四種牧草種子在不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫下的萌發(fā)特性

楊迎月， 毛桂蓮， 麻冬梅， 張峰舉， 許 興，4*

(1.寧夏大學農(nóng)學院， 寧夏 銀川 750021； 2. 寧夏大學生命科學學院， 寧夏 銀川 750021； 3.寧夏大學生態(tài)環(huán)境學院，寧夏 銀川 750021; 4.寧夏大學西北土地退化與生態(tài)系統(tǒng)恢復省部共建國家重點實驗室培育基地， 寧夏 銀川 750021)

土壤鹽堿化是全球性的大問題，不僅危害作物，還導致土壤退化。隨著全球氣候的改變，土壤鹽堿化的面積逐漸擴大，嚴重威脅農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-4]。我國鹽堿土面積3. 46 × 107hm2，其中寧夏共有鹽堿地17.53萬hm2，銀北地區(qū)10.2萬hm2，占該地區(qū)耕地總面積的58%以上，土壤鹽堿化造成植物生理干旱、影響氣孔關(guān)閉、影響植物營養(yǎng)吸收、傷害植物組織，因此亟需治理改造[5]。鹽堿地的改良有利于提高作物的產(chǎn)量，增加農(nóng)民收入，改善農(nóng)民生活水平并且對于發(fā)展寧夏農(nóng)、牧業(yè)都具有重要意義[6]。大量研究表明，草本植物是鹽堿地生態(tài)植被重要組成成分，有些是先鋒植物或建群種，對鹽堿地生態(tài)修復有重要作用[7]。種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)建成是牧草的關(guān)鍵時期，直接影響牧草生長和經(jīng)濟效益[8]，同時也是種子植物生活史中最脆弱的階段，這一階段的耐鹽堿能力一定程度能夠上反映植物整體的耐鹽堿性[9]，決定著牧草能否在干旱或鹽堿環(huán)境中成功定居[10]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是豆科紫花苜蓿屬多年生草本植物，栽培歷史悠久，品質(zhì)優(yōu)良，被稱為“牧草之王”，主要分布在我國西北、華北、東北等地，呈栽培或半野生狀態(tài)[11-12]。鷹嘴紫云英(Astragaluscicer)又名鷹嘴黃芪，耐鹽堿性和抗旱性較好，即可用做水土保持植物，又可為優(yōu)良飼草作物[13]。湖南稷子(Echinochloafrumentacea)是禾本科稗屬一年生C4牧草，具有適應強、耐逆性強、產(chǎn)草量和產(chǎn)籽量高等優(yōu)良特性，是理想的鹽堿地改良植物[14]。高羊茅(Fectucaarundinacea)具有較好的耐踐踏、耐熱、耐干旱以及耐鹽等特性，且適口性佳、營養(yǎng)價值高，是備受人們重視的牧草和草坪草，被廣泛種植于我國北方地區(qū)[15]。

寧夏地處我國西北內(nèi)陸農(nóng)牧交錯帶干旱、半干旱氣候區(qū)，干旱和土壤鹽漬化是影響該區(qū)域生態(tài)環(huán)境最主要的因素[16]。在該區(qū)域進行鹽堿地退化生態(tài)修復過程中，選擇適生、優(yōu)良的牧草品種就顯得尤為重要。本研究選擇從甘肅張掖引進的鷹嘴紫云英和當?shù)卮笠?guī)模種植的紫花苜蓿2種豆科牧草和當?shù)赜蟹N植的高羊茅和湖南稷子2種禾本科牧草為材料，采用不同濃度NaCl溶液和NaHCO3溶液分別模擬鹽脅迫和堿脅迫，比較和評價4種牧草的耐鹽力和耐堿力，為銀北地區(qū)鹽堿地農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上耐鹽堿牧草的選育以及寧夏平原大面積鹽堿地的合理開發(fā)與利用提供資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草種為紫花苜蓿、鷹嘴紫云英、高羊茅和湖南稷子，由甘肅創(chuàng)綠草業(yè)科技有限公司、寧夏千葉青農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，詳見表1。

