牛奶發(fā)酵過程中阪崎克羅諾桿菌可形成活的非可培養(yǎng)狀態(tài)

曹怡芳，周愛蓮，白泓，余以剛，肖性龍

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

阪崎克羅諾桿菌，原名阪崎腸桿菌，隸屬于腸桿菌科克羅諾桿菌屬，是一種革蘭氏陰性、無芽孢形成的兼性厭氧細(xì)菌[1,2]。感染阪崎克羅諾桿菌會導(dǎo)致新生兒腦膜炎、小腸結(jié)腸炎，甚至?xí)斐尚律鷥?、老年人和免疫功能低下人群的死亡[3,4]。已經(jīng)從牛奶、嬰幼兒配方奶粉、奶酪以及奶牛場等環(huán)境中分離出阪崎克羅諾桿菌[5-7]。為了預(yù)防阪崎克羅諾桿菌引起的相關(guān)疾病，需要更好地了解該菌在牛奶及奶制品生產(chǎn)加工或貯存過程中的生長狀態(tài)，以便采取合適的控制措施確保乳制品的安全問題。

已經(jīng)有一些研究報道了阪崎克羅諾桿菌在乳制品生產(chǎn)加工或貯存過程中的生存情況。Kim等[8]研究了含有乳酸菌、醋酸菌和酵母的開菲爾酸奶上清對嬰幼兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的抑制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用含 30%開菲爾上清的水沖泡已被污染的奶粉，在室溫下孵育 1 h后平板上未檢測到阪崎克羅諾桿菌的生長。研究發(fā)現(xiàn)可能是發(fā)酵過程中的有機(jī)酸發(fā)揮了作用[9]。Chang等[10]在四種不同品牌的酸奶中接種阪崎克羅諾桿菌和沙門氏菌，并在冷藏條件下保存5 d，結(jié)果表明開菲爾酸奶可以在冷藏過程中完全抑制致病菌的生長。Hayes等[11]將阪崎克羅諾桿菌NCTC 8155接種于復(fù)配嬰幼兒配方奶粉中，然后加入不同濃度的嗜酸乳桿菌DPC 6026發(fā)酵液，實驗結(jié)果顯示較高濃度的發(fā)酵液可以在1 h內(nèi)完全滅活阪崎克羅諾桿菌。Hsiao等[5]將阪崎克羅諾桿菌與嗜熱鏈球菌或保加利亞乳桿菌在脫脂牛奶中混合培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后阪崎克羅諾桿菌活菌數(shù)量顯著減少。研究還發(fā)現(xiàn)原味酸奶加工和貯存過程中 pH值和貯存溫度是影響阪崎克羅諾桿菌存活的主要影響因素[12]。以上研究報道中對阪崎克羅諾桿菌的檢測結(jié)果都基于平板計數(shù)法，但平板計數(shù)法可能會低估活菌數(shù)量。

活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non-culturable，VBNC）是微生物尤其是沒有芽孢的細(xì)菌為了抵御不良環(huán)境時形成的一種休眠狀態(tài)，當(dāng)外界脅迫消除后即可恢復(fù)生長繁殖能力[13,14]。VBNC狀態(tài)的細(xì)菌無法通過常規(guī)的平板培養(yǎng)進(jìn)行檢測。張竟豐等[15]總結(jié)了阪崎克羅諾桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)的主要誘導(dǎo)因素：巴氏殺菌、寡營養(yǎng)、低溫或干燥，但發(fā)酵產(chǎn)酸條件下該菌是否會進(jìn)入VBNC狀態(tài)尚不清楚。但Solomon H. Mariam等[16]的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與乳酸菌進(jìn)行共培養(yǎng)后，李斯特菌或沙門氏菌會進(jìn)入VBNC狀態(tài)，Liu等[17]和Deng等[18]也發(fā)現(xiàn)在啤酒發(fā)酵過程中植物乳桿菌會進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

本研究選取了酸奶發(fā)酵中常用的菌株保加利亞乳桿菌，研究牛奶發(fā)酵過程中阪崎克羅諾桿菌和保加利亞乳桿菌在牛奶中的相互作用，并采用16S rDNA和PMA-qPCR技術(shù)鑒定阪崎克羅諾桿菌是否進(jìn)入VBNC狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

