一株致皮蛋“爆蛋”的嗜堿菌株分離鑒定及其De nove測(cè)序分析

張昊，楊林杰，張騰飛，孫靜，梁振華，皮勁松，杜金平

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

皮蛋是具有悠久歷史的中國(guó)傳統(tǒng)蛋制品，由鮮鴨蛋經(jīng)5周左右腌制而成，其風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富。皮蛋制作不但延長(zhǎng)了蛋品的保存期，還使其具有抗腸炎[1]、調(diào)控腸道微生物菌群等功能[2]。鴨蛋由蛋殼包裹，蛋清黏度高，且蛋清中含溶菌酶，這些特點(diǎn)可一定程度阻止細(xì)菌的入侵、增殖[3]。但受原料蛋品質(zhì)和加工條件和影響，某些皮蛋加工企業(yè)也會(huì)出現(xiàn)“爆蛋”現(xiàn)象?！氨啊笔怯捎谄さ皟?nèi)壓力增大，超過(guò)蛋殼承載力導(dǎo)致的。皮蛋加工過(guò)程出現(xiàn)“爆蛋”，往往不是單個(gè)蛋品出現(xiàn)，而是整缸或成批出現(xiàn)，對(duì)企業(yè)造成巨大損失。因此，對(duì)皮蛋“爆蛋”進(jìn)行微生物溯源，提出控制“爆蛋”的有效方案具有重要產(chǎn)業(yè)意義。

麥?zhǔn)匣【╒ibrio metschnikovii）是麥契尼可夫弧菌的簡(jiǎn)稱，是一種厭氧/兼性厭氧短桿菌，屬于非 O1群霍亂弧菌，一般不致病[4,5]，于1981年首次分離得到[6]，廣泛存在于污水[7,8]、人畜糞便[9]、水產(chǎn)品[10,11]、河流、海灣[12]和污染的水禽蛋[13]中。由于其分布廣泛、致病力不強(qiáng)，相關(guān)報(bào)道有限。一般認(rèn)為該菌屬嗜鹽性菌，在無(wú)鹽胨水中不能生長(zhǎng)[14]。且該菌不耐低溫，具有耐堿和膽鹽的特征[15]。目前有關(guān)于麥?zhǔn)匣【绊懺僦气喌俺善仿实难芯繄?bào)道較少。

全基因組De novo測(cè)序也稱為從頭測(cè)序，可不依賴參考基因組序列，進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過(guò)拼接組裝，繪制測(cè)序物種的完整基因組序列圖譜?；蚪M測(cè)序不僅可以獲得測(cè)序物種的全基因組序列圖譜，分析開放性閱讀框，確定基因數(shù)量，還可通過(guò)進(jìn)一步分析，確定測(cè)序物種進(jìn)化特點(diǎn)、生物學(xué)分類、基因功能富集情況和主要代謝通路，為特定環(huán)境適應(yīng)性等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)[16,17]。

本研究從爆蛋樣品中分離出一株革蘭氏陰性菌，命名為BD菌株。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，16S rDNA序列比對(duì)，初步鑒定其為弧菌屬細(xì)菌。通過(guò)弧菌試劑盒檢測(cè)生理生化功能，確定其生長(zhǎng)代謝特點(diǎn)。并確定了其最適生長(zhǎng)溫度、耐鹽度和耐堿度，為皮蛋加工企業(yè)“爆蛋”控制方案制定提供參考。鑒于菌株生長(zhǎng)環(huán)境特點(diǎn)，進(jìn)一步通過(guò)De novo測(cè)序，初步解析BD菌株適應(yīng)高堿度環(huán)境的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“爆蛋”皮蛋樣品由湖北省江夏區(qū)某皮蛋加工廠提供。

主要培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、芽孢桿菌培養(yǎng)基、MA培養(yǎng)基，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

主要試劑：DP302 TIANampBateria DNA Kit，天根生化科技（北京）有限公司；KOD taq、Loading buffer、核酸染料，Transgene生物科技有限公司；弧菌科細(xì)菌生化鑒定盒（16種×5次），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；NEBNext?UltraTMDNA Library Prep Kitfor illumine試劑盒，NEB有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；Eclipse Ts2R倒置顯微鏡，尼康株式會(huì)社；LX-B35 L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；PCR儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；PYL-125型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-red公司。

