一種基于Image J軟件的植物葉片表型參數(shù)測量方法

楊文源，俞 玉，張世媛，張 娟，瑪伊努爾·圖爾蓀，楊 濤，徐麗萍，3

（1.伊犁師范大學生物與地理科學學院，新疆伊寧 835000；2.蘭州城市學院信息工程學院，甘肅蘭州 730000；3.伊犁師范大學資源與生態(tài)研究所，新疆伊寧 835000）

葉片是植物與外部環(huán)境交互的重要橋梁，是植物進行光合、蒸騰和呼吸作用的重要器官[1-2]。葉片表觀特征反映的是植物對外界環(huán)境的適應以及在復雜生境下的自我調(diào)控能力[3-4]。因此，探究植物葉片表型塑性，對于揭示植物在不同生境下的適應性具有重要意義[5-6]。傳統(tǒng)的網(wǎng)格法、稱重法、系數(shù)回歸法等植物葉片表型參數(shù)獲取方法，或操作繁瑣、效率低下，或精度較差、可靠性低[7-8]，不能很好地適用于植物葉片表型相關(guān)的科學研究。隨著計算機技術(shù)的快速發(fā)展，基于數(shù)碼相機或掃描儀與圖像處理軟件相結(jié)合的圖像處理法，已成為科研和生產(chǎn)中植物葉片表型參數(shù)獲取的熱門方法，具有準確、快速、成本低廉、適合非破壞性動態(tài)連續(xù)觀測等優(yōu)點[9-11]。國內(nèi)學者基于Image J 圖像處理軟件提出的幾種植物葉片表型參數(shù)測量方法，或是只針對葉面積這一種表型參數(shù)，而不能對葉周長、葉長和葉寬等其他植物葉片表型參數(shù)進行測量[12-13]；或是雖然可以對多個植物葉片表型參數(shù)進行測量，但實際操作過程繁瑣，使用費時費力，需要單個、手動地去選定操作，最后還需要人工對測量結(jié)果進行像素數(shù)目與實際長度之間的比例關(guān)系換算[14]，因此均無法在科學研究中開展高效的應用。Digimizer 軟件也是目前廣泛應用于植物葉片表型參數(shù)測量的一款軟件[15-17]，與Image J 軟件相比，在植物葉片表型參數(shù)測量方面具有一定的專業(yè)性和便捷性，但Digimizer 并不是一款可以永久免費使用的軟件，長期使用需要付費且費用較高，因此也具有一定的局限性。除使用上述兩種軟件測量的方法外，雖還有利用Photoshop、Arc GIS[18]等軟件對植物葉片表型參數(shù)進行測量的方法，但都操作繁瑣或需要具備一定的計算機編程基礎(chǔ)，且與使用Image J、Digimizer 軟件測量的方法相比較，還不能實現(xiàn)同時對多個葉片的處理[14]。綜上所述，基于Image J 軟件開源免費、使用廣泛、操作簡便易獲取的優(yōu)點，本文在結(jié)合前人有關(guān)Image J 軟件分析物體表面幾何特征方法[19-21]研究的基礎(chǔ)上對戴志聰?shù)萚14]的研究方法進行優(yōu)化改進，并將改進后的方法與使用Digimizer軟件測量的方法進行比較驗證。由此，提出了一種新的基于掃描儀和Image J 軟件的低成本、快速、精確、批量測量植物葉片表型參數(shù)的方法，以期為植物葉片表型參數(shù)的測量提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年在伊犁師范大學產(chǎn)學研成果轉(zhuǎn)化孵化基地進行，香瓜茄（Solanum muricatum）葉片取自基地中所引種栽培的“綠源一號”香瓜茄，該品種于2021年購于甘肅省武威市民勤縣人參果脫毒育苗中心。隨機選取不同香瓜茄植株、不同位置的83 片形態(tài)完整且無病蟲害的葉片，清洗干凈，用吸水紙拭干水分后備用。

1.2 主要軟件與設(shè)備

試驗所使用的Image J 軟件（即下文中的Fiji 軟件，它是Image J 軟件的一個版本） 于官方網(wǎng)站https：//Image J.net/Fiji/Downloads 獲取。所用電腦基本配置情況：Windows 11 操作系統(tǒng)（64 位）、Intel（R）Core（TM）i5-11320H 處理器、NVIDIA GeForce MX450顯卡、16 GB 運行內(nèi)存（RAM）。所用掃描儀的品牌型號是聯(lián)想M7605D（越南產(chǎn)）。

1.3 葉片數(shù)字圖像采集

將待測植物葉片樣品，整齊地排列在掃描儀的平板玻璃上，然后在葉片樣品旁放置一個刻度尺作為參照物，蓋上掃描儀蓋板，設(shè)置好掃描儀的掃描參數(shù)（JPEG 格式、彩色、300 dpi），點擊掃描，得到待測葉片樣品的數(shù)字圖像，對掃描得到的葉片數(shù)字圖像進行命名編號后，將其存儲于特定的文件夾中用作后續(xù)的處理分析。