表1 供試材料Table 1 Test materials

1.2 試驗材料的培養(yǎng)及處理

試驗在寧夏大學草業(yè)科學現(xiàn)代牧草育種實驗室進行。選擇成熟、大小均勻一致的各供試材料種子50粒作為萌發(fā)材料。鷹嘴紫云英用98%濃硫酸處理20分鐘，不斷攪拌，然后反復用清水清洗干凈[17]。高羊茅、紫花紫花苜蓿、湖南稷子種子用0.1%高錳酸鉀消毒3 min，用蒸餾水清洗干凈，再用濾紙吸干后，均勻的置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中。每個培養(yǎng)皿分別加入配制好的不同濃度的鹽堿溶液。NaCl或NaHCO3溶液濃度分別為50 mmol·L-1，100 mmol·L-1，150 mmol·L-1，200 mmol·L-1，250 mmol·L-1和300 mmol·L-1，以蒸餾水為對照，共13個處理，每個處理重復3次。培養(yǎng)皿放置于人工氣候培養(yǎng)箱，設(shè)置晝/夜溫度為25℃/20℃，濕度為60%，光照/黑暗時間為12 h/12 h，光照強度為5 000 lx。為保證培養(yǎng)皿中鹽堿濃度保持不變，每日用稱重法及時補充所揮發(fā)水分(蒸餾水)。從第2 d開始記錄，每隔24 h記錄1次種子發(fā)芽數(shù)。第10 d結(jié)束，測量4種牧草的胚根長和胚芽長。

1.3 指標的測定

1.3.1發(fā)芽指標 (1)發(fā)芽率(Germination rate，GR)=發(fā)芽結(jié)束時正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

(2)發(fā)芽勢(Germination potential，GP)=發(fā)芽5 d時正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)× 100%。

(3)胚芽長(Germ length，GL)、胚根長(Radicle length，RL)：從每個培養(yǎng)皿中隨機選取 10株生長正常的種苗，用直尺測量芽長和根長，若不足10株的則全部測量，每個處理3組重復。

(4)發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI)=∑Gt/Dt。

(5)活力指數(shù)(Vigor index，VI)=胚芽長×發(fā)芽指數(shù)。

上式中:Gt為第td發(fā)芽的種子數(shù);Dt為發(fā)芽的天數(shù)[18]。

按照發(fā)芽率、發(fā)芽勢、芽長、根長、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的值，分別計算相對值[19]。

(6)相對傷害率=[對照發(fā)芽率(CK)—處理發(fā)芽率]/對照發(fā)芽率(CK)×100%[20]。

(7)相對發(fā)芽率(Relative germination rate，RGR) =鹽脅迫處理下種子發(fā)芽率/對照發(fā)芽率×100%。

(8)相對發(fā)芽勢(Relative germination potential，RGP)=鹽脅迫處理下種子發(fā)芽勢/對照發(fā)芽勢× 100%。

(9)相對胚芽長(Relative germ length，RGL)=鹽脅迫處理下胚芽長度/對照胚芽長× 100%。

(10)相對胚根長(Relative radicle length，RRL)=鹽脅迫處理下胚根長度/對照胚根長× 100%。

(11)相對發(fā)芽指數(shù)(Relative germination index，RGI)=鹽脅迫處理下發(fā)芽指數(shù)/對照發(fā)芽指數(shù)× 100%。

(12)相對活力指數(shù)(Relative vigor index，RVI) =鹽脅迫處理下活力指數(shù)/對照活力指數(shù)× 100%。

1.3.2種子耐鹽堿能力 (1)耐鹽/堿適宜濃度、半致死鹽/堿濃度和致死鹽/堿濃度的確定：耐鹽/堿適宜范圍(%)是相對發(fā)芽率達到75%以上的鹽/堿溶液濃度；耐鹽/堿半致死濃度(%)是相對發(fā)芽率達到50%時的鹽/堿溶液濃度；耐鹽/堿致死濃度(%)是相對發(fā)芽率達到10%時相對應的鹽/堿濃度[21]。

