紫花苜蓿根際土壤細(xì)菌群落對腐熟牛糞響應(yīng)

王 芳， 李 偉， 劉 鑫， 李文辰， 趙金波， 張智慧， 楊 曌

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院， 黑龍江 齊齊哈爾 161005； 3.黑龍江省牧草育種與種質(zhì)資源利用工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，驅(qū)動著土壤系統(tǒng)中各種生物進(jìn)程。微生物對環(huán)境變化敏感，施肥顯著影響土壤微生物種群特性，長期施用氮、磷、鉀化肥可降低土壤微生物活性及多樣性[1]。添加糞肥、植物殘體等有機肥可改善土壤肥力、提高土壤有機質(zhì)含量，穩(wěn)定土壤微生物系統(tǒng)[2-4]。不同養(yǎng)分含量的有機肥對土壤微生物主要類群的影響不同。新鮮豬糞或發(fā)酵豬糞可以明顯提高水稻(Oryzasativa)根際土壤微生物的物種豐富度和群落均勻度，加快有機物質(zhì)在土壤中的分解轉(zhuǎn)化[5]。蚯蚓糞會增加土壤有益微生物種類和數(shù)量，提高土壤細(xì)菌多樣性，增強土壤酶活[6]，對番茄(Solanumlycopersicum)連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)效果優(yōu)于稻草、雞糞、牛糞有機物料[7]，但有研究表明牛糞可以對放線菌優(yōu)勢群落產(chǎn)生顯著影響[8]。

土壤細(xì)菌作為土壤肥力和養(yǎng)分循環(huán)的驅(qū)動者，在維持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力和穩(wěn)定性方面具有不可替代的地位[9-10]。細(xì)菌群落對土壤條件包括水分、溫度、pH值、土壤類型和養(yǎng)分有效性等變化的反應(yīng)快于其它化學(xué)或物理性質(zhì)的反應(yīng)[11]，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性可以作為評估農(nóng)業(yè)措施對土壤質(zhì)量影響的重要指標(biāo)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)有機肥處理的土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢種群明顯不同于單施化肥和不施肥[14]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科植物，含有豐富的營養(yǎng)成分，被譽為“牧草之王”，因其較高的營養(yǎng)價值和較強的地域適應(yīng)性，在我國北方畜牧業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的地位。為了滿足苜蓿正常生長對養(yǎng)分的需求，常需通過施肥來補充土壤養(yǎng)分。牛糞是畜牧產(chǎn)業(yè)的廢棄物，將其作為有機肥料用于作物種植，形成種養(yǎng)有機結(jié)合的循環(huán)模式，不但解決了糞便污染和化肥過量使用的問題，而且可以改良土壤、培肥地力、提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)，實現(xiàn)經(jīng)濟及生態(tài)效益雙豐收。本研究基于16S rRNA基因高通量測序技術(shù)，探索不同添加比例腐熟牛糞對苜蓿根際土壤細(xì)菌豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成的影響，旨在為腐熟牛糞在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用及施肥策略制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與樣品采集

試驗于2020年 4月至9月進(jìn)行。供試紫花苜蓿品種為‘龍牧801’，土壤采自黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)科研試驗地(齊齊哈爾市富拉爾基區(qū))。采用盆栽(盆缽25 cm ×30 cm)，每盆均播種50粒種子。4種質(zhì)量百分比添加腐熟牛糞，① O組(零添加組，0% 添加量)；② D1組(3% 添加量)；③ D2組(6% 添加量)；④ D3組(9% 添加量)，分別在播種后(苜蓿分枝期)的30 d(T1)，60 d(T2)，90 d(T3)取樣，共12個處理，每個處理5次重復(fù)。此外，在添加牛糞前，取全土(不添加牛糞，WT)和全糞(不添加土壤，WF)兩個樣品，以了解未經(jīng)處理及種植的土壤及腐熟牛糞細(xì)菌群落情況。采用抖落法收集苜蓿根際土壤，混勻后分裝在聚乙烯袋中，-80℃保存，作為總DNA的提取樣本。

