兩種食用百合離體快繁體系的建立

彭伯陽，白瑞琴，呂艷芳，范旭東，胡月軍，呂美葉

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011；2.蒙草生態(tài)環(huán)境集團(tuán)（股份）有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；3.呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；4.赤峰市林西縣農(nóng)牧局蔬菜站，內(nèi)蒙古林西 025250；5.土默特左旗鄉(xiāng)村振興統(tǒng)籌發(fā)展中心，內(nèi)蒙古土默特左旗 010100）

百合，花型端莊、莖稈筆直、雅致清幽、寓意含蓄，是盆栽、切花和裝飾環(huán)境的名貴花卉[1-2]，具有極佳的觀賞價(jià)值并兼顧藥用與食用。早在唐代，先民就將百合作為藥用植物使用，而后百合逐漸作為食材開始鮮食并烹調(diào)。隨著食用百合產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，百合逐步成為日常保健與食用的特色花卉[3]。沂水百合是近年來興起的食用百合品種，花色豐富，綜合抗性較強(qiáng)，易于規(guī)?；N植與管理，鱗片口感脆爽回甘，是一種功能全面，集食用、藥用與園林綠化于一身的花卉產(chǎn)品[4]。2016年國(guó)內(nèi)種植面積達(dá)到近萬畝，鱗莖銷售革新了農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，為從業(yè)者帶來了可觀的經(jīng)濟(jì)收入；繁多的加工手段也刺激了民營(yíng)經(jīng)濟(jì)，有力地促進(jìn)了鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)匯[5]。與他品種相比，食用百合品種N82、N136 花色純正、花器官大、鱗片厚實(shí)、鱗莖質(zhì)量高、觀賞性更強(qiáng)，規(guī)?；N植該類品種能獲取更高的經(jīng)濟(jì)利益，可有效提升從業(yè)者的生產(chǎn)積極性。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種日趨完善的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)，具有大規(guī)模生產(chǎn)和集中化管理的特點(diǎn)，符合當(dāng)前農(nóng)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)[6]。百合多個(gè)器官均可作為外植體進(jìn)行組培快繁，其中鱗莖是最常用的培養(yǎng)對(duì)象[7]。對(duì)外植體進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，添加外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)培養(yǎng)至關(guān)重要，決定著培養(yǎng)周期的快慢和誘導(dǎo)植物組織與器官形成的方向[8]。

隨著市場(chǎng)對(duì)沂水食用百合的普遍認(rèn)可，其產(chǎn)量逐年遞增。但常規(guī)繁殖方式生產(chǎn)周期長(zhǎng)，易受外界環(huán)境因素影響，并且還會(huì)誘發(fā)品種退化、優(yōu)質(zhì)性狀分離、毒素不斷積累等不利狀況[9]。通過建立其離體快繁體系，能有效解決常規(guī)繁殖過程中存在的諸多問題，豐富與促進(jìn)地區(qū)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，不僅能夠?yàn)榛ɑ苌a(chǎn)者帶來致富新途徑，還能夠?yàn)槭秤冒俸显趦?nèi)蒙古地區(qū)規(guī)?；a(chǎn)、集約化管理提供相關(guān)的技術(shù)指導(dǎo)與幫助。本試驗(yàn)通過對(duì)食用百合進(jìn)行離體培養(yǎng)，建立快繁體系，旨在縮短其繁殖周期、實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)繁、解決生產(chǎn)難題。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)引種馴化的沂水食用百合品種N82 和N136，選出飽滿厚實(shí)，無損傷、直徑在3 cm 以上的健康鱗莖，以其鱗片作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方式

以MS 培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)，配制過程中添加7 g/L瓊脂粉、30 g 蔗糖，將pH 值調(diào)至5.8±0.2。后續(xù)根據(jù)不同時(shí)期的試驗(yàn)需要添加不同組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（6-BA、TDZ、NAA、2，4-D、IBA）。配制完成后，在121 ℃條件下高溫滅菌20 min 后常溫散熱。溫度為（25±2）℃，光照時(shí)間控制在16 h/d 以上，光強(qiáng)為3 000 lx。

