5種多酚類化合物提高紫甘藍(lán)花色苷熱穩(wěn)定性及輔色機理初探

孫晨晨，高慶超，李亞輝，張志勇，王樹林，梁穎*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016）

（2.江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，江蘇南京 210014）

紫甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.）在我國種植范圍廣、產(chǎn)量大，深受消費者歡迎。紫甘藍(lán)中含有大量花色苷（Anthocyanin）[1]，花色苷是以花青素通過糖苷鍵與糖基結(jié)合形成的一種多酚類化合物[2]?；ㄉ蘸卸鄠€酚羥基結(jié)構(gòu)，具有良好的抗氧化活性[3]，如清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化[4]，同時具有預(yù)防腫瘤[5]、抗炎殺菌[6,7]、調(diào)節(jié)血糖[8]、保護心腦血管[9,10]等生理活性功能，被用于食品、制藥、化妝品等多個領(lǐng)域[11,12]。由于花色苷結(jié)構(gòu)中的酚羥基十分活潑，導(dǎo)致其穩(wěn)定性差，在加工、貯藏過程中容易受溫度、pH、氧氣、酶、金屬離子、抗壞血酸、二氧化硫、糖及其降解產(chǎn)物等的影響[13,14]，降解并形成無色或棕色化合物，進而限制了其在各個領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，如何提升花色苷穩(wěn)定性受到廣泛關(guān)注。

提高花色苷穩(wěn)定性的研究主要集中在化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾[2,15]、微膠囊技術(shù)[16]和分子輔色[17]方面。其中，添加多酚類化合物作為輔色劑來提高花色苷穩(wěn)定性的同時，還可以發(fā)揮多酚類化合物天然抗氧化劑作用，對人體健康具有多種益處。已有較多研究報道了多酚類化合物在各種果汁和果酒花色苷輔色中的應(yīng)用[18,19]，但圍繞蔬菜尤其是紫甘藍(lán)花色苷輔色作用的研究極少。

紫甘藍(lán)花色苷含量豐富、來源廣、成本低，本文以紫甘藍(lán)花色苷為原料，選取已有報道可能在花色苷輔色中有較好效果的多酚化合物，包括兒茶素、沒食子酸、香蘭素、山奈酚、槲皮素為輔色劑，研究其對紫甘藍(lán)花色苷的輔色作用及熱穩(wěn)定性的影響，并通過熱力學(xué)參數(shù)對其輔色機理進行初步研究，以期為實際應(yīng)用中紫甘藍(lán)花色苷穩(wěn)定性提升提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘藍(lán)，購于江蘇南京蘇果超市，新鮮、清潔、無損傷。AB-8大孔樹脂，北京康林科技有限責(zé)任公司；兒茶素、沒食子酸、香蘭素、山奈酚、槲皮素，成都曼斯特生物科技有限公司；檸檬酸、NaH2PO4、乙醇（AR）、鹽酸，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GO酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司；HHSY21-Ni4恒溫水浴鍋，北京市精科華瑞儀器有限公司；LABCONCO真空冷凍干燥機，美國Labconco公司；JYL-C051粉碎機，九陽股份有限公司；超聲波清洗儀，北京中晟銘科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫甘藍(lán)花色苷提取及純化

紫甘藍(lán)花色苷的提取方法參考潘穎等[20]并優(yōu)化。紫甘藍(lán)切塊后放入破碎機，加干冰后勻漿，按照料液比1:20加60%的酸化乙醇（0.1% HCl，pH 2.0），在功率500 W、40 ℃下超聲提取40 min，抽濾得到紫甘藍(lán)花色苷粗提液。花色苷粗提液在 40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，使用大孔樹脂進行純化[21]，純化后的紫甘藍(lán)花色苷提取液經(jīng) 40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，-80 ℃冰箱中預(yù)凍24 h后，使用冷凍干燥機冷凍干燥，得到紫甘藍(lán)花色苷粉末。

1.3.2 紫甘藍(lán)花色苷總含量測定

采用pH示差法[22]測定紫甘藍(lán)花色苷的總含量，取一定量的待測樣，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液將樣品配置成0.1 mg/mL的溶液，平衡10 min后，以純水為空白，分別測定樣液在最大吸收波長 530 nm處和無吸收波長700 nm下的吸光值，按照（1）方程計算花色苷總含量。