1.2 土壤總DNA提取、PCR擴增及基因測序

每個樣品稱取0.5 g，根據(jù)Mo BIO Power Soil DNA Kit說明書提取總DNA，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。以稀釋后的基因組DNA為PCR模板，利用細(xì)菌通用性引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增細(xì)菌16S rRNA V3-V4可變區(qū)。擴增體系為 25 μL，5×FastPfu緩沖液 4 μL，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol·L-1)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性 2 min，30 個循環(huán)(95℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s)，最后 72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程，上海)進(jìn)行純化。獲得PCR產(chǎn)物送至派森諾生物科技有限公司(上海)進(jìn)行Illumina-Miseq高通量測序。原始數(shù)據(jù)提交至NCBI的Sequence Read Archive (SAR)數(shù)據(jù)庫，Accession號碼：PRJNA741810。

1.3 原始數(shù)據(jù)處理

采用DADA2方法[15]對序列進(jìn)行質(zhì)控、去噪(Denoise)、拼接和去嵌合體，提高后續(xù)序列融合比率。利用Vsearch方法[16]聚類獲得操作分類單元(Operational taxonomic units，OTU)，統(tǒng)計長度分布情況，檢查目的片段長度范圍及異常長度序列情況。隨機抽取序列，構(gòu)建稀釋性曲線。

1.4 物種分類學(xué)注釋及物種組成分析

利用QIIME2軟件，選用Greengenes數(shù)據(jù)庫(http:// greengenes.secondgenome.com/)進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因注釋。使用QIIME2(2019.4)及自編perl腳本，依據(jù)序列物種分類學(xué)注釋的結(jié)果以及選擇的樣品，統(tǒng)計這些樣本的物種注釋結(jié)果中域、門、綱、目、科、屬、種七個分類水平各自含有的分類單元數(shù)量，用柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。

1.5 Alpha多樣性分析

利用派森諾基因云平臺(https://www.genescloud.cn/)進(jìn)行OTU豐度和Alpha多樣分析，Chao1和Observed species指數(shù)表征豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性。

1.6 Beta多樣性分析

使用抽平后OTU表，基于Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)行PCoA(Principal coordinate analysis)分析，用QIIME2使分析結(jié)果可視化，R腳本輸出樣本點的PCoA坐標(biāo)，繪制二維散點圖。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及制圖

使用IBM SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計分析軟件對Alpha多樣性指標(biāo)、樣本多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行二因素方差分析(WF和WT兩個樣本不參加方差分析)，多重比較采用Duncan檢驗法，差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

將測序平臺得到的原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量、去噪、去嵌合體、拼接后，供試樣本共獲得984 200條高質(zhì)量序列，去除singleton后的序列量是942 003條，總堿基數(shù)為392 582 624 bp，堿基數(shù)分布在403～442 bp的序列占序列總數(shù)的99.98%，平均序列長度為 417 bp。14個樣品的稀釋性曲線均趨于平坦(圖1)，表明測序數(shù)據(jù)接近飽和，測序深度合理，更多的數(shù)據(jù)量對發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小。同時，稀釋曲線在一定程度上也可以反應(yīng)在一系列給定的測序深度下，可能包含的物種總數(shù)及其中每個物種的相對豐度。在相同的測序深度下，比較不同樣本中OTU數(shù)的多少，在一定程度上衡量每個樣本的多樣性高低。由圖1所示，WT樣本的多樣性最高，其次為O組、D1，D2，D3組，WF樣本的多樣性最低。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for samples

2.2 物種分類學(xué)注釋

將獲得OTU從門到種進(jìn)行物種分類學(xué)注釋分析。所有供試土壤樣品共注釋到細(xì)菌分類85門，335綱，362目，1 828科，4 441屬，368種。樣品WF在門和屬水平上注釋到的OTU數(shù)目在所有樣品中均為最低，分別為16和1 807，在種水平上為最高368個。WT在門水平上注釋到的85個OTU，在所有樣品中為最高。在屬水平上，OT3注釋到的OTU數(shù)目最多，為4 441個；在種水平上注釋到的OTU數(shù)目為最低182個(圖2)

