分子動(dòng)力學(xué)模擬與熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相結(jié)合分析乙酰氨基葡萄糖與脂肪酶的相互作用機(jī)制

鄭敦錦，沈銳鋒，何康平，羅佳偉，陳胤熹，黃嘉惠，余潔婷，鄭少鵬，古偉明,4，曹詩(shī)林*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東佛山 528225）（2.廣東省食品智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528225）（3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510640）（4.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州 510006）

南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）是目前被重點(diǎn)研究的一類(lèi)酯催化劑[1]。CaLB具有底物特異性、專(zhuān)一性，作用條件溫和的通性，但與其它脂肪酶相比，CaLB具有更寬泛的溫度及 pH值穩(wěn)定性。CaLB可催化酯化、水解、聚合等反應(yīng)[2]，因此被廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥[3]、紡織[4]等領(lǐng)域。但游離酶存在結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易失活的缺點(diǎn)，限制了其在工業(yè)化上的推廣應(yīng)用。據(jù)報(bào)道，糖類(lèi)物質(zhì)在環(huán)境脅迫下（低溫、干燥等）可對(duì)生物質(zhì)材料起到保護(hù)性作用[5]。因此，可加入某些糖類(lèi)物質(zhì)作為保護(hù)劑提升游離CaLB的穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏性能。目前，可作為酶保護(hù)劑的糖類(lèi)包括海藻糖[6]、殼寡糖[7]、甲殼素[8]、羧甲基纖維素[9]、果糖[10]等，不同糖類(lèi)對(duì)生物質(zhì)材料的保護(hù)作用各有差異。

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl glucosamine，GlcNAc）是許多重要多糖（幾丁質(zhì)和殼聚糖）的基本組成單位，主要存在于真菌、細(xì)菌以及動(dòng)植物體內(nèi)[11]，尤其是在甲殼類(lèi)生物的外骨骼含量最高[12]。GlcNAc易溶于水，具有消炎[13]、抗腫瘤[14]以及抗氧化[15]等生物活性，且對(duì)維持生物體正常生理功能具有顯著作用[16]。然而，目前尚未有報(bào)道研究乙酰氨基葡萄糖對(duì)游離CaLB的保護(hù)機(jī)制及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

分子動(dòng)力學(xué)模擬能夠從分子水平上[17]模擬蛋白的結(jié)構(gòu)[18]以及與其他物質(zhì)間的相互作用[19]。本文通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬[20]與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法研究了南極假絲酵母脂肪酶 B（CaLB）與乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）裝配體的構(gòu)象，考察了CaLB與GlcNAc之間的作用機(jī)制對(duì)脂肪酶熱穩(wěn)定性的影響規(guī)律。CaLB與不同濃度GlcNAc混合生成CaLB-GlcNAc溶液混合物模型，分子動(dòng)力學(xué)模擬后得到較理想的組裝體模型，通過(guò)分析CaLB總體構(gòu)象的變化，然后進(jìn)行熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證分子模擬的結(jié)果。本文所建立的分子模擬方法及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法，可以為研究其它酶與糖類(lèi)物質(zhì)的作用機(jī)制提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 研究材料

可表達(dá)南極假絲酵母脂肪酶B的畢赤酵母菌株：由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建并保藏。

本實(shí)驗(yàn)室保存的南極假絲酵母脂肪酶B（CaLB）表達(dá)質(zhì)粒CaLB-HisTag-pPICZαA，該質(zhì)粒表達(dá)的酶的序列為：EFLVPRGSLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTC QGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQ LGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYA GSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVD RLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTT GSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVS NSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTS QFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPAN DLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLM PYARPFAVGKRTCSGIVTPLVPRGSFLEQKLISEEDL HHHHHH。

乙酰氨基葡萄糖，購(gòu)自湖北興恒業(yè)科技有限公司；棕櫚酸對(duì)硝基苯酯，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH 7.5），購(gòu)自源葉生物科技有限公司。