式中：

M——紫甘藍(lán)花色苷的含量，%；

MW——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的分子量，449.2 g/mol；

L——光程長，1 cm；

ε——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900 L/(mol·cm)；

c——紫甘藍(lán)花色苷的濃度，mg/mL。

1.3.3 多酚化合物對紫甘藍(lán)花色苷輔色作用

1.3.3.1 輔色劑濃度對紫甘藍(lán)花色苷輔色效果的影響

根據(jù)方程（1），純化后的紫甘藍(lán)花色苷中花色苷的含量為 11.77%。使用 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=3.0）分別配制1 mg/mL的紫甘藍(lán)花色苷溶液和0.025 mol/L的輔色劑溶液（香蘭素、沒食子酸、兒茶素）。由于槲皮素和山奈酚不溶于水，溶于酒精，故使用無水乙醇配制成0.025 mol/L的溶液。取1.0 mL紫甘藍(lán)花色苷溶液于試管中，分別添加一定量的輔色劑溶液，添加不同pH的檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為3.0并定容至10 mL，使紫甘藍(lán)花色苷的濃度為0.1 mg/mL，輔色劑濃度分別為0.001、0.002、0.004、0.008、0.01 mol/L，以添加等體積檸檬酸緩沖液為對照，并將溶液pH調(diào)整至一致?；靹蚝蟮娜芤悍胖迷谑覝叵卤芄馄胶?.5 h，隨后使用酶標(biāo)儀測定其在400～800 nm范圍內(nèi)的可見光吸收光譜，分析添加不同濃度的輔色劑后樣品的最大吸收波長變化和在最大吸收波長處的吸光值，并計算增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)值。

1.3.3.2 輔色劑種類對紫甘藍(lán)花色苷輔色效果的影響

取 1.0 mL的紫甘藍(lán)花色苷溶液于試管中，按照1.3.3.1的結(jié)果分別添加不同濃度的兒茶素、沒食子酸、香蘭素溶液、山奈酚、槲皮素溶液，添加不同pH的檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的 pH為 3.0并定容至 10 mL，以添加等體積檸檬酸緩沖液為對照，并將溶液pH調(diào)整至一致。溶液混勻后放置在室溫下避光平衡2.5 h，使用酶標(biāo)儀測定其在400～800 nm范圍內(nèi)可見光吸收光譜，分析添加不同輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷的輔色效果。

1.3.3.3 不同輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷熱穩(wěn)定性的影響

選取 70 ℃、80 ℃、90 ℃不同溫度研究花色苷的熱穩(wěn)定性[23,24]。取1.0 mL的紫甘藍(lán)花色苷溶液，按照1.3.3.1的結(jié)果分別添加不同濃度的兒茶素、沒食子酸、香蘭素溶液、山奈酚、槲皮素溶液，添加不同pH的檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液的pH為3.0并定容至10 mL，以添加等體積檸檬酸緩沖液為對照，并將溶液pH調(diào)整至一致。溶液混勻后室溫避光平衡2.5 h后，分別放置在不同溫度的水浴鍋中，每隔1 h取出，紫外分光光度計測定其在最大吸收波長處的吸光值，測5 h，分析不同溫度下不同輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷熱穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 多酚化合物對紫甘藍(lán)花色苷輔色作用機理

輔色作用熱力學(xué)數(shù)據(jù)參考 Malaj等[25]的方法計算，并稍作修改。

平衡常數(shù)（K）、吉布斯自由能（ΔG）、焓變（Δ H）、和熵變（ΔS）通過以下公式計算：

式中：

A0——輔色前溶液在530 nm處的吸光值；

A——輔色后溶液在530 nm處的吸光值；

K——輔色反應(yīng)的平衡常數(shù)；

n——輔色劑與花色苷的化學(xué)計量比；

cp——溶液中輔色劑的濃度；

R——氣體常數(shù)（8.314 J/mol K）；

T——開爾文溫度。

1.3.5 統(tǒng)計分析

每個樣品設(shè)置三個平行，采用Excel和SPSS軟件進行比較分析，測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，實驗數(shù)據(jù)采用ANOVA進行鄧肯式（Duncan’s）差異分析，以p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 輔色劑濃度對紫甘藍(lán)花色苷輔色效果的影響