(2)采用相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對胚芽長、相對胚根長、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)6項指標，計算被引選的4種牧草鹽堿脅迫下萌發(fā)期的綜合隸屬函數(shù)值，以評價其耐鹽堿性。

植物耐鹽堿性得分最終用隸屬函數(shù)計算：Xij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。

式中Xij表示i牧草種子j指標的隸屬函數(shù)值；Xij表示i品種j指標的相應值；Xjmax和Xjmin則表示i牧草種子在j指標中相對應的最大值和最小值[22-23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016 對各生長指標數(shù)據(jù)進行整理計算，再使用SPSS 25.0軟件進行方差分析和線性回歸分析。采用Origin 2018進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫對4種牧草種子相對發(fā)芽率和相對傷害率的影響

由圖1可知，4種牧草種子相對發(fā)芽率隨著NaCl或NaHCO3濃度的升高呈下降趨勢，各處理之間差異顯著(P<0.05)。紫花苜蓿在50，100 mmol·L-1NaCl脅迫下相對發(fā)芽率高于50，100 mmol·L-1NaHCO3脅迫。50，100 mmol·L-1NaCl或NaHCO3脅迫下，湖南稷子相對發(fā)芽率表現(xiàn)最好。50 mmol·L-1NaCl或NaHCO3脅迫下高羊茅相對發(fā)芽率分別是88.00%，88.03%；50 mmol·L-1NaCl或NaHCO3脅迫下，鷹嘴紫云英相對發(fā)芽率是86.33%，57.83%。鷹嘴紫云英在NaCl濃度≥200 mmol·L-1時發(fā)芽率為0，說明受到嚴重抑制。高羊茅在NaCl濃度≥250 mmol·L-1時受抑制。在300 mmol·L-1NaCl下，紫花苜蓿受抑制嚴重，然而湖南稷子相對發(fā)芽率仍達到41.67%，說明湖南稷子耐鹽濃度未到極限。200 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，紫花苜蓿和鷹嘴紫云英受NaHCO3脅迫影響嚴重，沒有發(fā)芽。在250 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，湖南稷子和高羊茅受NaHCO3脅迫嚴重，沒有發(fā)芽。表明禾本科比較耐堿。

4種牧草種子相對傷害率隨著NaCl或NaHCO3濃度的增加均呈上升趨勢，NaCl或NaHCO3脅迫濃度越大，種子受到傷害率越大。50，100 mmol·L-1NaCl脅迫下，紫花苜蓿相對傷害率分別是2.16%，5.70%。50，100 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，紫花苜蓿相對傷害率是19.38%，38.76%。湖南稷子在50，100，150 mmol·L-1NaCl脅迫下，相對傷害率分別是0.69%，1.35%，2.69%。湖南稷子在50，100，150 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，相對傷害率是4.03%，4.40%，73.63%。高羊茅在50 mmol·L-1NaCl或NaHCO3脅迫下，相對傷害率是11.38%，11.97%。鷹嘴紫云英在50 mmol·L-1NaCl或NaHCO3脅迫下，相對傷害率是17.33%，10.67%。在300 mmol·L-1NaCl脅迫下，其余3種牧草受到抑制嚴重，然而湖南稷子相對傷害率是57.64%(圖1)。

圖1 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫下4種牧草種子的相對發(fā)芽率和相對傷害率Fig.1 The relative germination rate and relative damage rate of four forage seeds under different concentrations of NaCl or NaHCO3 stress注:不同字母表示同種植物不同濃度間的差異顯著(P<0. 05)，下同Note:Different letters indicate significant differences between different concentrations of the same plant at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫對4種牧草種子發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢的影響