阪崎克羅諾桿菌CICC 21544和保加利亞乳桿菌CICC 6045購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（DeMan-Rogosa-Sharpe，MRS）、細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Lysogeny Broth，LB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），購于廣州環(huán)凱微生物有限公司；阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基（Druggan-Forsythe-Iversen，DFI）、酚酞指示劑，購于青島海博生物技術(shù)有限公司；疊氮溴化丙錠（Propidium monoazide，PMA），購于北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購于北京天根生化科技有限公司；HiPure Soil DNA試劑盒，購于廣州美基生物科技有限公司；無菌脫脂牛奶，購于當(dāng)?shù)夭贩渖徎ǔ小?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

精密pH計，上海雷磁儀器有限公司；立式高壓蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；超凈工作臺，蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；鹵鎢燈（650 W），德國Osram公司；實時熒光定量PCR儀，美國伯樂公司；PCR儀，北京東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；微量分光光度計，賽默飛世爾科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；小型高速離心機(jī)，德國艾本德股份公司；-80 ℃低溫冰箱，山東青島海爾股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株活化

將保存于-80 ℃低溫冰箱的阪崎克羅諾桿菌和保加利亞乳桿菌的甘油保存管取出解凍，用接種環(huán)蘸取后分別在TSA和MRS瓊脂平板上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。分別挑取兩種平板上的單菌落接種于LB和MRS培養(yǎng)基中，待其生長至穩(wěn)定期后離心，用無菌生理鹽水清洗菌體沉淀三次，并用生理鹽水重懸浮得到菌懸液。

1.3.2 阪崎克羅諾桿菌與保加利亞乳桿菌在牛奶中的相互作用

按照1.3.1中的方法制備菌懸液，參照劉文文等[19]的方法，將100 mL牛奶95 ℃熱處理15 min殺菌，冷卻后接種10%的保加利亞乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過程中接種阪崎克羅諾桿菌，使其終濃度為 103CFU/mL。同時接種組樣品，即在接種保加利亞乳桿菌的同時也接種阪崎克羅諾桿菌，發(fā)酵48 h；分開接種組樣品，即在接種保加利亞乳桿菌12 h后再接種阪崎克羅諾桿菌，繼續(xù)發(fā)酵48 h。以牛奶中只接種保加利亞乳桿菌或阪崎克羅諾桿菌為對照組。樣品在37 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每隔8 h取樣測定發(fā)酵過程中牛奶pH值和酸度值的變化，酸度值的測定依照 GB 5009.239-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 乳和乳制品酸度的測定》[20]中的方法進(jìn)行，同時取100 μL適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵牛奶涂布于 DFI用于阪崎克羅諾桿菌活菌計數(shù)。

1.3.3 16S rDNA測序技術(shù)分析阪崎克羅諾桿菌和保加利亞乳桿菌在牛奶發(fā)酵過程中的分布變化情況

按照1.3.2中的方法制備測序樣品，在牛奶中同時接種保加利亞乳桿菌和阪崎克羅諾桿菌，每8 h制一次樣，共培養(yǎng)48 h。每次取樣時將培養(yǎng)物充分振蕩混勻后取適量樣品，立即用液氮速凍5 min后置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用細(xì)菌16S rDNA序列測序?qū)悠分械募?xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。從樣品中提取基因組DNA后，用特異引物對細(xì)菌16S rDNA序列的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列[21]為 341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，之后利用Hiseq2500 PE250上機(jī)測序。

測序得到原始數(shù)據(jù)之后，對低質(zhì)量 reads進(jìn)行過濾，然后進(jìn)行組裝和再過濾。為了研究樣品的物種組成多樣性信息，利用軟件 Uparse對所有樣品的有效tags序列進(jìn)行運(yùn)算分類單位（Operational taxonomic unit，OTU）聚類[22]，默認(rèn)以 97%的一致性將序列聚類成為 OTUs。之后根據(jù)其豐度和序列信息，開展物種注釋、群落多樣性等分析。