1.2 數(shù)據(jù)分析與作圖相關(guān)軟件

采用Modeller軟件[21-22]對(duì)CaLB進(jìn)行同源建模和模型優(yōu)化，在線平臺(tái)（https://mag.liulianpisa.top/login）與 UCLA-DOE的 SAVES服 務(wù) 器（https://servicesn.mbi.ucla.edu/SAVES/）對(duì)模型進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。Packmol軟件[23]生成不同濃度的 CaLBGlcNAc模型，Gromacs 2019.1軟件[24]對(duì)模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，Pymol軟件顯示模型的三維結(jié)構(gòu)。熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)由酶標(biāo)儀輸出。

1.3 研究方法

1.3.1 CaLB同源建模與模型評(píng)估

首先，在 NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上獲得南極假絲酵母脂肪酶 B（CaLB）（ID:1TCA）的氨基酸序列作為主要結(jié)構(gòu)模板，然后應(yīng)用BLAST工具對(duì)目標(biāo)模板進(jìn)行序列比對(duì)，當(dāng)模板與目的蛋白的序列相似度大于 30%時(shí)，利用Modeller[21,22]進(jìn)行同源建模和模型優(yōu)化。

將優(yōu)化后的模型放置于在線平臺(tái)上獲得拉氏圖，再使用UCLA-DOE的SAVES服務(wù)器的Verify_3D模塊進(jìn)行評(píng)分，二者同時(shí)對(duì)同源建模的模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬研究方法

分子動(dòng)力學(xué)模擬使用Gromacs 2019.1軟件[24]進(jìn)行分析。分子動(dòng)力學(xué)模擬分析的具體過(guò)程如下：首先，通過(guò)Packmol軟件[23]將CaLB分別置于大小為11、10、9 nm的長(zhǎng)方體模擬盒中心，然后將數(shù)量不同的GlcNAc及水分子填充到相應(yīng)的模擬盒中，得到不同濃度（250、500、750、1000 mmol/L）的CaLB-GlcNAc模型。為保持盒子的總電荷數(shù)為 0，對(duì)各個(gè)模型進(jìn)行電中性處理。采用Amber 03力場(chǎng)，先將體系進(jìn)行能量最小化（EM）處理，然后進(jìn)行100 ps的約束溶質(zhì)分子平衡模擬（NVT、NPT）處理，游離 CaLB在303.15～323.15 K具有良好的熱穩(wěn)定性，故最后將各個(gè)模型在323.15 K下進(jìn)行100 ns的無(wú)約束恒溫分子MD模擬。待模型平衡后，輸出模擬數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.3.3 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將CaLB酶樣品分別加入0、250、500、750、1000 mmol/L的乙酰氨基葡萄糖溶液，獲得CaLB-GlcNAc混合溶液；然后，將游離CALB酶液及混合溶液分別置于60、70、80 ℃水浴鍋中熱處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，隨后測(cè)試酶活性。

酶活性測(cè)試方法[25]如下：200 μL緩沖液與25 μL酶液混合，加入25 μL底物溶液后，立即讀取410 nm波長(zhǎng)下0～5 min的吸光值，并以該過(guò)程變化曲線的斜率來(lái)表征相對(duì)酶活，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 南極假絲酵母脂肪酶B與乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）組裝分析

勢(shì)能分析：分析了 0～100 ns模擬中 CaLB與GlcNAc之間的靜電和Lennard-Jones相互作用。氫鍵、溶劑可達(dá)面積（SASA）分析：對(duì)0～100 ns范圍內(nèi)的CaLB-溶劑和CaLB-GlcNAc進(jìn)行氫鍵數(shù)和SASA分析，并計(jì)算了GlcNAc濃度從0增加至1000 mmol/L，酶與GlcNAc之間的氫鍵數(shù)變化情況和蛋白可及面積的變化情況。

1.4.2 南極假絲酵母脂肪酶B總體構(gòu)象變化

均方根波動(dòng)（RMSF）分析：為研究 GlcNAc對(duì)CaLB柔韌性的影響，對(duì)CaLB和CaLB-GlcNAc的每個(gè)殘基對(duì)計(jì)算平均RMSF。均方根（Root-mean-square deviation，RMSD）分析：計(jì)算游離酶模型及CaLB-GlcNAc模型的RMSD，研究GlcNAc對(duì)脂肪酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。