由圖2可知，紫花苜蓿在50 mmol·L-1NaCl脅迫時發(fā)芽勢與0 mmol·L-1NaCl脅迫相比沒有顯著差異(P<0.05)。湖南稷子在50，100 mmol·L-1NaCl濃度時發(fā)芽勢與0 mmol·L-1NaCl脅迫相比沒有顯著差異(P<0.05)。4種牧草的發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢均隨著NaHCO3脅迫濃度的增大而均呈現(xiàn)下降趨勢。然而在50 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，湖南稷子種子發(fā)芽勢高于0 mmol·L-1NaHCO3,紫花苜蓿、高羊茅、鷹嘴紫云英種子發(fā)芽勢顯著低于對照(P<0.05)。這3種牧草對NaHCO3脅迫非常敏感。在50，100 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，湖南稷子種子相對發(fā)芽勢高于CK，分別為對照的102.31%，102.11%。紫花苜蓿、高羊茅、鷹嘴紫云英種子表現(xiàn)出不同程度的下降(圖2)。

圖2 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫下4種牧草種子的發(fā)芽勢和相對發(fā)芽勢Fig.2 Germination vigor and relative germination vigor of four forage seeds under different concentrations of NaCl or NaHCO3

2.3 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫對種子相對胚芽長和相對胚根長的影響

由表2可知，4種牧草材料受不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫影響，其相對胚芽長和相對胚根長受影響程度各不相同，但均表現(xiàn)為隨著濃度的增加，呈現(xiàn)降低趨勢。50 mmol·L-1NaCl脅迫時，紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅和鷹嘴紫云英的種子相對胚芽長分別為119.42%，105.52%和102.87%，102.50%；50 mmol·L-1NaHCO3脅迫時，紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅和鷹嘴紫云英的種子相對胚芽長分別為84.30%，89.82%和93.18%，64.54%。100 mmol·L-1內(nèi)濃度的鹽脅迫對紫花苜蓿種子胚芽的生長具有促進作用。50 mmol·L-1NaCl脅迫下，紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅和鷹嘴紫云英的胚根長均受到抑制，相對胚根長分別為70.25%，68.20%，97.45%和90.27%。在50 mmol·L-1NaHCO3脅迫下，紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅和鷹嘴紫云英的胚根長均受到抑制，相對胚根長分別為68.33%，54.00%，83.67%和69%。4種牧草胚芽和胚根的生長均對NaCl或NaHCO3脅迫較敏感(表2)。

表2 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫下4種種子相對胚芽長和相對胚根長Table 2 The relative embryo length and relative radicle length of 4 kinds of seeds under different concentrations of NaCl or NaHCO3

2.4 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫對種子相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)影響

由表3可知，4種牧草種質(zhì)材料相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)均隨著NaCl或NaHCO3濃度的增大而呈現(xiàn)降低的趨勢。紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅和鷹嘴紫云英在NaCl濃度50 mmol·L-1時，種子相對發(fā)芽指數(shù)有不同程度降幅，分別為對照的91.30%，98.10%，81.55%，83.69%。其中降幅最大的是高羊茅和鷹嘴紫云英。紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅和鷹嘴紫云英在NaHCO3濃度50 mmol·L-1時，種子相對發(fā)芽指數(shù)有不同程度降幅，分別為對照的86.36%，96.53%，86.72%，74.96%。其中降幅最大的是鷹嘴紫云英。湖南稷子、高羊茅、鷹嘴紫云英在NaCl濃度50 mmol·L-1時，種子相對活力指數(shù)有不同程度降幅，分別為對照的99.2%，99.16%，76.47%。其中降幅最大的是鷹嘴紫云英。紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅、鷹嘴紫云英在NaHCO3濃度50 mmol·L-1時，種子相對活力指數(shù)有不同程度降幅，分別為對照的74.93%，95.16%，81.73%，49.44%。其中降幅最大的是鷹嘴紫云英。紫花苜蓿在50 mmol·L-1濃度NaCl時，種子相對活力指數(shù)比CK高，為CK的107.43%，低濃度的NaCl脅迫對紫花苜蓿的種子萌發(fā)具有促進作用(表3)。