圖2 各樣品在不同分類水平上的OTU注釋數(shù)目Fig.2 OTU annotation number at varied classification level of different samples

2.3 物種分類學(xué)組成分析

由圖3所示，樣品中鑒定到的OTU主要分布在以下10個門：放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Patescibacteria、疣微菌門(Verrucomicrobia)、消化螺旋菌門(Nitrospirae)。其中，Actinobacteria最為豐富，在14個樣品中相對豐度為55.9%～32.2%；其次為Proteobacteria，相對豐度為36.9%～20.5%。

圖3 樣品在門水平的群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of samples bacterial diversity at phylum level

Actinobacteria和Proteobacteria也是樣品WT與WF的優(yōu)勢菌門，Proteobacteria,Firmicutes和Bacteroidetes在WF種的相對豐度分別高于在WT中的豐度。與O組相比，添加牛糞后D1，D2和D3組的Firmicutes和Bacteroidetes相對豐度顯著增加(P< 0.05)，Proteobacteria在D3組達(dá)到顯著性增加(P< 0.05)；Chloroflexi，Acidobacteria，Gemmatimonadetes，Verrucomicrobia，Nitrospirae豐度呈顯著性下降(P< 0.05)，Actinobacteria在D3組下降顯著(P< 0.05)。Patescibacteria變化不顯著(表1)。

表1 不同添加量及取樣時間下各樣品在門水平的相對豐度Table 1 Relative abundance of bacterial taxa classified to the phylum level at different adding amount and sampling time

隨著取樣時間的延伸，F(xiàn)irmicutes，Chloroflexi，Gemmatimonadetes，Patescibacteria的相對豐度呈現(xiàn)顯著增加(P< 0.05)，Bacteroidetes呈現(xiàn)下降趨勢。

在屬分類水平上，豐度較低的稀有種群占78.03%～84.67%，表明土壤中存在大量待發(fā)掘的細(xì)菌物種。為了便于分析鑒定到的優(yōu)勢菌群對添加牛糞及取樣時間的響應(yīng)，將相對豐度位于前10位的優(yōu)勢菌屬作圖。如圖4所示，樣品WT及WF具有不同的優(yōu)勢菌屬，WT的優(yōu)勢菌屬有Subgroup_6(酸桿菌)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、芽球菌屬(Blastococcus)、KD4-96(綠彎菌)、67-14(放線菌)；WF中具有相對豐度較高的芽孢桿菌屬(Bacillus)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、BIrii41(厚壁菌)。

圖4 樣品在屬水平的群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of samples bacterial diversity at genus level

Bacillus和Actinomadura的相對豐度均隨著牛糞添加比例的增加而升高，且三個水平添加組顯著高于O組(P< 0.05)；德沃斯氏菌屬(Devosia)與BIrii41在三個添加組中的豐度也均高于O組。Subgroup_6，Pseudonocardia，Blastococcus，67-14，KD4-96的相對豐度均隨著添加比例的增加呈顯著下降，Sphingomonas豐度在添加至D2組時顯著低于O組(表3)(P< 0.05)。

從取樣時間上看，Sphingomonas和Devosia的相對豐度受取樣時間影響顯著，隨取樣時間延長呈顯著下降(P< 0.05)。Blastococcus相對豐度在30 d和90 d呈顯著性差異(P< 0.05)。Pseudonocardia，Actinomadura和綠彎菌KD4-96的相對豐度在三個取樣時間上沒有顯著差異。Subgroup_6，Bacillus，BIrii41和67-14的相對豐度隨取樣時間延長呈增加趨勢。

表2 不同添加量及取樣時間樣品在屬水平的相對豐度Table 2 Relative abundance of bacterial taxa classified to the genus level at different adding amount and sampling time