1.4.3 不同溫度下CALB與乙酰氨基葡萄糖的熱穩(wěn)定性

相對(duì)酶活力分析：將游離CaLB酶液（Free-CaLB）及GlcNAc-CaLB混合液置于60、70、80 ℃溫度下，分別熱處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，之后以棕櫚酸對(duì)硝基苯酯以底物測(cè)定二者的相對(duì)酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 模型評(píng)估結(jié)果

2.1.1 Ramanchandran Plot（拉氏圖）評(píng)價(jià)

拉氏圖是通過(guò)蛋白中非鍵合原子間最小接觸距離來(lái)評(píng)價(jià)兩個(gè)相鄰肽單位骨架構(gòu)象是否合理，并以此得出蛋白的允許和不允許區(qū)域，位于允許區(qū)域的氨基酸數(shù)應(yīng)占總氨基酸數(shù)的95%以上[26]。圖1中的藍(lán)色區(qū)域?yàn)椤白钸m區(qū)”，位于該區(qū)域的氨基酸數(shù)量越多，則模型的可信度越大；紫色區(qū)域?yàn)椤霸试S區(qū)”；白色區(qū)域?yàn)椤安辉试S區(qū)”，該區(qū)域的氨基酸是為構(gòu)象不合理的氨基酸，需要進(jìn)行優(yōu)化，且該區(qū)域的氨基酸數(shù)應(yīng)小于 5%，否則模型的可信度低。對(duì)圖1進(jìn)行數(shù)據(jù)輸出可知：該模型的氨基酸總數(shù)為349個(gè)，其中位于不允許區(qū)域的氨基酸數(shù)為10個(gè)，占比約為2.87%＜5%，證明該模型的可信度較高。

2.1.2 Verify_3D評(píng)價(jià)

模型的三維結(jié)構(gòu)（3D）與氨基酸一級(jí)序列（1D）的相容性可以通過(guò)Verify_3D可分析，進(jìn)而分析模型側(cè)鏈構(gòu)象的合理性[27]。一般而言，超過(guò)80%氨基酸殘基的平均3D-1D分?jǐn)?shù)≥0.2的模型是可行的，圖2表示CaLB蛋白模型中有80.22%氨基酸殘基的3D-1D分?jǐn)?shù)≥0.2，且大部分的殘基 Verify_3D 評(píng)分＞0，表明該模型的側(cè)鏈構(gòu)象良好，可信度較高。

2.2 CaLB和GlcNAc自組裝過(guò)程分析

2.2.1 L-J勢(shì)能和靜電勢(shì)能分析

為了研究CaLB與GlcNAc在溶液中的相互作用，分析了323.15 K下CaLB與不同濃度GlcNAc（250、500、750、1000 mmol/L）的靜電和Lennard-Jones勢(shì)能（圖 3）。結(jié)果顯示，CaLB-GlcNAc的靜電勢(shì)能與L-J勢(shì)能在前20 ns模擬時(shí)間中顯著降低。此外，隨著GlcNAc濃度的升高，靜電勢(shì)能與 L-J勢(shì)能下降值增大。CaLB-250 mmol/L-GlcNAc（圖3a）模型在0～100 ns模擬過(guò)程中，靜電勢(shì)能下降了3350 kJ/mol，L-J勢(shì)能下降了2791 kJ/mol。1000 mmol/L（圖3d）的模擬盒在 0～100 ns模擬過(guò)程中，靜電勢(shì)能下降了 4992 kJ/mol，L-J勢(shì)能下降了4340 kJ/mol。結(jié)果表明，CaLB與GlcNAc存在靜電作用和L-J作用，且?guī)靵鲎饔寐愿哂贚-J作用。