表3 不同濃度NaCl或NaHCO3脅迫下種子相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)Table 3 Relative germination index and relative vigor index of seeds under different concentrations of NaCl or NaHCO3

2.5 NaCl脅迫與相對發(fā)芽率的相關(guān)性及耐鹽效應

由表4可知，種子萌發(fā)階段NaCl濃度每增加10 mmol·L-1，紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅、鷹嘴紫云英的相對發(fā)芽率分別下降4.60%，2.46%，3.89%，3.78%。下降速度越快說明耐鹽性越差。4種牧草適宜鹽濃度從高到低依次為湖南稷子>紫花苜蓿>高羊茅>鷹嘴紫云英。4種牧草適宜鹽濃度與半致死鹽濃度排序一致，濃度范圍為131.22 mmol·L-1～279.95 mmol·L-1。4種牧草適宜鹽濃度與致死鹽濃度排序一致，濃度范圍為237.142 mmol·L-1～442.95 mmol·L-1。從相關(guān)系數(shù)來看，4種牧草相關(guān)系數(shù)絕對值排序為高羊茅>紫花苜蓿>湖南稷子>鷹嘴紫云英。綜上，湖南稷子適宜鹽濃度、半致死鹽濃度和致死鹽濃度最高，說明鹽脅迫對湖南稷子影響較小(表4)。

表4 NaCl濃度與種子相對發(fā)芽率的相關(guān)分析及耐鹽度的測定Table 4 Correlation analysis of NaCl concentration and relative germination rate of seeds and the determination of salinity tolerance

2.6 NaHCO3脅迫與相對發(fā)芽率的相關(guān)性及耐堿效應

由表5可知，種子萌發(fā)階段NaHCO3濃度每增加10 mmol·L-1，紫花苜蓿、湖南稷子、高羊茅、鷹嘴紫云英的相對發(fā)芽率分別下降4.25%，5.56%，4.65%，3.04%。下降速度越快說明耐堿性越差。4種牧草適宜堿濃度從高到低依次為湖南稷子>高羊茅>紫花苜蓿>鷹嘴紫云英。4種牧草適宜堿濃度與半致死堿濃度排序一致，濃度范圍為47.1 mmol·L-1～143.36 mmol·L-1。4種牧草適宜堿濃度與致死堿濃度稍有差異，濃度范圍為178.74 mmol·L-1～222.74 mmol·L-1，排序為高羊茅>湖南稷子>紫花苜蓿>鷹嘴紫云英。從相關(guān)系數(shù)來看，4種牧草相關(guān)系數(shù)絕對值排序為高羊茅>紫花苜蓿>湖南稷子>鷹嘴紫云英。綜上，湖南稷子適宜鹽濃度、半致死鹽濃度最高，說明堿脅迫對湖南稷子影響較小(表5)。

表5 NaHCO3濃度與種子相對發(fā)芽率的相關(guān)分析及耐堿度的測定Table 5 Correlation analysis of NaHCO3concentration and relative germination rate of seeds and determination of alkali toleranc

2.7 4種牧草萌發(fā)期耐鹽性綜合評價

研究表明，4種牧草材料綜合耐鹽性總得分在-0.50～17.22之間，排名大小順序依次為湖南稷子>紫花苜蓿>高羊茅>鷹嘴紫云英(表6)。

表6 不同NaCl溶液下 12 種牧草種子耐鹽性得分及排名Table 6 Salt tolerance score ranking of 12 herbage seeds in different NaCl solutions