2.4 Alpha多樣性分析

與O組相比，不同添加比例對Alpha多樣性指數(shù)Chao1,Observed_species,Shannon,Simpson均產(chǎn)生顯著性的影響(P< 0.05)(表3)。O組的四個指數(shù)均為最高，隨著土壤中牛糞含量的增加，四個指數(shù)均呈明顯下降趨勢，表明細(xì)菌群落的豐富度及多樣性在下降(P<0.05)。四個指數(shù)在D1組和D2組之間差異不顯著。

表3 不同添加比例細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial Alpha diversity indices at different adding amount

2.5 Beta多樣性的主坐標(biāo)軸分析

基于樣本間Bray-Curtis距離，PCoA主坐標(biāo)分析樣本群落之間的相似度和差異性。由圖5所示，主坐標(biāo)軸PCo1可解釋全部樣品細(xì)菌群落豐度和多樣性方差的22.4%，主坐標(biāo)軸PCo2可解釋細(xì)菌群落豐度和多樣性方差的的11.1%。不同樣本處理組群落組成及多樣性之間明顯分離，可以分為3大區(qū)域：樣本D3組(第四象限)主要分布在主坐標(biāo)PCo1附近，說明D3組苜蓿根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受PCo1影響明顯。第二區(qū)域主要分布在PCo2附近(第三象限)，即O組在PCo2主軸上分開，說明O組根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主要受PCo2影響。第三區(qū)域為D1組和D2組(第一象限)，距離PCo1及PCo2上均較遠(yuǎn)，D1組內(nèi)樣本間距離也較遠(yuǎn)，表明D1組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異大于D2組。

圖5 基于Bray-Curtis差異PCoA分析土壤樣品細(xì)菌群落Fig.5 PCoA analysis with Bray-Curtis dissimilarity of the bacterial communities between samples

2.6 樣本間物種差異分析

為研究不同樣本間共有及獨有的物種情況，使用OTU豐度表制作花瓣圖進(jìn)行群落分析。如圖6所示，不同比例牛糞在添加30 d，OT1組具有最多的OTU分布數(shù)目，其次為D3T1組，D1T1組為最少，四組一共有OTU 45 004個，共有OTU數(shù)目為1 880個，約占4.2%。添加60 d，OT2組具有最多的OTU分布數(shù)目，其次為D1T2組，D3T2組為最少，四組一共有47 737個，共有的OTU數(shù)目為1 464個，約占3.1%。添加90 d，OT3組具有最多的OTU分布數(shù)目，其次為D1T3組，D3T3組為最少，四組一共有OTU 48 321個，共有的OTU數(shù)目為1 331個，約占2.7%。從時間看，隨著取樣時間的延伸，D1組(添加3%)和D2組(添加6%)的OTU數(shù)目呈增加趨勢，D3組(添加9%)OTU呈下降趨勢；四組樣本共有的OTU數(shù)目比例下降，說明物種的多樣性呈增加趨勢。

圖6 不同取樣時間下樣本間共有和獨有OTU數(shù)目的花瓣圖Fig.6 The petals figure based on common or unique OTU number among treatments at sampling time

2.7 物種組成差異熱圖

為了進(jìn)一步比較樣本間的物種組成差異，將平均豐度前20位的屬的豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析(圖7)。如圖7所示，Lysobacter,BIrii41,Devosia,Steroidobacter的豐度在WF與WT及O組間相似，在添加牛糞后豐度增加。Cellvibrio(纖維菌屬)、Planifilum(直絲菌屬)、Bacillus、Saccharomonospora(糖單胞菌屬)豐度在WF,WT及O組差異不明顯，在土壤中添加牛糞后，明顯高于WF,WT,O組，并隨著牛糞含量的增加呈增加趨勢，在D3組處理中均達(dá)到最高峰，表明混合土壤會促進(jìn)這些菌屬的豐度。Actinoplanes(游動放線菌屬),67-14,Blastococcus,KD4-96,Skermanella(紅弧菌屬),RB41,Subgroup_6,Pseudonocardia(假諾卡氏菌屬)的豐度在WT中含量最高，隨著牛糞比例的增加明顯下降，在WF組豐度最低。Actinomadura和Haloactinopolyspora在WF中高豐度的細(xì)菌。