表1 不同輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷溶液的增色效應(yīng)和紅移效果Table 1 The hyperchromic effect and bathochromic shift of different copigments on purple cabbage anthocyanin

輔色劑對花色苷的輔色作用體現(xiàn)在增色效果和紅移效果兩個方面，增色效應(yīng)即花色苷溶液紫外最大吸收波長下的吸光值變化百分比（%），紅移效應(yīng)即花色苷溶液紫外最大吸收波長增加量（nm）。當(dāng)花色苷溶液發(fā)生紅移現(xiàn)象時，其紫外最大吸收波長變大，花色苷溶液紅色加深；與之相對的，當(dāng)發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象時，其紫外最大吸收波長減小，花色苷溶液紅色變淺或有變藍(lán)的趨勢。增色效應(yīng)和紅移效應(yīng)的值越大，說明輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷的輔色效果越好[26]。選用五種輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷進行輔色，當(dāng)輔色劑濃度分別為0.001、0.002、0.004、0.008、0.01 mol/L時，紫甘藍(lán)花色苷溶液的增色效應(yīng)和紅移效果如表1所示。

由表1可知，在一定濃度范圍內(nèi)，五種輔色劑均對紫甘藍(lán)花色苷溶液有增色效應(yīng)，推斷多酚化合物與紫甘藍(lán)花色苷之間發(fā)生了分子間輔色，兩者以非共價鍵結(jié)合，形成水平或垂直重疊的復(fù)合物，使紫甘藍(lán)花色苷的呈色作用加強[27]。其中兒茶素和沒食子酸隨濃度從0.001 mol/L升高至0.01 mol/L，輔色作用不斷加強，當(dāng)輔色劑濃度達(dá)到0.008 mol/L時，增色效應(yīng)提升變慢；香蘭素的濃度在0.004 mol/L時，增色效果最好，當(dāng)濃度再次提高時，增色效應(yīng)反而減弱；槲皮素和山奈酚在0.001 mol/L時，增色效應(yīng)較強，隨濃度提升，增色效應(yīng)不斷減弱，且其自身溶液呈黃色，導(dǎo)致花色苷降解失去其本身的顏色和特征。兒茶素、沒食子酸和香蘭素均對紫甘藍(lán)花色苷產(chǎn)生了紅移效果，且隨輔色劑濃度的提高，紅移效果不斷加強，推斷“花色苷-輔色劑”分子間形成了上下疊加的π-π共軛現(xiàn)象，產(chǎn)生了氫鍵作用使花色苷極性或電子分布下降，使其在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長紅移。而槲皮素和山奈酚卻呈現(xiàn)出了藍(lán)移效果，表明槲皮素和山奈酚對紫甘藍(lán)花色苷的輔色作用較差，且會促進紫甘藍(lán)花色苷的降解，使其失去原有的特征。Xu等[28]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和山奈酚是葡萄皮花色苷的有效輔色劑，但本實驗中發(fā)現(xiàn)槲皮素對紫甘藍(lán)花色苷的輔色效果較差，這可能是由于葡萄皮中花色苷主要成分為錦葵素-3-O-葡萄糖苷（45.4%）和飛燕草素-3-O-葡萄糖苷（16.1%）[29]，而紫甘藍(lán)花色苷主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷[30,31]，主要花色苷種類不同、結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致其輔色效果產(chǎn)生差別。

因此，結(jié)合不同濃度輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷輔色效果的影響和實際生產(chǎn)中的添加量，在后續(xù)的實驗操作中，兒茶素和沒食子酸的添加濃度選擇 0.008 mol/L，香蘭素的添加濃度選擇0.004 mol/L，而槲皮素和山奈酚則選擇0.001 mol/L。

2.2 輔色劑種類對紫甘藍(lán)花色苷輔色效果的影響

根據(jù)2.1的結(jié)果，在花色苷溶液中添加相應(yīng)濃度的輔色劑，添加不同輔色劑后的紫甘藍(lán)花色苷溶液的吸收光譜如圖1所示。

由圖1可知，五種多酚化合物均提高了紫甘藍(lán)花色苷的最大吸光度（Aλmax），其中，兒茶素對紫甘藍(lán)花色苷的最大吸光度值影響最大，由對照組的0.38升高到了0.50，提高了31.58%，其次是沒食子酸，升高至0.44，提高了15.79%，對吸光度值影響最小的是槲皮素，僅升高至0.40，僅提高了5.26%。因此，本實驗選取的五種多酚類化合物中，對紫甘藍(lán)花色苷輔色效果最好的輔色劑為兒茶素，其次是沒食子酸。

