青花菜中礦質(zhì)元素的近紅外光譜快速測(cè)定

雷雨夢(mèng)，閆國(guó)超，楊 靜，朱祝軍

(浙江農(nóng)林大學(xué) 園藝科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

青花菜(L.var.)又稱(chēng)西蘭花、綠菜花、木立花椰菜等，是十字花科蕓薹屬植物，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、適宜冷凍貯運(yùn)，在人們物質(zhì)生活水平逐步提升的背景下，已逐漸成為人們?nèi)粘ＯM(fèi)的主要蔬菜之一?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)研究表明，礦質(zhì)元素對(duì)人體具有重要的生理作用，如鈣和磷對(duì)于骨骼和牙齒健康至關(guān)重要，但是人體自身無(wú)法合成礦質(zhì)元素，需要從日常食物當(dāng)中獲取。蔬菜是人體礦質(zhì)元素的主要來(lái)源之一，青花菜中含有豐富的鎂(Mg)、鉀(K)、鈣(Ca)、磷(P)、鐵(Fe)等礦質(zhì)元素，提升青花菜礦質(zhì)元素含量也是青花菜品質(zhì)提升育種的重要目標(biāo)。但在青花菜品質(zhì)評(píng)價(jià)與品種選育的過(guò)程中，傳統(tǒng)的礦質(zhì)元素含量測(cè)定方法由于耗時(shí)費(fèi)力，且昂貴復(fù)雜，不適于大批量樣品的測(cè)定。因此，探索高效、便捷的青花菜礦質(zhì)元素含量測(cè)定方法，對(duì)于青花菜養(yǎng)分評(píng)價(jià)、選擇育種材料等具有重要意義。

近紅外光譜(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)分析技術(shù)可通過(guò)測(cè)定近紅外吸收光譜，同時(shí)分析樣品中多種成分。NIRS作為獲取信息的一種有效載體，是由于不同有機(jī)物含有不同基團(tuán)，主要反映C-H、C-C、C=C、C-N和O-H等化學(xué)鍵的光譜特征，因此不同有機(jī)成分的樣品具有不同的近紅外光譜。依靠礦物元素與有機(jī)官能團(tuán)或有機(jī)基質(zhì)之間的聯(lián)系，可通過(guò)光譜特征快速分析樣品中礦物元素的含量。在對(duì)研究的元素進(jìn)行校準(zhǔn)之后，NIRS可在約1 min內(nèi)對(duì)元素進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定量估計(jì)，不僅不需使用化學(xué)試劑，而且極大地簡(jiǎn)化了樣品制備過(guò)程，因此，在快速分析大批量樣品元素含量方面具有較大潛力。目前，Galvez-sola等建立了NIRS快速測(cè)定柑橘葉片中N、K、Ca、Mg、B、Fe、Cu、Mn和Zn含量的技術(shù)方法；Escuredo等針對(duì)蜂蜜花源的識(shí)別，建立了基于NIRS的蜂蜜主要花粉類(lèi)型及其礦物質(zhì)組成(K、Ca、Mg、P)預(yù)測(cè)模型；Costa等利用NIRS結(jié)合偏最小二乘法(PLS)量化了必須元素Ca、Mg、Zn、P和K；Manuelian等利用NIRS (866～2 530 nm)預(yù)測(cè)了新鮮奶酪的主要礦質(zhì)元素含量。以上結(jié)果表明，NIRS對(duì)不同樣品中不同礦質(zhì)元素含量檢測(cè)具有一定潛力。

目前，已有青花菜硫苷含量的NIRS快速檢測(cè)模型相關(guān)研究的報(bào)道，但尚無(wú)礦質(zhì)元素方面的應(yīng)用。本研究將電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES)獲得的青花菜樣品礦質(zhì)元素含量分析數(shù)據(jù)與NIRS光譜數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立青花菜礦物元素含量的NIRS快速評(píng)價(jià)方法，以探討NIRS法在大量和微量礦質(zhì)元素方面的適用性，為其進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與處理方法

試驗(yàn)所用青花菜材料由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院與臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，共計(jì)120個(gè)不同種類(lèi)的成熟青花菜樣品。將青花菜花球切成大塊，經(jīng)液氮預(yù)冷后，用真空冷凍干燥機(jī)將樣品冷凍干燥(72 h)。凍干后，將樣品磨碎、過(guò)篩(100目)，低溫(-40 ℃)保存，待用。

1.2 主要儀器

德國(guó)GANNA1-16LSC型號(hào)的凍干機(jī)，美國(guó)TJA公司的IRIS/AP型端視全譜直讀ICP-OES光譜儀，美國(guó)CEM公司的MARS 5型微波消煮爐，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司Antaris II型號(hào)的NIRS分析儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 礦質(zhì)元素含量測(cè)定