2.2.2 氫鍵分析

各模型的模擬時(shí)間為0 ns時(shí)，蛋白與溶劑的氫鍵數(shù)（HBN）約為500，蛋白與GlcNAc的HBN約為0。比較各模型平衡后的氫鍵數(shù)據(jù)可知：當(dāng)GlcNAc濃度增加500 mmol/L時(shí)，蛋白與GlcNAc之間的氫鍵數(shù)逐步增加到115，GlcNAc濃度從500 mmol/L增加至1000 mmol/L時(shí)，二者之間的 HBN變化不顯著。表明250～500 mmol/L濃度的GlcNAc足以覆蓋蛋白的表面并與其形成氫鍵作用。此外，觀察圖 4可知，隨著GlcNAc濃度的增加，蛋白與溶劑間的HBN從500下降至300左右，而GlcNAc與CaLB之間的HBN則從0上升至150左右，表明GlcNAc與CaLB之間形成的氫鍵能取代部分CaLB與溶劑間的氫鍵。

2.2.3 CaLB和GlcNAc溶劑可及面積（SASA）分析

分析蛋白溶劑可及面積（SASA）的數(shù)據(jù)，如圖5。比較各模型的平衡之后的蛋白SASA數(shù)據(jù)可知：模擬時(shí)間為20 ns時(shí)，GlcNAc濃度從0增至500 mmol/L，蛋白的SASA從160下降至50 nm2，當(dāng)GlcNAc濃度增至750 mmol/L與1000 mmol/L，蛋白的SASA在30～40 nm2。因此，蛋白SASA的數(shù)據(jù)表明，在GlcNAc濃度在500 mmol/L時(shí)，GlcNAc已經(jīng)充分占據(jù)了酶分子的表面,與氫鍵數(shù)量分析的結(jié)果相一致。

2.3 CaLB與GlcNAc組裝體的整體構(gòu)象

2.3.1 均方根偏差（RMSD）分析

分析模型的均方根偏差（RMSD）可以揭示GlcNAc對(duì)脂肪酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。如圖6所示，在323.15 K下，游離酶模型（Free-CaLB）平衡后的RMSD約為 0.2617 nm，其余四個(gè)不同濃度的CaLB-GlcNAc模型的RMSD數(shù)值均小于Free-CaLB模型的RMSD數(shù)值。

表1 Free-CaLB-SOL與不同濃度GlcNAc最后10 ns的RMSD平均值數(shù)據(jù)分析表（353.15 K）Table 1 The last 10 ns RMSD average data analysis table of Free-CaLB-SOL and different concentrations of GlcNAc(353.15 K)

在323.15 K的基礎(chǔ)上，對(duì)Free-CaLB與250、500、750、1000 mmol/L的CaLB-GlcNAc模型進(jìn)行了升溫至353.15 K的處理，分析模型最后10 ns的RMSD來(lái)表征升溫后GlcNAc對(duì)脂肪酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響及探究CaLB的熱穩(wěn)定性。結(jié)果如表1所示，在353.15 K溫度下，CaLB-GlcNAc模型的 RMSD數(shù)值均小于Free-CaLB的RMSD數(shù)值（0.3473 nm），揭示GlcNAc在353.15 K的條件下，仍可有效維持酶的原始結(jié)構(gòu)，并提高其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2.3.2 均方根波動(dòng)（RMSF）分析

為了研究GlcNAc對(duì)CaLB結(jié)構(gòu)柔性的影響，圖7對(duì)比分析了Free-CaLB與不同濃度的CaLB-GlcNAc均方根波動(dòng)（RMSF）數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，各殘基的RMSF在Free-CaLB和CaLB-GlcNAc組裝體中表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。進(jìn)一步分析323.15 K時(shí)模擬盒的RMSF數(shù)據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Free-CaLB模型中（Val 147-Leu 155）區(qū)域的波動(dòng)較大，而CaLB-GlcNAc組裝體模型在該區(qū)域的波動(dòng)卻有所減弱，表明（Val 147-Leu 155）區(qū)域在CaLB-GlcNAc組裝體中的結(jié)構(gòu)柔性較Free-CaLB弱。