圖7 屬水平物種組成差異熱圖Fig.7 Heatmap tree for different treatments cluster analysis at genera level注：標(biāo)尺顏色深淺表示樣本物種豐度變化Note：Scale plate color shades indicate changes in species abundance of samples

與WT相比，O組的Skemanella,Subgroup_6,Pseudonocardia,Sphingomonas豐度增加，Actinoplanes和Pseudomonas豐度下降，其余細(xì)菌豐度變化不明顯。

3 討論

施用有機肥是提高作物產(chǎn)量及改善土壤理化性質(zhì)的主要措施，不同類型肥料及施用時間對土壤微生物群落的影響不同。有研究結(jié)果顯示，短期施肥對土壤微生物的影響不顯著，長期合理施肥可以豐富土壤微生物多樣性，恢復(fù)土壤中固氮菌群的多樣性和群落結(jié)構(gòu)[14,17]。也有研究表明施肥對影響土壤細(xì)菌群落豐度、土壤微生物多樣性的影響具有一定的局限性[18-19]。本研究結(jié)果表明腐熟牛糞在短期內(nèi)降低苜蓿根際土壤細(xì)菌Alpha多樣性。這與趙鳳艷等研究結(jié)果相似，牛糞降低設(shè)施番茄根際細(xì)菌多樣性和豐富度[20]。Zhang等[21]在茶園施用1.5%牛糞和尿素后，Alpha多樣性指數(shù)均低于未施肥，且在取樣時間上土壤細(xì)菌的多樣性變化趨勢相似：春季至夏季顯著增加，夏季至秋季顯著減少。也有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐富度指數(shù)Chao和ACE兩個指數(shù)在添加固體牛糞和豬糞后下降，在取樣季節(jié)之間差異顯著，在不同肥料間差異不顯著[22]。類似研究結(jié)果顯示季節(jié)對細(xì)菌群落的影響大于肥料的營養(yǎng)處理[23]。本研究的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均呈現(xiàn)O> D1> D2> D3，3%的牛糞添加量可使Alpha多樣性顯著下降，土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。一方面是由于盆栽種植苜蓿，土壤細(xì)菌菌群的豐度及多樣性變化會更加顯現(xiàn)；另一方面可能是本試驗施用了相對較高的肥料添加比例導(dǎo)致。

Actinobacteria是所有測試樣品中的優(yōu)勢菌群，在WT和WF中相對豐度分別達(dá)56%和42%，并且隨著牛糞添加比例的增加而呈下降，添加至9%時與O組差異達(dá)到顯著。隨著取樣時間的延長也表現(xiàn)下降趨勢。Actinobacteria功能多樣，有助于有機物的分解，研究表明Actinobacteria在未受到干擾的土壤中易富集[24]。Proteobacteria是測試樣品中的另一優(yōu)勢菌群，在WT中相對豐度最低。Proteobacteria能夠適應(yīng)營養(yǎng)豐富的環(huán)境，Acidobacteria通常被認(rèn)為喜歡資源有限的寡養(yǎng)環(huán)境[25-27]。前人研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria與Acidobacteria的比例可以反映土壤營養(yǎng)狀況：二者比例越高意味著更多的有機質(zhì)投入[28]。本研究也證實了這結(jié)論，隨著牛糞添加比例的增加，Proteobacteria豐度增加，Acidobacteria豐度降低，二者比例呈增加趨勢。