1.2.2 外植體消毒

將鱗莖用清水沖洗，并將鱗片剝離成單片放入1%KMnO4溶液中浸泡并振蕩20 min，后用清水沖洗干凈再轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中。先使用75%乙醇消毒30 s，再分別用1%、3%、5%NaClO 消毒10、15 min，然后用無菌水漂洗，并吸干殘留水。選取鱗片內(nèi)層中下部區(qū)域，將其切割為0.5 cm×0.5 cm 的方塊，以備接種。設(shè)6 個(gè)處理，每個(gè)處理接種30 塊，3 次重復(fù)，共10 瓶。15 d 后計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒完畢并切分好的鱗片分別接種到含有不同濃度配比的6-BA（0.1、0.5、1.0 mg/L）和2，4-D（0.5、1.0、2.0 mg/L）培養(yǎng)基中。設(shè)9 個(gè)處理，MS 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)處理接種30 塊，3 次重復(fù)，共10 瓶。30 d 后計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。

1.2.4 不定芽的增殖培養(yǎng)

選擇初代培養(yǎng)生長(zhǎng)出的2 cm 以上的健壯不定芽（將芽叢切割成單個(gè)芽體）接種到含有不同濃度配比的TDZ（0.1、0.2、0.3 mg/L）和NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）培養(yǎng)基中。設(shè)9 個(gè)處理，MS 培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每個(gè)處理接種30 個(gè)不定芽，3 次重復(fù)，共10 瓶。30 d 后計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。

1.2.5 不定芽的生根培養(yǎng)

選擇3 cm 以上且挺拔健壯的不定芽（將芽叢切割成單個(gè)芽體）分別接種到含有NAA（0.5、1.0、2.0 mg/L）、IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和AC（0.1、0.3、0.5 g/L）培養(yǎng)基中。設(shè)9 個(gè)處理，每個(gè)處理接種30 個(gè)不定芽，3 次重復(fù)，共10 瓶。30 d 后計(jì)算相關(guān)指標(biāo)。

1.2.6 煉苗移栽

選取5 cm 以上且根系生長(zhǎng)良好的組培苗，將瓶口封口膜摘去，煉苗3 d。隨后取出組培苗，用清水清洗根系上殘留的培養(yǎng)基，快速移栽至攪拌均勻并滅菌的基質(zhì)中?；|(zhì)成分配比為草炭土∶珍珠巖=1∶1、草炭土∶河沙=1∶1 和草炭土∶珍珠巖∶河沙=1∶1∶1，純草碳土基質(zhì)為空白對(duì)照。共設(shè)4 個(gè)處理，每處理移栽15 盆，每盆栽種1 株組培苗。30 d 后計(jì)算成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2019 軟件分析整理，利用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，各處理以P＜0.05 表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒處理對(duì)鱗片滅菌效果的影響

由表1 可知，隨著消毒劑濃度的提高與消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，N82 和N136 外植體的污染率下降，死亡率攀升。處理6 兩個(gè)品種外植體的污染率均最低，但死亡率分別高達(dá)43.30%和50.00%。處理1 兩個(gè)品種外植體的死亡率均最低，但污染率分別高達(dá)66.70%和56.70%。可見，這兩種情況下，均導(dǎo)致N82和N136 外植體成活率下降。綜合考慮污染率與死亡率的因素，處理3 品種N82 和N136 的外植體成活率最高，分別為63.30%和66.70%。因此，兩種食用百合外植體最優(yōu)消毒滅菌方法均為75%乙醇消毒30 s 后用3%NaClO 溶液處理10 min。

表1 不同消毒處理對(duì)N82 和N136 外植體的污染率和死亡率

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2 可知，當(dāng)6-BA 濃度一定時(shí)，隨著2，4-D濃度的增加，品種N82 外植體誘導(dǎo)率持續(xù)下降；當(dāng)2，4-D 濃度一定時(shí)，隨著6-BA 濃度的增加，品種N82 誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，說明低濃度2，4-D 與較高濃度6-BA 對(duì)品種N82 外植體不定芽誘導(dǎo)均有促進(jìn)作用。處理3 的誘導(dǎo)率最高，為90.00%，與其他處理差異顯著（P＜0.05），新生不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好，挺拔健壯，葉片肥厚（圖1）；處理2 的誘導(dǎo)率為76.70%；對(duì)照（CK）與處理7 的誘導(dǎo)率最低，分別為13.30%和6.70%，且幼芽低矮瘦弱，顏色淡綠。因此，品種N82最優(yōu)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+MS。