1.3 方法

1.3.1 “爆蛋”樣品細(xì)菌的分離純化

鑒于“爆蛋”皮蛋樣品蛋白無(wú)明顯變化，蛋黃內(nèi)出現(xiàn)變質(zhì)、顏色異常，因此，將“爆蛋”樣品變質(zhì)蛋黃作為菌株的分離材料，取各批次“爆蛋”蛋黃0.5 g進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。樣品無(wú)菌條件下充分研磨后轉(zhuǎn)入加入200 mL，0.9%無(wú)菌NaCl的錐形瓶，200 r/min振蕩30 min，靜置5 min，用0.9% NaCl 10倍梯度稀釋，選擇5個(gè)稀釋梯度，各取100 μL梯度稀釋液于不同培養(yǎng)皿內(nèi)，并涂布均勻，倒置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24±2 h。根據(jù)菌落的形狀，大小和顏色等形態(tài)特征，挑取不同選擇培養(yǎng)基上單菌落進(jìn)行純化，鏡檢，斜面保藏。

1.3.2 細(xì)菌形態(tài)特征的觀察

菌落特征：對(duì)菌落的顏色、大小、形狀、光滑度和透明度等進(jìn)行觀察并記錄。

對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察和拍照。將分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)特征。

1.3.3 菌株基因組DNA提取及16S rRNA基因擴(kuò)增測(cè)序

將待測(cè)菌株分別使用分離菌株所采用的固體培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h獲得新鮮細(xì)胞懸浮液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取 DNA（步驟參照說(shuō)明書）。以提取的 DNA為模板，選擇細(xì)菌 16S rDNA的通用引物 27F（ 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×FastTaq Premix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.75 μL，添加ddH2O至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，確定擴(kuò)增片段長(zhǎng)度于目標(biāo)片段長(zhǎng)度相同、無(wú)雜帶后送往武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。

1.3.4 同源性及進(jìn)化樹分析

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送武漢生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序進(jìn)行BLAST 比對(duì)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），綜合分析菌株16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果。選擇同源性高的細(xì)菌序列，用 MEGAX 軟件，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線繪制

濃度為1.0×106CFU/mL的細(xì)菌培養(yǎng)液，以1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別選取0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h時(shí)間測(cè)定菌液的OD600值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，共進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.6 細(xì)菌培養(yǎng)特性試驗(yàn)

通過(guò)表2可知，磁性纖維素在293、303和313 K溫度下Langmuir模型的線性相關(guān)系數(shù)R2>0.99，而且由Langmuir模型所得各個(gè)溫度飽和吸附容量與磁性纖維素對(duì)亞甲基藍(lán)溶液吸附容量實(shí)測(cè)值比較接近，說(shuō)明磁性纖維素對(duì)亞甲基藍(lán)溶液吸附更適合用Langmuir模型描述，吸附主要為單分子層吸附，最大吸附容量為123.15 mg·g-1。

（1）細(xì)菌生長(zhǎng)最適溫度試驗(yàn)

將細(xì)菌的培養(yǎng)液接種到3.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，分別在 15、20、25、30、35、40、45、50 ℃條件下，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。次日分別測(cè)取OD600值，進(jìn)行3次重復(fù)并統(tǒng)計(jì)分析。

（2）細(xì)菌耐堿試驗(yàn)

將細(xì)菌的培養(yǎng)液接種到3.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為8、9、10、11、12、13、14。接種后200 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取適量樣品測(cè)OD600值。進(jìn)行3次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)分析。

（3）細(xì)菌耐鹽試驗(yàn)

將細(xì)菌的培養(yǎng)液接種到3.5 mL的LB液體培養(yǎng)基中（pH 10±0.2），并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的NaCl濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取適量樣品測(cè)OD600值。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析。

（4）細(xì)菌生化試驗(yàn)

1.3.7 細(xì)菌基因組De novo測(cè)序

采用SES方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和完整性，利用Qubit進(jìn)行定量后，對(duì)DNA樣品用超聲破碎儀隨機(jī)打斷成長(zhǎng)約350 bp的片段。利用建庫(kù)試劑盒，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟制備測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建后，使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至2 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段進(jìn)行檢測(cè)，片段大小符合預(yù)期后，使用qPCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。構(gòu)建好的的文庫(kù)通過(guò) Illumina PE150平臺(tái)進(jìn)行細(xì)菌框架圖測(cè)序。測(cè)序完成后，構(gòu)建細(xì)菌基因組框架圖，并對(duì)基因進(jìn)行GO富集、KEGG分析等生物信息學(xué)分析。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS軟件中的ANOVA方法計(jì)算均值±SD和p值。

2 結(jié)果與分析

2.1 “爆蛋”樣品分離獲得的細(xì)菌形態(tài)、菌落特征及16S rDNA序列分析

多批次樣品細(xì)菌分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“爆蛋”樣品中的微生物可在LB固體培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，菌落均呈淺黃色，表面光滑且不透明。分離純化后，菌落形態(tài)相同，均如圖1所示，在LB固體培養(yǎng)基中形成淺黃色、表面光滑、邊緣整齊且不透明的近似圓形的菌落。顯微鏡檢特點(diǎn)相同，菌株革蘭氏染色陰性，短桿狀，不透明菌株。單個(gè)存在，少數(shù)鏈狀排列（圖1）。