參考石元值等的方法，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-OES)測(cè)定青花菜中各元素含量。精確稱(chēng)取0.5 g凍干樣品粉末(精確至0.001 g)于聚四氟乙烯高壓微波消解罐中，加入10 mL濃硝酸后加蓋密封，放入微波消解儀，同時(shí)使用10 mL硝酸作為空白對(duì)照。根據(jù)GB 5009.268—2016設(shè)定工作程序進(jìn)行消解，結(jié)束后將消解管移至通風(fēng)柜，先揮發(fā)多余硝酸，再用超純水潤(rùn)洗消解管并將消解液定容至50 mL，即為待測(cè)樣品溶液。

提前配置好各元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用ICP-OES光譜儀測(cè)得相應(yīng)的強(qiáng)度響應(yīng)值。以被測(cè)元素濃度為橫坐標(biāo)、分析公共線的強(qiáng)度響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)，采用ICP-OES法分析各樣品和空白對(duì)照溶液中各元素響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量后按以下公式計(jì)算青花菜樣品中的元素含量。

=(-)××。

式中：代表青花菜樣品中待測(cè)元素的含量，單位為mg·g或mg·mL；為樣品溶液中待測(cè)元素的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，單位為mg·L；為試樣空白溶液中被測(cè)元素質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)，單位為mg·L；為試樣消解液的定容體積，單位為mL；為試樣稀釋倍數(shù)；為試樣稱(chēng)取質(zhì)量或移取體積，單位為g或mL。

1.3.2 近紅外光譜儀分析

近紅外儀器開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min，光譜和噪聲診斷通過(guò)后，進(jìn)行樣品掃描。首先在近紅外儀器上建立工作流程，參數(shù)設(shè)置為：波長(zhǎng)范圍1 000～2 500 nm，分辨率8 cm，每次掃描中光譜自動(dòng)掃描32次，取平均值作為最終光譜。然后將粉末樣品放入與近紅外儀匹配的5 cm盛樣杯，進(jìn)行光譜采集。預(yù)先用近紅外光譜分析儀掃描青花菜的粉樣，保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為(26±2)℃，濕度為60%±20%。以?xún)?nèi)置背景為參照采集2個(gè)光譜，以減少樣本加載誤差。

將通過(guò)ICP-OES法分析得到的青花菜礦質(zhì)元素含量數(shù)據(jù)輸入儀器配套的化學(xué)計(jì)量軟件，進(jìn)行光譜分析處理。在PLS分析的基礎(chǔ)上，采用不同的散射處理方式[多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation，SNV)]，以及不同導(dǎo)數(shù)處理方式[一階導(dǎo)數(shù)(FD)和二階導(dǎo)數(shù)(SD)]對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，得到校正模型和預(yù)測(cè)模型。再通過(guò)校正相關(guān)系數(shù)(coefficient of determination in calibration，RSQ)、驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(coefficient of determination in valibration，)、校正偏差(standard error of calibration，SEC)、驗(yàn)證偏差(standard error of predication，SEP)、相對(duì)分析誤差(residual predictive deviation，RPD)對(duì)模型進(jìn)行評(píng)估。利用配套的TQ Aanlyst II分析軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 青花菜品種資源礦質(zhì)元素組成和含量

試驗(yàn)所用青花菜材料品種類(lèi)型多樣，種類(lèi)豐富，具有廣泛代表性。株型有直立和半直立型、主球和分枝型，生育期有早熟、中熟和晚熟，花蕾有細(xì)粒、中粒和粗粒，花球有緊實(shí)型和松散型。表1為ICP-OES測(cè)定的青花菜樣品中礦質(zhì)元素的平均值、濃度范圍和標(biāo)準(zhǔn)偏差。該數(shù)據(jù)將用作“真實(shí)”元素濃度，用于評(píng)估光譜數(shù)據(jù)中模型估計(jì)的準(zhǔn)確性。為確保模型效果，本研究根據(jù)慣例要求將研究元素估計(jì)值介于相同的范圍，且真實(shí)值含量在近紅外檢測(cè)范圍內(nèi)。針對(duì)K、S、P、C、Fe、Mg 6種在植株中分布廣泛、具有代表性的礦質(zhì)元素，將驗(yàn)證集的含量包含于校正集中，以符合建立模型的要求。