圖1 品種N82 對(duì)照（CK）與處理3 不定芽誘導(dǎo)情況

表2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種N82 不定芽誘導(dǎo)的影響

由表3 可知，當(dāng)6-BA 濃度一定時(shí)，隨著NAA濃度的增加，品種N136 外植體不定芽誘導(dǎo)率呈先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)NAA 濃度一定時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，品種N136 外植體不定芽誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，說明較高濃度NAA 與較高濃度6-BA 對(duì)品種N136 外植體不定芽誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。處理6 誘導(dǎo)率最高，為93.30%，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且不定芽生長(zhǎng)旺盛，葉片數(shù)量多且厚實(shí)，顏色深綠（圖2）；處理5 與處理3 的誘導(dǎo)率分別為76.70%和70.00%；對(duì)照（CK）與處理7 誘導(dǎo)率最低，僅為20.00%，且幼芽低矮纖細(xì)，葉片窄小，顏色淡綠。因此，品種N136 最優(yōu)不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+MS。

圖2 品種N136 對(duì)照（CK）與處理6 不定芽誘導(dǎo)情況

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種N136 不定芽誘導(dǎo)的影響

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽增殖的影響

由表4 可知，當(dāng)NAA 濃度一定時(shí)，隨著TDZ 濃度的增加，品種N82 不定芽增殖系數(shù)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)TDZ 濃度一定時(shí)，隨著NAA 濃度的增加，品種N82 不定芽增殖系數(shù)呈先增大后減小的趨勢(shì)。處理6 的增殖系數(shù)最大，為5.66，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），芽叢長(zhǎng)勢(shì)蔥郁茂密，新生葉片數(shù)量多且顏色深綠（圖3）；處理5 與處理9 的增殖系數(shù)分別為4.86 和5.06，增殖效果次于處理6；對(duì)照（CK）與處理1 的增殖系數(shù)僅為1.33 和2.10，增殖效果最差，且芽叢長(zhǎng)勢(shì)稀疏萎靡，新生葉片少，色澤淡綠，小部分失綠枯萎。因此，品種N82 最優(yōu)不定芽增殖培養(yǎng)基為0.3 mg/L NAA+0.3 mg/L TDZ+MS。

圖3 品種N82 對(duì)照（CK）與處理6 不定芽增殖情況

表4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種N82 和N136 不定芽增殖的影響

當(dāng)NAA 濃度為0.1、0.5 mg/L 時(shí)，隨著TDZ 濃度的增加，品種N136 不定芽增殖系數(shù)先增大后減小；當(dāng)NAA 濃度為0.3 mg/L 時(shí)，隨著TDZ 濃度的增加，品種N136 不定芽增殖系數(shù)呈增大趨勢(shì)。當(dāng)TDZ濃度為0.1、0.2 mg/L 時(shí)，隨著NAA 濃度的增大，增殖系數(shù)持續(xù)的增大；當(dāng)TDZ 濃度為0.3 mg/L 時(shí)，隨著NAA 濃度的增大，增殖系數(shù)先增大后減小。處理8 的不定芽增殖系數(shù)最高，為5.86，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且芽叢長(zhǎng)勢(shì)挺拔茂密，新生葉片寬厚健康，顏色深綠（圖4）；處理6 和處理9 的增殖系數(shù)分別為5.20 和4.80，不定芽增殖效果稍差于處理8；對(duì)照（CK）與處理1 的增殖系數(shù)最低，僅為1.26和1.93，增殖效果不理想，芽叢長(zhǎng)勢(shì)低矮稀疏，新生葉片數(shù)量少且部分發(fā)黃卷曲。因此，品種N136 最優(yōu)不定芽增殖培養(yǎng)基為0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L TDZ+MS。

圖4 品種N136 對(duì)照（CK）與處理8 不定芽增殖情況

2.4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)不定芽生根的影響

由表5 可知，品種N82 的組培苗在3 種誘導(dǎo)條件下，均能生根且生根效果良好。在NAA 處理下，隨著其濃度的增加，生根率呈上升趨勢(shì)，平均生根數(shù)先減少后增加；在IBA 處理下，隨著其濃度的增加，生根率先下降后上升，平均生根數(shù)呈增加趨勢(shì)；在AC處理下，隨著其濃度的增加，生根率與平均生根數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)。處理3、處理6、處理8 的生根率與平均生根數(shù)均為最高，生根率100%，平均生根數(shù)分別為13.90、13.77、13.73 條，且新生根系發(fā)達(dá)強(qiáng)健，數(shù)量多（圖5）。因此，品種N82 組培苗最優(yōu)生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2.0 mg/L NAA+MS、2.0 mg/L IBA+MS、0.3 g/L AC+MS。