2.8 4種牧草萌發(fā)期耐堿性綜合評價

由表7可知，4種牧草材料綜合耐堿性總得分在3.72～21.71，排名大小順序依次為湖南稷子>高羊茅>紫花苜蓿>鷹嘴紫云英(表7)。

表7 不同NaHCO3溶液下 4種牧草種子耐堿性得分及排名Table 7 Alkali tolerance scores and rankings of 4 forage seeds under different NaHCO3 solutions

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對4種牧草種子萌發(fā)的影響

鹽堿脅迫對植物的傷害在非生物脅迫下較為常見，它是影響植物種子萌發(fā)和幼苗生長的重要因素，會嚴重損害牧草細胞的正常生長代謝和生理過程[24-25]。種子萌發(fā)階段是植物成功建植的第一步，也是耐鹽堿性最弱的時期[26-27]。不同的植物種子對不同濃度的鹽堿脅迫的耐受程度不同，研究發(fā)現(xiàn)低濃度鹽脅迫對部分禾本科牧草種子和豆科牧草種子萌發(fā)具有促進作用，即“引發(fā)作用”[28]。本試驗中50 mmol·L-1和100 mmol·L-1鹽濃度下，紫花苜蓿相對發(fā)芽率達到98%，94%，湖南稷子在50 mmol·L-1，100 mmol·L-1和150 mmol·L-1濃度下，相對發(fā)芽率高達97.33%，96.67%，95.33%。這與張利霞等、景艷霞等[29]研究結(jié)果一致，出現(xiàn)這一情況原因是高鹽對植物有害，但是低鈉對植物生長也會有促進作用，因為鈉元素是植物生長所必需的。鹽堿脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用，主要通過滲透作用與離子毒害作用來實現(xiàn)[30]。由于植物種類的不同，鹽脅迫和堿脅迫下不同組織和器官的反應也不同，有的植物地上部抑制作用較地下部明顯，有的則地下部較地上部更敏感，本研究結(jié)果中不同鹽堿濃度對4種牧草胚芽的抑制作用小于胚根，且Nacl和NaHCO3濃度為150 mmol·L-1是4種牧草胚芽和胚根生長受抑制作用的一個閾值，這與李天永等[31]、鄧杰等[32]的研究結(jié)果一致。

3.2 4種牧草耐鹽堿性比較

禾本科和豆科牧草對鹽堿脅迫存在明顯差異，從適宜濃度、半致死濃度、致死濃度來看，堿脅迫對四種牧草的傷害遠大于鹽脅迫。事實上，由NaHCO3等堿性鹽所造成的土壤堿化除了自由基、離子毒害，還存在高pH值危害，比由NaCl等中性鹽所造成的鹽化問題更加嚴重[33-38]。但鹽脅迫和堿脅迫下牧草種子的各項指標變化因品種不同而異，且有較大的變化，因此不能用單一指標衡量牧草種子耐鹽堿性，而要綜合多種指標進行耐鹽堿性評價[39]。4種牧草最終耐鹽堿性得分排名是根據(jù)隸屬函數(shù)公式分別計算4個濃度下各植物相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對胚芽長、相對胚根長、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)6個生長指標，相對值的選取消除了各植物間種質(zhì)的差異，更加公平客觀的篩選出耐鹽堿的植物。

4 結(jié)論

Nacl脅迫下6個濃度梯度4種牧草種子總得分排名順序為:：湖南稷子>紫花苜蓿>高羊茅>鷹嘴紫云英。NaHCO3脅迫下6個濃度梯度4種牧草種子總得分排名順序為：湖南稷子>高羊茅>紫花苜蓿>鷹嘴紫云英。4種牧草種子萌發(fā)時都具有一定的抵抗鹽堿能力，可將其作為鹽堿地改良過程中先鋒物種，由于各草種的耐鹽堿臨界值不同，應因地制宜的選擇合適的草種，以便更好發(fā)揮牧草耐鹽改良作用。