微生物的16S rDNA結(jié)構(gòu)具有保守性，可反映微生物間的親緣關(guān)系和進(jìn)化特征。16S rDNA序列比對(duì)法對(duì)未知菌株種屬分類具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)BD菌株的基因組DNA模板進(jìn)行16S rDNA片段PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增到大小約為1400 bp條帶。利用NCBI中blast工具對(duì)BD菌株16S rDNA擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，BD菌株（Genbank accession number：MZ723937）與弧菌屬多個(gè)近緣種的16S rDNA基因相似性在 99%以上，其中與麥?zhǔn)匣【╒ibrio metschnikoviistrain KT986183.1），印第安弧菌（Vibrio injenensisstrain KC634073.2），辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnatiensisstrain NR026122.1），需鈉弧菌（Vibrio natriegensstrain NR115679.1）的相似性分別為99.92%、99.75%、99.83%、97.76%。由于16S rDNA的保守性高，未知菌屬序列比對(duì)分析是目前確定其分類的常用手段，但對(duì)相似率極高的近緣種只能進(jìn)行屬水平上的鑒定。

選取 7個(gè)同源性較高的不同種的弧菌序列，用MegaX軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，BD菌株與麥?zhǔn)匣【幱谳^近分支，且聚集在一起，形成一簇（圖2）。綜合序列比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果，初步確定 BD菌株為麥?zhǔn)匣【╒ibrio metschnikovii）。進(jìn)一步利用菌株De nove測(cè)序結(jié)果的分析，可將菌株鑒定到種。

2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線結(jié)果

供試菌在培養(yǎng)4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并持續(xù)到12 h左右，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期（圖3）。在試驗(yàn)組中，所有檢測(cè)點(diǎn)3組數(shù)據(jù)均差異不顯著（p＞0.05），重復(fù)性良好。

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)特性試驗(yàn)結(jié)果

供試菌在 15 ℃培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)溫度達(dá)到25 ℃，即可開始生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25～40 ℃（圖4）。供試菌株的OD600值隨pH值的增大呈先增加后下降的趨勢(shì)，其在pH 12時(shí)OD600值達(dá)到最大值，pH進(jìn)一步增加，細(xì)菌則無(wú)法增殖（圖5）。供試菌培養(yǎng)基中NaCl濃度從2.5%至5%增加時(shí)，該弧菌增殖速度隨鹽濃度的提高而加快，當(dāng) NaCl濃度從 5%至7.5%繼續(xù)增加時(shí)，該弧菌增殖速度變慢（圖6）。細(xì)菌培養(yǎng)特性試驗(yàn)的試驗(yàn)重復(fù)性均表現(xiàn)良好。

由于該菌株多富集于水體、海鮮及動(dòng)物糞便中。基于BD菌株的生長(zhǎng)特性，加工企業(yè)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注原料蛋品收集、運(yùn)輸，減少使用細(xì)菌污染的次品蛋，尤其我國(guó)南方地區(qū)在春夏之交，氣溫升高的氣候條件下更需重點(diǎn)關(guān)注。此外，在腌制車間內(nèi)、蛋品出缸后以及商品皮蛋在儲(chǔ)運(yùn)、貨架期管理時(shí)，也要注意控溫，避免溫度過(guò)高，引發(fā)“爆蛋”。

2.4 生理生化特性

供試菌株蔗糖、阿拉伯糖、肌醇分解試驗(yàn)結(jié)果陰性；甘露糖分解試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。菌株1% NaCl葡萄糖產(chǎn)氣、1% NaCl精氨酸雙水解酶試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性；1%NaCl賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果陰性。低濃度（0%～6%）NaCl胨水試驗(yàn)陽(yáng)性，高濃度（8%～10%）NaCl胨水試驗(yàn)陰性。相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果詳見（表1）。該結(jié)果表明，BD菌株除適應(yīng)高堿環(huán)境外，還具有產(chǎn)氣能力，能夠在6%的鹽濃度條件下生長(zhǎng)。

表1 BD菌株的生理生化分析Table 1 Physiological and biochemical analysis of BD strain

2.5 細(xì)菌基因組De novo測(cè)序分析

通過(guò)對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)處理，序列組裝發(fā)現(xiàn)，BD菌株基因組大小為3.70 Mb，GC含量43.62%。基因組分析表明，BD菌株共編碼3381個(gè)基因，基因平均長(zhǎng)度為942 bp，編碼基因長(zhǎng)度占基因組比例為86.58%。非編碼RNA預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，BD菌株共有84個(gè)tRNA，13個(gè)sRNA。采用IslandPath-DIOMB軟件預(yù)測(cè)BD菌株基因島發(fā)現(xiàn)，BD菌株存在5個(gè)基因島，基因島總長(zhǎng)度40270 bp，平均長(zhǎng)度8054 bp。