2.3 不同輔色劑對紫甘藍(lán)花色苷熱穩(wěn)定性的影響

根據(jù)2.1的結(jié)果，在花色苷溶液中添加相應(yīng)濃度的輔色劑，混勻室溫避光平衡2.5 h后，在70 ℃、80 ℃、90 ℃三個溫度下加熱5 h，加熱過程中最大吸光值的變化如圖2所示。

從圖2中可以看出，在不同溫度下加熱均會使溶液的吸光值下降，其中，90 ℃時紫甘藍(lán)花色苷溶液的吸光值下降速度最快，70 ℃時下降緩慢，說明紫甘藍(lán)花色苷隨溫度升高穩(wěn)定性變差。與對照組相比，三個溫度下添加五種輔色劑的溶液在加熱5 h過程中，吸光值均高于未添加輔色劑的溶液，說明添加輔色劑對花色苷溶液的增色效果明顯。所有溶液在加熱的第一小時內(nèi)，花色苷溶液的吸光值下降速度較快，隨后下降速度變緩。對比不同加熱溫度發(fā)現(xiàn)，在加熱5 h內(nèi)，兒茶素輔色后的花色苷溶液的吸光值一直最高，其次是沒食子酸，最低的是山奈酚；90 ℃加熱5 h發(fā)現(xiàn)，兒茶素、沒食子酸和香蘭素輔色的花色苷的吸光值變化率分別為 22.88%、29.22%、23.36%，均顯著低于對照組花色苷溶液的吸光值下降率（34.02%）（p＜0.05），而槲皮素和山奈酚輔色的花色苷溶液下降率分別為31.14%和32.81%，對花色苷的熱穩(wěn)定性的影響并不顯著（p＞0.05），說明兒茶素、沒食子酸和香蘭素作為輔色劑可以提高紫甘藍(lán)花色苷的熱穩(wěn)定性，延緩花色苷在加熱時的降解，而槲皮素和山奈酚雖然對花色苷起到了一定的增色效應(yīng)，但對其熱穩(wěn)定性的影響并不顯著（p＞0.05）。Chung等[32]研究香蘭素、沒食子酸表沒食子兒茶素、原兒茶醛和兒茶素抑制模型飲料花色苷褪色的潛力時發(fā)現(xiàn)，添加以上多酚類化合物對紫胡蘿卜花色苷均有輔色效果，且顯著延緩了加熱時和儲藏過程中花色苷溶液的褪色。因此，根據(jù)輔色效果和熱穩(wěn)定性結(jié)果，后續(xù)選擇兒茶素、沒食子酸和香蘭素進行后續(xù)輔色機理的研究。

2.4 熱力學(xué)數(shù)據(jù)分析

熱力學(xué)研究的目的是判定輔色反應(yīng)發(fā)生的可能性或反應(yīng)是否能夠自發(fā)進行。通過計算平衡常數(shù)K、吉布斯自由能ΔG、焓變值ΔH、熵變值ΔS來預(yù)測花色苷與輔色劑之間反應(yīng)、結(jié)合等能量交換過程，進而了解輔色反應(yīng)的機制。根據(jù)ln[(A-A0)/A0]與ln[cp]進行直線擬合的截距求出K值ln[(A-A0)/A0]與溫度的倒數(shù)（1/T）進行擬合的斜率求出焓變值ΔH，再通過公式進一步計算得出吉布斯自由能ΔG、熵變值ΔS。結(jié)果如表2所示。