Bacteroidetes是一類厭氧菌，菌門成員具有降解復(fù)雜有機化合物如纖維素的功能[23]。本研究結(jié)果表明土壤中添加牛糞顯著增加Bacteroidetes豐度。Firmicutes也是一類厭氧菌，高碳利用率可能導(dǎo)致其豐度增加。本研究發(fā)現(xiàn)隨取樣時間延長，F(xiàn)irmicutes豐度表現(xiàn)增加趨勢，30 d與90 d達(dá)到顯著性差異，推測在苜蓿的一個生長周期，碳利用率在持續(xù)增加。Gemmatimonadetes可以對土壤中碳和氮含量進(jìn)行微調(diào)，平衡作物代謝需求，適應(yīng)不斷變化的環(huán)境，對土氮素循環(huán)中反硝化作用具有重要意義[29]。添加牛糞后Gemmatimonadetes相對豐度顯著下降，但隨著時間延長呈顯著增加，受到作物生長階段影響顯著。Chloroflexi和Patescibacteria的相對豐度隨作物生長呈現(xiàn)顯著增加，這一結(jié)果與劉靜平等研究結(jié)果相似[30]。但添加牛糞會顯著降低Chloroflexi豐度。Tian等[31]發(fā)現(xiàn)其相對豐度與有機肥施用量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Chloroflexi作為重要的有機物分解者，和放線菌一樣對有機肥施用非常敏感[32]，施用有機肥反而會抑制Chloroflexi和Actinobacteria的生長和繁殖，降低二者相對豐度。Nitrospirae是共營養(yǎng)細(xì)菌，適合高pH值環(huán)境條件生存，施肥降低其豐度[33-34]。本研究結(jié)果表明添加牛糞會降低其豐度。

在屬水平上，WT及WF具有不同的優(yōu)勢菌屬。添加牛糞的土壤可顯著增加有益菌屬芽孢桿菌屬(Bacillus)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、BIrii41、德沃斯氏菌屬(Devosia)，降低Subgroup_6、Pseudonocardia、芽球菌屬(Blastococcus)、67-14、KD4-96(綠彎菌)的豐度。變形菌門根瘤菌目Devosia豐度在WT及WF樣品中均很低，但在添加牛糞土壤中，該菌屬的豐度顯著增加，達(dá)45倍以上，但也隨著苜蓿生長顯著下降。Devosia與水生豆科植物Neptunianatans形成獨特的固氮共生體，有推測Devosia可能有助于速效氮含量的增加[35]。BIrii41顯示與Devosia相同變化，在添加牛糞土壤中，該菌屬的豐度顯著增加，并且隨苜蓿生長時期延長呈增加趨勢。厚壁菌門中與有機化合物分解和植物抗病性相關(guān)的Bacillus和對溫度適應(yīng)的多樣性Planifilum，放線菌門中能降解半纖維素和蛋白質(zhì)的Saccharomonospora，變形菌門中與植物的抗病性相關(guān)的Lysobacter、降解纖維素的Cellvibrio和具有反硝化能力的Steroidobacter[36]，這些菌群的豐度在WF，WT，O組差異不顯著，在土壤中添加牛糞后，顯著高于WF，WT，O組，并隨著牛糞含量升高而增加。雖然添加牛糞降低Sphingomonas的豐度，但該菌屬的豐度變化并沒有隨添加比例呈現(xiàn)規(guī)律性變化，反而隨著取樣時間延伸呈現(xiàn)出顯著性的降低。

4 結(jié)論

添加腐熟牛糞降低盆栽苜蓿土壤細(xì)菌Alpha多樣性。Actinobacteria和Proteobacteria是土壤、腐熟牛糞及混合土壤樣品的優(yōu)勢菌。添加腐熟牛糞增加土壤Firmicutes，Bacteroidetes和Proteobacteria豐度；顯著提高Lysobacter，Bacillus，Saccharomonospora，Planifilum，Cellvibrio，Steroidobacter，Devosia的豐度。不同添加比例均降低土壤細(xì)菌OTU數(shù)量，但添加比例至6%牛糞的土壤細(xì)菌OTU數(shù)目隨著苜蓿生長持續(xù)增加，高添加比例(添加9%)的細(xì)菌OTU數(shù)目持續(xù)降低。通過不同添加比例的腐熟牛糞對苜蓿土壤細(xì)菌結(jié)構(gòu)及多樣性的影響分析，推薦腐熟牛糞添加量低于6%的施肥方式為佳。