1.3.4 PMA-qPCR法檢測牛奶發(fā)酵過程中的阪崎克羅諾桿菌存活狀態(tài)

為了進(jìn)一步驗證在牛奶中與保加利亞乳桿菌共培養(yǎng)后，阪崎克羅諾桿菌的實際存活狀態(tài)，采用 PMA與qPCR結(jié)合的方法進(jìn)行檢測。按照1.3.2的方法制備樣品，以阪崎克羅諾桿菌在牛奶中單獨(dú)培養(yǎng)作為對照，樣品的PMA前處理參照Zhou等[23]優(yōu)化后的方法，選取cgcA作為PCR擴(kuò)增的目的基因，引物設(shè)計參照Hu等[24]的方法。PCR操作步驟參考Richard J. Kibbee等[25]的方法，用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取處理后的樣品DNA，將提取的DNA模板與室溫下溶解好的2X Robust SYBR Green qPCR ProMix、引物和ddH2O按照2:10:0.5:7的比例配制PCR反應(yīng)液，總體積為20 μL。以不加DNA模板的反應(yīng)液作為陰性對照（等量的ddH2O代替）。配制PCR反應(yīng)體系的全過程均在冰上進(jìn)行。按照如下條件設(shè)定Real-Time PCR的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s然后退火至60 ℃保持20 s（收集熒光信號），該過程進(jìn)行40個循環(huán)。

1.3.5 牛奶發(fā)酵過程中阪崎克羅諾桿菌對保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力的影響

原料奶被阪崎克羅諾桿菌污染后再進(jìn)行酸奶發(fā)酵，發(fā)酵菌劑的性能可能會受到影響。本實驗將從保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸能力變化探究阪崎克羅諾桿菌對保加利亞乳桿菌的主要影響。產(chǎn)酸能力的鑒定參照羅強(qiáng)等[26]的方法，向100 mL無菌脫脂牛奶中，分別按5%和2%的接種量接入保加利亞乳桿菌和阪崎克羅諾桿菌，置于 42 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，直至凝乳后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱中存放24 h。取出后按5%的接種量轉(zhuǎn)接于 100 mL新鮮的無菌脫脂牛奶中，同樣42 ℃下發(fā)酵至凝乳后轉(zhuǎn)移至 4 ℃冰箱中儲存。重復(fù)上述操作，每重復(fù)1次算為1代，重復(fù)3次。將1、2、3代混合培養(yǎng)物與原保加利亞乳桿菌作對比，分別按5%的接種量接種到10 mL新鮮的無菌脫脂牛奶中，37 ℃下靜置培養(yǎng)。用pH計每2 h測一次樣品的pH值。保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸能力以單位時間內(nèi)pH值的變化為評價指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel（2016）軟件繪圖，使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，當(dāng)p＜0.05時，表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 阪崎克羅諾桿菌與保加利亞乳桿菌在牛奶中的相互作用

圖1是阪崎克羅諾桿菌和保加利亞乳桿菌在牛奶中共同生長時的pH值、酸度值和阪崎克羅諾桿菌存活量的變化情況圖。由圖1a和1b可以看出，阪崎克羅諾桿菌在牛奶中單獨(dú)生長時對牛奶的pH和酸度值無明顯影響，pH值維持在6.02以上，酸度值維持在27.20以下。而保加利亞乳桿菌在牛奶中單獨(dú)生長時，24 h后pH可達(dá)到3.81，酸度值可達(dá)到133.80，發(fā)酵48 h后pH值可達(dá)到3.40，酸度值可達(dá)212.00。分開接種組樣品中保加利亞乳桿菌在12～20 h的產(chǎn)酸速度明顯快于同時接種組，pH和酸度值分別由 6.13和21.10變?yōu)?.20和93.80。發(fā)酵48 h后，同時接種組樣品pH值和酸度值分別為3.50和193.30；分開接種組樣品pH值和酸度值分別為3.47和214.30；分開接種組樣品的pH和酸度值更接近保加利亞桿菌對照組。

阪崎克羅諾桿菌在牛奶中單獨(dú)生長48 h后菌濃度可穩(wěn)定在9.08 lg(CFU/mL)；與阪崎克羅諾桿菌對照組相比，同時接種組樣品中阪崎克羅諾桿菌的數(shù)量在接種24 h后達(dá)到最大值[8.85 lg(CFU/mL)]，32 h后明顯降低[6.24 lg(CFU/mL)]，40 h后便檢測不到阪崎克羅諾桿菌活菌存在；而分開接種組在接種后8 h達(dá)到最大菌落數(shù)量[5.11 lg(CFU/mL)]，接種24 h后便檢測不到阪崎克羅諾桿菌生長（圖 1c）。結(jié)果說明，在牛奶發(fā)酵過程中，不論在早期還是中期被阪崎克羅諾桿菌污染，其生長均能完全被抑制；但在發(fā)酵中期感染阪崎克羅諾桿菌，該菌的增殖能被更好、更快地抑制。已經(jīng)有研究報道了乳桿菌或其上清液的抑菌活性，Kim等[9]的研究推測可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸營造的酸性環(huán)境發(fā)揮了抑菌作用。Lin等[27]發(fā)現(xiàn)蛋白酶會降低植物乳桿菌上清液的抑菌作用，推測上清液中含有肽類抑菌物質(zhì)。本研究中同時接種組樣品中，阪崎克羅諾桿菌數(shù)量在發(fā)酵24 h后迅速降低，可能與發(fā)酵液中有機(jī)酸和肽類抑菌物質(zhì)的積累有關(guān)。