表1 青花菜樣品中各元素的含量Table 1 Contents of elements in broccoli samples mg·g-1

2.2 青花菜近紅外光譜分析

一般情況下，通過(guò)近紅外光譜儀掃描獲得的光譜數(shù)據(jù)除光譜樣品的自身信息外，還包含大量無(wú)關(guān)信息和噪聲。為去除干擾，采用不同散射處理方式和導(dǎo)數(shù)處理方式對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，以減弱甚至消除各種非目標(biāo)因素對(duì)光譜的影響，凈化譜圖信息，為校正模型的建立奠定基礎(chǔ)，主要包括Savitzky-Golay卷積平滑處理、導(dǎo)數(shù)處理、光譜散射處理，通過(guò)Savitzky-Golay卷積平滑(6點(diǎn)平滑)光譜曲線，解決相鄰波段信息一致性導(dǎo)致的數(shù)據(jù)冗余問(wèn)題；通過(guò)導(dǎo)數(shù)處理提高光譜的分辨率，減小基線漂移，消除光譜的譜峰重疊，在實(shí)際分析中一般采用FD和SD來(lái)進(jìn)行光譜預(yù)處理；通過(guò)MSC和SNV消除固體顆粒物大小、表面散射，以及光程變化對(duì)NIR漫反射光譜的影響。

圖1為青花菜樣品經(jīng)近紅外光譜分析儀得到的近紅外原始光譜，橫坐標(biāo)為光譜波長(zhǎng)，范圍為1 000～2 500 nm；縱坐標(biāo)為青花菜樣品吸光度。青花菜樣品在1 100～1 300 nm、1 400 ～1 600 nm、1 650～1 850 nm和1 900～2 050 nm有明顯的吸收峰，且變化趨勢(shì)基本相同，說(shuō)明青花菜樣品的吸光度與其化學(xué)成分含量之間存在相關(guān)性。圖2為經(jīng)過(guò)MSC+FD處理的光譜曲線圖。與圖1原始光譜相比，經(jīng)處理過(guò)的光譜曲線起伏更加顯著，吸收峰更多，一些原本平滑的部分也出現(xiàn)了吸收峰。圖3為經(jīng)過(guò)MSC+SD處理的光譜曲線圖，出現(xiàn)明顯的擬合現(xiàn)象。

圖1 青花菜近紅外原始光譜Fig.1 Original near infrared spectrum of broccoli

圖2 多元散射校正+一階導(dǎo)數(shù)處理后光譜圖Fig.2 Spectrum treated by multiplicative scatter correction+ first derivative

圖3 多元散射校正+二階導(dǎo)數(shù)處理后光譜圖Fig.3 Spectrum treated by multiplicative scatter correction+second derivative treatment

2.3 青花菜礦質(zhì)元素近紅外光譜模型的建立

近紅外模型的建立首先需要在PLS分析的基礎(chǔ)上，采用不同數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行處理，然后比較結(jié)果所得參數(shù)，再確定最合適的處理方法。通過(guò)MSC+FD、MSC+SD、SNV+FD和SNV+SD 4種數(shù)據(jù)處理方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)RSQ和RPD進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，RSQ是定標(biāo)相關(guān)系數(shù)，一般認(rèn)為越接近1越好。RPD是相對(duì)分析誤差，用來(lái)評(píng)估所得模型的預(yù)測(cè)能力，目前對(duì)此參數(shù)數(shù)值仍然存在不同的看法。

由表2可知，K、Mg、Ca數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)MSC+FD處理后分析結(jié)果最好，此時(shí)RSQ分別為0.884、0.944、0.651，RPD分別為2.491、2.710、1.344；P數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)SNV+FD處理的效果最好，RSQ和RPD分別為0.733和1.117；S、Fe經(jīng)過(guò)MSC+SD處理后的結(jié)果最好，RSQ分別為0.523、0.581，RPD分別為1.133、1.100。可見(jiàn)，Mg的預(yù)測(cè)模型效果最佳，在校正和驗(yàn)證過(guò)程中均取得了較好的結(jié)果，不僅校正誤差、驗(yàn)證誤差均較低，且RPD>2.0；Sinnaeve等認(rèn)為，RPD值大于2.5或大于2.0即有較好的預(yù)測(cè)結(jié)果，說(shuō)明該校正的精度高，可以得到較為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)結(jié)果。Manley等指出，RPD大于3才可以用于篩查，說(shuō)明此模型還需要進(jìn)一步優(yōu)化。K預(yù)測(cè)模型的RSQ略低于Mg的預(yù)測(cè)模型，但RPD仍然大于2，處于較高水平，說(shuō)明該模型有良好的預(yù)測(cè)性且穩(wěn)定度較高。用驗(yàn)證集數(shù)據(jù)驗(yàn)證各模型得到青花菜中K和Mg含量的驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)，分別為0.893、0.928，大于各自的校正相關(guān)系數(shù)，這種情況被認(rèn)為是不合理的；但因差值極小，仍足以進(jìn)行宏觀營(yíng)養(yǎng)元素的預(yù)測(cè)，且估計(jì)誤差會(huì)很小。為此，后續(xù)可通過(guò)增加數(shù)據(jù)集的樣本數(shù)量并重新計(jì)算模型，得到一般所需要模型(校正相關(guān)系數(shù)大于驗(yàn)證相關(guān)系數(shù))。該研究結(jié)果與Menesatti等建立的一些元素(包括K、Mg)的模型結(jié)果相似，相關(guān)系數(shù)都大于0.82。此外，Karoui等研究表明，RSQ為0.50～0.65時(shí)，可以區(qū)分高濃度和低濃度；RSQ為0.66～0.81時(shí)，表示近似的定量預(yù)測(cè)；RSQ為0.82～0.90時(shí)，預(yù)測(cè)結(jié)果較好；RSQ高于0.91時(shí)，預(yù)測(cè)結(jié)果最好。Ca的RSQ為0.651，S的RSQ為0.5～0.65，F(xiàn)e的RSQ為0.5～0.65，屬于可建立區(qū)分高濃度和低濃度層次的模型；P的RSQ為0.66～0.81，可建立用于近似預(yù)測(cè)的模型。