1.4 測量指標及方法

1.4.1 測量指標

試驗中所測量的葉面積是包含葉柄部分的單面葉片面積[10]，葉周長是包含葉柄部分的葉片周長，葉長是葉柄基部至葉尖的直線距離，葉寬是兩側(cè)葉緣間垂直葉柄基部與葉梢連線的最寬距離。

1.4.2 測量方法

Digimizer 軟件的具體操作方法參照參考文獻［9］。改進后的Image J 軟件測量植物葉片表型參數(shù)的具體操作步驟如下。

（1）導入圖片：打開Fiji 軟件，點擊“File→Open”，導入待分析的圖片（圖1A）?；蛑苯訉D片拖放至操作欄打開。

（2）設(shè)置比例關(guān)系：找到并使用操作欄中的“Magnifying glass”工具，將圖片適當放大，然后使用“Straight line”工具，按住“Shift”鍵，沿著待分析圖片中的標尺描繪一定長度水平直線。直線繪制完成后，依次點擊“Analyze→Set Scale”，在彈窗頁面“Known distance”一欄中輸入直線長度，“Unit of length”中輸入長度單位，其他選項默認，然后點擊“OK”（圖1B）。在處理同批次規(guī)格相同的圖片時，勾選“Global”選項，即可自動添加比例關(guān)系。

（3）灰度轉(zhuǎn)換：依次點擊“Image→Type→8-bit”，將RGB 格式的圖片轉(zhuǎn)換為灰階圖像（圖1C）。直接以灰度格式掃描獲取的圖片可省略此步驟。

（4）圖像背景校正與增強：依次點擊“Image→Adjust→Threshold”，軟件會自動用紅色將待測葉片填充，然后點擊“Apply”（圖1D）。

（5）測量選項設(shè)置：依次點擊“Analyze→Set Measurements ”，勾選“Area”“Perimeter”和“Feret′s diameter”選項，在“Decimal places”中可根據(jù)測量精度要求，設(shè)置數(shù)據(jù)精準度（圖1E）。軟件具有記憶功能，第1 次勾選后，后續(xù)每次操作時軟件都會自動勾選上次的測量值選項，無須重復操作。

（6）測量結(jié)果導出：依次點擊“Analyze→Analyze Particles”，在彈窗頁面“Size”一欄中設(shè)置面積過濾條件，目測估計葉片大小，將0 改為最小閾值，以去除干擾信息。在“Show”中勾選“Outlines”，下面勾選“Display results”，點擊“OK”，即可彈出測量結(jié)果。彈窗頁面中“Area”是葉片面積、“Perimeter”是葉片周長、“Feret”是葉長、“MinFeret”是葉寬，然后再點擊彈窗頁面左上角“File”，即可通過Excel 的表格形式將結(jié)果導出（圖1F）。

圖1 Image J 軟件法測量步驟

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Image J 軟件與Digimizer 軟件分別對香瓜茄葉片表型參數(shù)進行測量，以Digimizer 軟件測量得到的結(jié)果為基準，與Image J 軟件所測得的結(jié)果進行對比。采用均方根誤差（RMSE）和標準均方根誤差（NRMSE）等統(tǒng)計值進行分析和驗證，從而說明使用Image J 軟件測量植物葉片表型參數(shù)的可行性及準確性。

式中：Oi、Si和n分別表示ImageJ 軟件的測量結(jié)果、Digimizer軟件的測量結(jié)果和樣本容量；為Image J 軟件測量結(jié)果的平均值。當NRMSE值小于10%，表示兩種軟件測量結(jié)果之間一致性非常好；10%～20%為較好；20%～30%為一致性一般；若大于30%則表示兩種軟件測量結(jié)果之間偏差較大[22]。

2.2 兩組患者手術(shù)前后心功能變化比較 兩組術(shù)后二尖瓣反流面積減小(P<0.05)，左室射血分數(shù)升高(P<0.05)。與A組比較，B組二尖瓣反流面積減小和左室射血分數(shù)升高更明顯(P<0.05)。兩組患者術(shù)后左心室舒張期末內(nèi)徑均有所減小，但兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

使用WPS Office 2021 中的表格工具進行試驗數(shù)據(jù)的處理及論文圖表的制作，所有植物葉片表型參數(shù)數(shù)據(jù)均是5 次測量結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物葉片表型參數(shù)不同測量方法的相關(guān)性分析