2.2 16S rDNA高通量測序技術(shù)分析阪崎克羅諾桿菌和保加利亞乳桿菌在牛奶發(fā)酵過程中的分布變化情況

樣品的測序數(shù)據(jù)量和過濾分析效果如圖2所示。去除由于PCR錯誤、測序錯誤等會產(chǎn)生的低質(zhì)量數(shù)據(jù)或者無生物學(xué)意義數(shù)據(jù)（嵌合體）后，剩下的Clean tags用于后續(xù)分析，所占比例均超過93%，滿足后續(xù)分析要求。

微生物物種分類一般分為界、門、綱、目、科、屬、種7個等級，每個OTU代表某類型分類水平集合。Uparse在構(gòu)建OTUs的過程中選取代表性序列組成集合，然后用算法與Green gene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，將置信度的閾值設(shè)定為0.80～1。根據(jù)OTU的物種注釋信息，統(tǒng)計每個樣品在各個分類水平上的tags序列數(shù)目，繪制柱狀圖如圖3所示。

由圖3可知，8 h內(nèi)阪崎克羅諾桿菌在牛奶中可以大量生長，占據(jù)優(yōu)勢菌群位置（32.61%）；發(fā)酵16 h后，阪崎克羅諾桿菌生長受到限制（13.62%），保加利亞乳桿菌成為優(yōu)勢菌群（29.39%），隨著保加利亞乳桿菌發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中保加利亞乳桿菌比例越來越高，阪崎克羅諾桿菌比例越來越低。但與2.1中DFI平板檢測結(jié)果不同的是，阪崎克羅諾桿菌在牛奶中與保加利亞乳桿菌共生48 h后仍能被檢測到，占比為7.17%。因此，此時的阪崎克羅諾桿菌可能處于VBNC狀態(tài)，雖然不能在平板上生長，但利用分子層面的技術(shù)可以檢測出來。16S rDNA高通量測序技術(shù)可以克服傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的缺陷，可以對不可培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行序列檢測，有研究報道了使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，流式細(xì)胞術(shù)和16S rDNA高通量測序技術(shù)監(jiān)測奶粉生產(chǎn)環(huán)境中不同清潔區(qū)域的致病菌污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中等程度清潔區(qū)域可檢測到VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，其中腸桿菌屬占比7.02%[28]。陳燕[29]的研究發(fā)現(xiàn)16S rDNA高通量測序技術(shù)對沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上的藍(lán)綠色菌落，即阪崎克羅諾桿菌的鑒定尤為重要，可為乳品企業(yè)中阪崎克羅諾桿菌的防治、排查及溯源提供依據(jù)。

2.3 PMA-qPCR法檢測阪崎克羅諾桿菌在牛奶發(fā)酵過程中的實際狀態(tài)

表1 PMA-qPCR法檢測牛奶發(fā)酵過程中的阪崎克羅諾桿菌Table 1 Detection of C. sakazakii during milk fermentation by PMA-qPCR