表2 不同處理方法對(duì)青花菜中不同礦質(zhì)元素組分定標(biāo)方程的對(duì)比Table 2 Comparison of calibration equations of different mineral elements in broccoli by different treatment methods

結(jié)合以上分析，最終將MSC+FD處理作為預(yù)處理方法，對(duì)青花菜礦質(zhì)元素Mg、K組分進(jìn)行建模，建模后的模型如圖4所示。效果圖能直觀地體現(xiàn)出模型的預(yù)測(cè)效果，Mg和K的樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)無(wú)規(guī)律地分布在直線兩側(cè)，整體呈均勻離散的趨勢(shì)，且沒(méi)有出現(xiàn)較大的偏差，說(shuō)明Mg、K模型較準(zhǔn)確，可用于青花菜中該2種元素的含量預(yù)測(cè)。P、Ca選擇采用SNV+FD和MSC+FD進(jìn)行預(yù)處理，建立的模型如圖4所示。各數(shù)據(jù)比較均勻的分布在直線兩側(cè)，但存在少量數(shù)據(jù)比較離散的情況，因此，這2個(gè)模型的準(zhǔn)確性有待加強(qiáng)，后續(xù)或可通過(guò)增加樣品數(shù)據(jù)或?qū)⒏叩蜐舛葏^(qū)分開(kāi)建立模型來(lái)進(jìn)行改善。S和Fe的模型圖采用MSC+SD進(jìn)行預(yù)處理，從圖4可知，數(shù)據(jù)分布離散，存在較大偏差，后續(xù)或可以通過(guò)建立高、低濃度2個(gè)模型來(lái)增加其準(zhǔn)確度。

Mg、K采用多元散射校正+一階導(dǎo)數(shù)處理作為預(yù)處理方法，P、Ca分別采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換+一階導(dǎo)數(shù)和多元散射校正+一階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行預(yù)處理，S和Fe采用多元散射校正+二階導(dǎo)數(shù)。Mg and K were pretreated by multivariate scattering correction+first derivative，P and Ca were pretreated by standard normal variable transformation+first derivative and multivariate scattering correction+first derivative respectively，S and Fe were pretreated by multivariate scattering correction+second derivative.圖4 青花菜各礦質(zhì)元素含量化學(xué)測(cè)試值與NIRS預(yù)測(cè)值的關(guān)系Fig.4 Relationship between chemical test values and NIRS prediction values of mineral elements in broccoli

3 結(jié)論

本研究選取了120份青花菜，采用ICP-OES測(cè)定礦質(zhì)元素組分的含量，并利用近紅外分析儀和TQ Aanlyst II軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，建立了青花菜礦質(zhì)元素組分的近紅外檢測(cè)模型。主要結(jié)論如下：對(duì)于青花菜礦質(zhì)元素K、Mg和Ca采用MCS+FD處理后的模型較好；P經(jīng)過(guò)SNV+FD處理的效果最好；S、Fe經(jīng)過(guò)MSC+SD處理后的結(jié)果最好。K、Mg建立的模型可以用于實(shí)際應(yīng)用，P的近紅外模型可以近似地進(jìn)行預(yù)測(cè)，S、Fe和Ca通過(guò)區(qū)分高濃度和低濃度，建立2個(gè)模型提高模型的準(zhǔn)確度。根據(jù)本文的結(jié)果可知，近紅外技術(shù)在快速測(cè)定青花菜礦質(zhì)元素含量中有一定可行性，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)增加樣品種類(lèi)或是重復(fù)相同樣品對(duì)模型進(jìn)行進(jìn)一步修訂，可以提高模型的準(zhǔn)確性。本研究為青花菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)的快速檢測(cè)提供了技術(shù)參考，可在育種實(shí)踐中提高青花菜育種材料的篩選效率。