對使用Image J 軟件與Digimizer 軟件測量得到的香瓜茄葉片（n=83）表型參數(shù)數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析（圖2）可知，兩種軟件測量得到的香瓜茄葉面積、葉周長、葉長和葉寬結(jié)果的標準均方根誤差（NRMSE）分別為0.471%、1.103%、0.391%和1.662%，除葉寬外，其他葉片表型參數(shù)測量結(jié)果的相關(guān)系數(shù)均在0.99 以上（葉寬的相關(guān)系數(shù)偏低，R2=0.979）。與使用Digimizer 軟件測量得到的結(jié)果有較高的一致性，由此可說明使用Image J 軟件測量植物葉片表型參數(shù)的方法具有較高的精確度。

圖2 Image J 軟件與Digimizer 軟件測得的香瓜茄葉片表型性狀數(shù)據(jù)比較

2.2 圖像質(zhì)量對Image J 軟件測量結(jié)果的影響

對選定的同一批香瓜茄葉片（n=8）以不同圖像格式、分辨率進行掃描并分析結(jié)果。由表1、表2 可知，在圖像格式一致時，除葉周長外，圖像分辨率對Image J 軟件的測量結(jié)果無顯著影響，變異系數(shù)小于0.10%。在圖像分辨率一定時，圖像格式會對Image J軟件的測量結(jié)果有較大影響，隨著圖像分辨率的提高，這種影響也會越來越明顯。圖像質(zhì)量會對Image J軟件的測量結(jié)果有一定影響，對灰度格式圖像的影響要小于彩色格式圖像。

表1 圖像格式與分辨率對Image J 軟件測量結(jié)果（葉面積、葉周長）的影響

表2 圖像格式與分辨率對Image J 軟件測量結(jié)果（葉長、葉寬）的影響

3 討論與結(jié)論

兩種軟件葉寬測量結(jié)果的相關(guān)系數(shù)偏低（R2=0.979），這可能與掃描時葉片的排列方向及掃描儀自身的工作原理有關(guān)，掃描儀在工作時，掃描頭上的燈光會從一個方向照射到葉片，由于葉片具有一定厚度，所以會在另一個方向產(chǎn)生陰影，這與日常掃描或復印身份證時，總有一邊會產(chǎn)生陰影的原因相同，不同軟件在識別處理陰影圖像邊緣方面的能力會有一定差異，而這種差異對葉寬的影響要大于其他指標，所以兩者相關(guān)系數(shù)會相對于其他指標偏低。

圖像質(zhì)量對Image J 軟件葉面積、葉長和葉寬的測量結(jié)果無顯著影響，但會對葉周長的測量結(jié)果有較大影響，出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于圖像質(zhì)量的提高，影響了軟件對葉片邊緣輪廓的檢測識別[23]，因此建議在葉片掃描時以灰度格式和較低的分辨率獲取圖像，這樣在保證結(jié)果測量精度的前提下，不僅可以節(jié)約磁盤空間，還可以簡化Image J軟件的操作步驟，提高工作效率。

與使用費用較高的葉面積儀等專業(yè)植物表型分析儀器測量的方法相比較，本試驗提出的基于普通掃描儀和Image J 軟件測量植物葉片表型參數(shù)的方法，無需任何經(jīng)濟支出，掃描儀是基礎(chǔ)的辦公設(shè)備，一般辦公場所都會配備，而Image J 軟件也是從官方網(wǎng)站上免費獲取的，二者聯(lián)合起來就可以對一些基礎(chǔ)的葉片表型參數(shù)進行批量、快速的測量。在避免傳統(tǒng)方法繁瑣流程和專業(yè)儀器高昂成本的同時，獲得了同專業(yè)植物表型參數(shù)分析儀器同樣的使用體驗，這對于普通科研工作者來說實用性很強，因為價格高昂的精密儀器不是每個科研院所都能配備并接觸到的。本試驗方法所需的軟件設(shè)備簡單易得，后期再結(jié)合Image J 軟件自帶的“Straight line”和“Angle tool”等工具即可實現(xiàn)對葉柄長度等更多葉片表型參數(shù)的測量。

本方法與使用Digimizer 軟件測量得到的香瓜茄葉面積、葉周長、葉長和葉寬結(jié)果的標準均方根誤差（NRMSE） 分別為0.471%、1.103%、0.391%和1.662%，相關(guān)系數(shù)均大于0.97。圖像質(zhì)量會對Image J軟件的測量結(jié)果有一定影響，對灰度格式或低分辨率圖像的影響要小于彩色格式或高分辨率圖像，兩種因素疊加會加劇這種影響。但總體來說，使用Image J 軟件測量植物葉片表型參數(shù)的這種方法對圖像質(zhì)量的要求不高且可靠性好。但是也存在一定缺點，如具有破壞性，不能連續(xù)地去監(jiān)測植物葉片表型參數(shù)的變化情況，但是后期可以用數(shù)碼相機獲取植物葉片圖像的方案來解決。本試驗提出的這種新的基于掃描儀和Image J 軟件的植物葉片表型參數(shù)測量方法具有低成本、半自動、快速、精確、批量的特點，可為科研中植物葉片表型參數(shù)的測量工作提供參考。