品中對應的 TVB-N值也顯著低于其他菌株（第七天時達到30 mg/100 g），而不同的是本實驗分離菌株的TVB-N值與Wang等[8]實驗分離菌株的TVB-N值差異較大，可能是與菌種、肉的種類相關(guān)。進而說明，并不是所有產(chǎn)酶能力較強的菌株在肉品中的腐敗能力均比較強，這與其菌種及在肉品中的生長能力也有一定的關(guān)系。同時本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)蛋白酶能力較強的菌株 PP754、PP3413其TVB-N值分別高于產(chǎn)脂肪酶能力較強的菌株P(guān)L1459、PL1415，這意味著產(chǎn)蛋白酶活性較強的假單胞菌其腐敗能力可能優(yōu)于產(chǎn)脂肪酶較強的菌株。

2.3.3 感官品質(zhì)

接種7株腐敗假單胞菌的牛肉樣品的感官品質(zhì)變化如圖7所示。菌株和貯藏時間的交互作用顯著影響感官品質(zhì)評分（p<0.05），所有處理組的牛肉樣品隨貯藏時間的延長，感官評分均逐漸降低。貯藏第四天時，PP754、PP3413、PP1438、PL347、PL1415和PL1459處理組的感官評分就已低于6.00，分別為4.33、4.92、5.71、5.64、5.53和4.42，被判定為不可接受。在第六天時，接種PP754的牛肉樣品的感官評分為2.41，顯著低于其它處理組（p<0.05），其在貯藏期間腐敗速率最快，在貯藏末期（第八天）肉色發(fā)綠，產(chǎn)生強烈的腐臭味，感官評分為1.20，被判定為完全不可接受。

肉品感官品質(zhì)的下降主要是由于肉品中蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)的降解造成的[36,37]。在本研究中，接種產(chǎn)酶能力較強菌株的牛肉樣品，其感官評分顯著低于接種產(chǎn)酶能力較弱菌株 P011的牛肉樣品及對照組（p<0.05），Stanborough等[38]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌能夠分泌與肉品腐敗相關(guān)的蛋白酶及脂肪酶，當假單胞菌達到較高種群數(shù)量時，分泌的胞外酶活性會導致肉類品質(zhì)下降并產(chǎn)生不良氣味。Ahm等[39]也研究發(fā)現(xiàn)在假單胞菌占據(jù)主導地位的低溫有有氧貯藏的牛肉中，含有3-甲基丁酮-1-醇、乙酸乙酯、丙酮、2-丁酮和二乙酰等代謝產(chǎn)物，造成了肉品的感官品質(zhì)下降，同時感官品質(zhì)與 TVB-N值存在一定的相關(guān)性；Benjamin等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在真空包裝的冷鮮牛肉中，TVB-N值主要與a*值、b*值呈負相關(guān)性（r=0.43、r=-0.34）。本研究結(jié)果與之相似，TVB-N值上升較快的假單胞菌株其氣味更加難以接受，并具有較差的肉色。因此具有較強的產(chǎn)酶能力且能利用牛肉中的營養(yǎng)物質(zhì)的假單胞菌株致腐能力更強，感官品質(zhì)更差。同時，感官品質(zhì)被認為是評價肉品品質(zhì)最直接的方式[41]，在第8 d時接種蛋白酶活性較強的PP754（1.20）、PP3413（3.22）牛肉的感官品質(zhì)分別低于接種脂肪酶活性較強的PL1459（2.59）、PL1415（3.41）牛肉的感官品質(zhì)，這表明產(chǎn)蛋白酶能力較強的菌株與產(chǎn)脂肪酶能力較強的菌株相比可能會帶來更難以接受的品質(zhì)劣變。

3 結(jié)論

熒光假單胞菌是冷鮮牛肉中的優(yōu)勢腐敗菌，在篩選的7株假單胞菌中，3株熒光假單胞菌的產(chǎn)酶能力較強，同時其腐敗能力也處于較高水平，感官評價較差。假單胞菌的產(chǎn)酶能力與其致腐能力并不存在必然聯(lián)系，部分產(chǎn)酶能力較強的菌株可能因其無法以牛肉為底物進行生長代謝或在牛肉中生長能力較弱而導致在牛肉中的致腐能力較差。此外，本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶活性較強的菌株可能比產(chǎn)脂肪酶能力較強菌株的腐敗能力更強。因此，具有較強的酶活性且能利用牛肉中的營養(yǎng)物質(zhì)大量生長繁殖，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的假單胞菌具有更強的致腐能力。在后續(xù)研究中可進一步探究假單胞菌酶活影響牛肉品質(zhì)劣變的具體機制，探究降低假單胞菌的酶活性、減弱假單胞菌對牛肉的利用能力以及控制假單胞菌數(shù)量的方法，以遏制假單胞菌對冷鮮牛肉的腐敗能力，從而有效延長牛肉的貨架期。