2.3.3 不同溫度下CALB與GlcNAc的熱穩(wěn)定性分析

為了驗(yàn)證 CaLB-GlcNAc模型的模擬效果，進(jìn)行了CaLB與不同濃度GlcNAc的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，CaLB-GlcNAc熱穩(wěn)定性要優(yōu)于游離酶，并且隨著GlcNAc濃度增加，CaLB在不同溫度熱處理時(shí)的酶活保留率相對(duì)增加。此外，由圖8a所示，游離CaLB在60 ℃熱處理0.5 h后，其相對(duì)酶活力僅剩37.21%，而與濃度為750～1000 mmol/L的GlcNAc共同作用的CaLB，其相對(duì)酶活力保留＞90%；在該溫度下熱處理2.0 h后，游離CaLB的相對(duì)酶活力僅剩22.26%，而750～1000 mmol/L GlcNAc溶液中的CaLB活性依舊保持有 52.11%?？梢?jiàn)，在溶液中，加入GlcNAc可有效提高CaLB的熱穩(wěn)定性，這與分子模擬的結(jié)果具有一定的吻合之處。

2.3.4 討論

乙酰氨基葡萄糖是一種功能性糖，但目前關(guān)于乙酰氨基葡萄糖與脂肪酶相互作用的分子動(dòng)力學(xué)模擬及熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究鮮有報(bào)道。N-乙酰氨基葡萄糖經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接形成甲殼素，甲殼素脫去乙?；敖到夂笮纬蓺す烟牵∣CTS），因此，乙酰氨基葡萄糖與殼寡糖都屬于甲殼素衍生物的范疇。楊寶燕[28]使用分子動(dòng)力學(xué)模擬方法研究了殼寡糖與南極假絲酵母脂肪酶B的相互作用機(jī)制，模擬結(jié)果顯示：CaLB與OCTS之間存在靜電相互作用和氫鍵相互作用，并且 CaLB與OCTS之間的氫鍵數(shù)量增加，CaLB與OCTS之間的SASA明顯降低，使得脂肪酶被殼寡糖包裹住，從而使脂肪酶的蛋白結(jié)構(gòu)變穩(wěn)定，但殼寡糖在實(shí)驗(yàn)中是否能夠提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步研究。

相比之下，本文不但從分子動(dòng)力學(xué)模擬的角度分析了GlcNAc與CaLB之間的氫鍵數(shù)、SASA的變化情況等來(lái)研究脂肪酶與乙酰氨基葡萄糖之間的相互作用機(jī)制，進(jìn)一步通過(guò)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證，結(jié)果顯示：乙酰氨基葡萄糖可以提高南極假絲酵母脂肪酶B的熱穩(wěn)定性，這與分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)論具有一定的吻合性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬及實(shí)驗(yàn)論證方法研究了南極假絲酵母脂肪酶B與乙酰氨基葡萄糖的相互作用及酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。分子動(dòng)力學(xué)模擬勢(shì)能與氫鍵分析表明：CaLB與GlcNAc之間的組裝過(guò)程存在靜電作用和L-J作用，并且隨著GlcNAc濃度的增加，蛋白與GlcNAc之間的HBN增加（由0增至115），取代了CaLB與溶劑間的部分氫鍵。此外，當(dāng) GlcNAc的濃度為250～500 mmol/L時(shí)，GlcNAc足以覆蓋蛋白的表面與其形成氫鍵作用。RMSD、RMSF和 SASA數(shù)據(jù)表明：不同濃度的 CaLB-GlcNAc模型波動(dòng)程度明顯小于Free-CaLB模型，且當(dāng)GlcNAc濃度為500 mmol/L時(shí)，酶分子的表面已被GlcNAc充分覆蓋（此時(shí)的SASA由160下降到40 nm2），這表明GlcNAc可有效維持脂肪酶的原始結(jié)構(gòu)。CaLB與GlcNAc的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)也表明了GlcNAc可以有效維持CaLB的天然結(jié)構(gòu)并提高其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。