選取GO、KEGG和COG三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)功能基因進(jìn)行注釋。其中，GO（Gene Ontology）按照功能基因的分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分進(jìn)行聚類。GO注釋結(jié)果的分類如圖7所示，細(xì)菌生物學(xué)過(guò)程和分子功能基因活躍，其中參與細(xì)胞過(guò)程（1348條）、代謝過(guò)程（1345條）、結(jié)合（1133條）、催化活性（1262條）的基因較多。

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）從分子信號(hào)通路角度進(jìn)行注釋，獲得菌株相關(guān)分子間的互作網(wǎng)絡(luò)。BD菌株KEGG代謝通路分析結(jié)果如圖8所示。從KEGG通路注釋結(jié)果表明，該菌株參與碳水化合物代謝及膜轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因數(shù)量最多，此外，參與氨基酸代謝、維生素和輔因子代謝通路的相關(guān)基因數(shù)量也較多。通過(guò)對(duì)蛋白編碼基因功能注釋表明，該菌株基因組中含有大量碳水化合物代謝通路、膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)通路基因。有研究表明，嗜堿細(xì)菌細(xì)胞膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)載體在調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)pH方面起關(guān)鍵作用[18,19]。BD菌株中的大量膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因可轉(zhuǎn)錄翻譯成的蛋白，以離子泵的形式保證細(xì)菌胞質(zhì)中pH值相等穩(wěn)定[20]。分離菌株基因組中同時(shí)含有較多的碳水化合物代謝通路相關(guān)基因，這些功能基因可能參與細(xì)菌利用蛋內(nèi)碳源物質(zhì)為離子轉(zhuǎn)運(yùn)供能。對(duì)于GO注釋將基因富集到的基因中，雙組分傳感因子活性相關(guān)基因可能與該菌株適應(yīng)堿性環(huán)境有關(guān)[21]，甘油-3-磷酸鹽分解代謝活性相關(guān)基因可能也參與了堿環(huán)境適應(yīng)[22]。

COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果表明（圖9），BD菌株相關(guān)基因富集于氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代（250個(gè)）；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和起源（234個(gè)）；轉(zhuǎn)錄因子（218個(gè)），結(jié)果對(duì)GO注釋和KEGG注釋結(jié)果進(jìn)行了補(bǔ)充和印證。

NR數(shù)據(jù)庫(kù)（Non-Redundant Protein Database）是一個(gè)非冗余的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，其特點(diǎn)在于內(nèi)容比較全面，同時(shí)注釋結(jié)果中會(huì)包含有物種信息，可作物種分類用。該數(shù)據(jù)庫(kù)由NCBI創(chuàng)建并維護(hù)，根據(jù)基因編碼蛋白注釋到的物種情況，統(tǒng)計(jì)注釋到的物種及蛋白數(shù)目。結(jié)果表明，BD菌株編碼的3381個(gè)蛋白，有2641個(gè)注釋到麥?zhǔn)匣【?，其富集度最高（見圖 10）。結(jié)合前期16S rDNA測(cè)序比對(duì)結(jié)果，確定從皮蛋“爆蛋”樣品中分離獲得的 BD菌株為麥?zhǔn)匣【╒ibrio metschnikovii）。

3 結(jié)論

3.1 本研究通過(guò)分離、鏡檢、染色、16S rDNA測(cè)序比對(duì)和De novo從頭測(cè)序，確定從皮蛋“爆蛋”樣品中分離獲得的 BD 菌株為麥?zhǔn)匣【╒ibrio metschnikovii）。生長(zhǎng)特性研究發(fā)現(xiàn)其適宜生長(zhǎng)溫度為25～40 ℃，可耐受pH≤12的堿環(huán)境，耐鹽且具有產(chǎn)氣能力。但該腐敗菌BD菌株如何侵入蛋品內(nèi)部，其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氣體是何種成分，還需要進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

3.2 研究分離獲得的BD菌株De novo測(cè)序分析表明，該菌株基因組中有大量參與碳水化合物代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、維生素和輔因子代謝通路的基因，通過(guò)相關(guān)基因表達(dá)來(lái)適應(yīng)高堿環(huán)境，為皮蛋“爆蛋”菌在蛋黃中的生長(zhǎng)機(jī)制研究提供了一定基礎(chǔ)，但功能基因的挖掘和作用機(jī)制研究也有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行深入研究。