輔色作用中花色苷與輔色劑間關(guān)聯(lián)的強度由平衡常數(shù)K值反映[33]，如表所示，不同的輔色反應(yīng)體系K值不同，兒茶素輔色組的K值最大，香蘭素輔色組的K值最小，表明兒茶素與紫甘藍(lán)花色苷之間的關(guān)聯(lián)最強，更容易與紫甘藍(lán)花色苷結(jié)合發(fā)生輔色反應(yīng)，香蘭素最弱，這與輔色效果的結(jié)論一致。不同輔色劑產(chǎn)生了不同的輔色效果的原因可能是輔色劑結(jié)構(gòu)的不同。吉布斯自由能ΔG被看作影響反應(yīng)過程的熱力學(xué)勢能，ΔG小于0，表明輔色反應(yīng)的過程是自發(fā)進行的[34]。焓變值ΔH取決于反應(yīng)環(huán)境的溫度，三種輔色劑與紫甘藍(lán)花色苷的輔色反應(yīng)體系ΔH均小于0，說明輔色劑與花色苷的相互作用的過程均是放熱的，這一結(jié)果進一步解釋了為什么在較低溫度下有利于輔色反應(yīng)的進行。熵變值ΔS小于0，表示反應(yīng)體系的均勻度降低[35]，生成了更加穩(wěn)定和有序的結(jié)構(gòu)[34]，體系穩(wěn)定性得到加強，這與2.3中熱穩(wěn)定性的結(jié)果一致。如表2所示，ΔS與ΔH變化一致，說明輔色劑與紫甘藍(lán)花色苷的結(jié)合越緊密，自由度的損失就越多[36]，體系穩(wěn)定性越高。在類似的研究中，阿魏酸對紅莓果實中花色苷的輔色、單寧酸和綠原酸對楊梅花色苷的輔色作用中也得到了相似的結(jié)論[37,38]。

表2 反應(yīng)平衡常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)Table 2 The equilibrium constant and thermodynamic parameters of reaction

3 結(jié)論

本研究選用五種多酚化合物包括兒茶素、沒食子酸、香蘭素、槲皮素、山奈酚，通過輔色效果及熱穩(wěn)定性影響評價其對紫甘藍(lán)花色苷穩(wěn)定性的作用。結(jié)果表明，五種多酚化合物對紫甘藍(lán)花色苷均具有輔色作用，兒茶素和沒食子酸在0.001 mol/L～ 0.01 mol/L范圍內(nèi)，隨輔色劑濃度的提高，輔色效果不斷加強，香蘭素濃度為0.004 mol/L時輔色效果最佳，隨濃度提升，輔色效果降低；五種多酚類輔色劑中兒茶素輔色效果最好，增色效果達(dá)到了31.58%，其次是沒食子酸，為 15.79%，槲皮素和山奈酚對紫甘藍(lán)的輔色效果較差；隨槲皮素和山奈酚的添加濃度上升會使紫甘藍(lán)花色苷產(chǎn)生藍(lán)移效果，促進紫甘藍(lán)花色苷溶液的降解，使其失去原有的特征。在70 ℃、80 ℃、90 ℃下加熱紫甘藍(lán)花色苷溶液發(fā)現(xiàn)隨溫度升高，花色苷的降解速率不斷加快，加入輔色劑后提升了花色苷溶液的穩(wěn)定性，其中，沒食子酸對于紫甘藍(lán)花色苷的熱穩(wěn)定性效果最好，將花色苷的降解率從34.02%降低至22.88%。熱力學(xué)研究結(jié)果表明，三種輔色劑作用的吉布斯自由能ΔG值均小于0，表明輔色作用為自發(fā)進行的反應(yīng)；而焓變值ΔH為負(fù)值，表明輔色作用是放熱的過程；熵變值ΔS小于0，表示反應(yīng)體系的均勻度降低，增強了體系的穩(wěn)定性。其中，兒茶素與紫甘藍(lán)花色苷輔色反應(yīng)的平衡常數(shù)K值最大，說明兒茶素與紫甘藍(lán)花色苷的輔色反應(yīng)更容易進行。關(guān)于多酚類化合物對花色苷分子結(jié)構(gòu)與輔色效果的關(guān)系及輔色機理還有待進一步深入探究。通過本研究發(fā)現(xiàn)兒茶素、沒食子酸和香蘭素均可以作為紫甘藍(lán)花色苷的輔色劑，在實際生產(chǎn)中提高紫甘藍(lán)花色苷的穩(wěn)定性，其中兒茶素輔色效果最佳。兒茶素作為茶多酚中重要的多酚類化合物，在茶類飲料中含量豐富，且安全性高于化學(xué)合成的輔色劑，且具有多種生物活性，作為紫甘藍(lán)花色苷的輔色劑具有十分廣闊的發(fā)展前景。