與保加利亞乳桿菌在牛奶中共培養(yǎng)后，PMA-qPCR法檢測阪崎克羅諾桿菌的結(jié)果如表 1所示。從表中可以看出，阪崎克羅諾桿菌在牛奶中單獨(dú)培養(yǎng)時得到的結(jié)果與圖1c中的結(jié)果一致，在16 h后菌落數(shù)量逐漸趨于穩(wěn)定[9.02 lg(CFU/mL)]；而二者同時接種組，共培養(yǎng)40 h后，圖1c中結(jié)果顯示DFI平板上無阪崎克羅諾桿菌生長，而PMA-qPCR仍檢測到活的阪崎克羅諾桿菌的存在，活菌數(shù)大約為 4.30 lg(CFU/mL)。與圖3中16S rDNA得到的結(jié)果一致，證實阪崎克羅諾桿菌確實進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。劉艷艷等[30]的研究建立了PMA-PCR檢測滅菌乳中阪崎腸桿菌的方法，確定了PMA-PCR法檢測活阪崎克羅諾桿菌的可行性。本研究證明牛奶發(fā)酵過程可誘導(dǎo)阪崎克羅諾桿菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)，除此之外，寡營養(yǎng)、低溫或干燥等外界脅迫條件也可以誘導(dǎo)阪崎克羅諾桿菌VBNC狀態(tài)的形成[15]。另外，有研究報道已經(jīng)指出，VBNC狀態(tài)下的阪崎克羅諾桿菌仍會表達(dá)相關(guān)毒力基因（hfp，ompA）[31]，可對食品安全造成潛在隱患。

2.4 阪崎克羅諾桿菌對保加利亞乳桿菌產(chǎn)酸能力的影響

原保加利亞乳桿菌與1、2、3代樣品的產(chǎn)酸能力如表2所示。從表2中可以看出，0 h時各樣品的起始酸度相同，經(jīng)過2 h發(fā)酵后，第3代保加利亞乳桿菌發(fā)酵樣品 pH為 5.92，產(chǎn)酸能力顯著低于原乳桿菌（5.65）（p＜0.05）；經(jīng)過4 h和6 h發(fā)酵后，第2代和第 3代乳桿菌產(chǎn)酸能力均顯著低于原乳桿菌（p＜0.05）；經(jīng)過8 h發(fā)酵后，第3代乳桿菌產(chǎn)酸能力（4.93）也顯著低于原乳桿菌（4.63）（p＜0.05）。楊一沖等[32]對保加利亞乳桿菌的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵的2～6 h酸度上升的較快，pH值降低較快，與表2和圖1a、1b中的結(jié)果是一致的。本研究中，經(jīng)過相同的發(fā)酵時間，阪崎克羅諾桿菌在樣品中存在的時間越長，保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸能力越弱。因此，待發(fā)酵的牛奶被阪崎克羅諾桿菌污染后不僅會對酸奶的安全造成威脅，也會對乳桿菌的產(chǎn)酸能力產(chǎn)生不良影響。

表2 不同樣品的產(chǎn)酸能力Table 2 Acid production capacity of different samples

3 結(jié)論

本文利用保加利亞乳桿菌在牛奶中發(fā)酵對阪崎克羅諾桿菌施加脅迫。平板計數(shù)結(jié)果顯示，不管在牛奶發(fā)酵過程中的前期或中期接種阪崎克羅諾桿菌，其生長都會被抑制。本文還利用16S rDNA高通量測序技術(shù)分析了這兩種菌在牛奶發(fā)酵過程中的分布變化情況。結(jié)果表明，經(jīng)過牛奶發(fā)酵后，雖然平板檢測法檢測不到阪崎克羅諾桿菌，但16S rDNA可以檢測出該菌活菌的存在，故推測經(jīng)發(fā)酵后阪崎克羅諾桿菌可能處于VBNC狀態(tài)。結(jié)合PMA-qPCR法進(jìn)一步證實了與保加利亞乳桿菌在牛奶中共培養(yǎng)后，阪崎克羅諾桿菌確實進(jìn)入VBNC狀態(tài)。本文結(jié)果還顯示，阪崎克羅諾桿菌的存在會削弱保加利亞乳桿菌的產(chǎn)酸能力。酸奶是老少皆宜的乳制品，酸奶生產(chǎn)中使用的有益菌是致病菌的理想抑制劑，特別是乳酸菌對于致病菌的抑制效果已有很多研究報道，但在乳酸菌對致病菌達(dá)到良好抑制效果的同時，應(yīng)始終考慮致病菌是否處于具有復(fù)蘇能力的VBNC狀態(tài)。所以，后續(xù)需要更詳細(xì)的研究來闡明不同環(huán)境條件下致病菌與乳酸菌相互作用時的生長情況，VBNC狀態(tài)的進(jìn)入與復(fù)蘇情況，VBNC狀態(tài)下致病菌的潛在毒力以及食品加工過程中阪崎克羅諾桿菌VBNC狀態(tài)細(xì)胞的防控措施。