圖5 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種N82 新生芽生根的影響

表5 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種N82 和N136 不定芽生根的影響

品種N136 組培苗在3 種誘導(dǎo)條件下，同樣生根效果顯著。在NAA 處理下，隨著其濃度的增加，生根率與平均生根數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)；在IBA處理下，隨著其濃度的增加，組培苗生根率與平均生根數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)；在AC 處理下，隨著其濃度的增加，生根率與平均生根數(shù)呈上升趨勢(shì)。3 種誘導(dǎo)條件中，AC 對(duì)品種N136 生根效果最佳，處理9的生根率最高，為100%，平均生根數(shù)13.93 條，且新生根系質(zhì)量高并伴有次生根（圖6）；NAA 與IBA 生根效果稍差，處理1 與處理6 的生根率分別為96.70%和90.00%。因此，品種N136 組培苗最優(yōu)生根培養(yǎng)基為0.5 g/L AC+MS。

圖6 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)品種N136 新生芽生根的影響

2.5 不同基質(zhì)對(duì)組培苗移栽的影響

由表6 可知，品種N82 組培苗在處理3 條件下，移栽成活率最高，為100%，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且移栽后生長(zhǎng)良好，幼苗挺拔、葉片舒展新生數(shù)量多、顏色深綠油亮（圖7）。處理4 的成活率為93.30%，稍低于處理3；處理1 的移栽成活率最低，為60.00%。因此，品種N82 組培苗最優(yōu)移栽基質(zhì)為草炭土∶河沙=1∶1。

圖7 移栽30 d 后品種N82 生長(zhǎng)情況

表6 不同基質(zhì)對(duì)品種N82 和N136 組培苗移栽的影響

品種N136 組培苗在處理4 條件下，移栽成活率最高，為100%，與其他處理相比差異顯著（P＜0.05），且移栽后幼苗蔥郁挺拔，新生葉片較多，富有光澤，顏色濃綠（圖8）；處理3 的成活率為83.30%，稍低于處理4；處理1 與處理2 的移栽成活率均較低，分別為53.30 和56.70。因此，品種N136 組培苗最優(yōu)移栽基質(zhì)為草炭土∶珍珠巖∶河沙=1∶1∶1。

圖8 移栽30 d 后品種N136 生長(zhǎng)情況

3 討論與結(jié)論

對(duì)外植體材料進(jìn)行有效的消毒滅菌，防止外界微生物污染是組織培養(yǎng)的首要步驟。在相關(guān)消毒滅菌研究中，韓淞名等[10]得出外植體最優(yōu)消毒方式為75%乙醇消毒20 s，后用10%NaClO 處理8 min。樊敏等[11]研究認(rèn)為，75%乙醇配合0.1%HgCl2處理外植體滅菌效果較好。本試驗(yàn)兩種食用百合外植體材料從土壤中獲取，病菌含量較高，所以采用高濃度消毒劑并適當(dāng)延長(zhǎng)了消毒時(shí)間。受通風(fēng)條件所限，本試驗(yàn)選擇低毒性消毒劑進(jìn)行滅菌。此外，在組織培養(yǎng)過程中外植體的選擇與選材部位會(huì)影響誘導(dǎo)方向和誘導(dǎo)率。在南川百合組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究中，趙靜等[12]采用鱗片、葉片、莖段、花器官和再生小鱗莖的鱗片等不同器官探究了南川百合最優(yōu)外植體部位，為鱗片下部。胡彬杰等[13]以沂水食用百合鱗莖為外植體，探討了其不同部位對(duì)誘導(dǎo)率的影響，得出最佳誘導(dǎo)位置為鱗莖的內(nèi)層中部。本試驗(yàn)參考胡彬杰等[13]的研究結(jié)果，且由于食用百合鱗莖易于獲取，方便貯藏，富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更利于不定芽誘導(dǎo)與后期生長(zhǎng)，所以選取鱗莖鱗片作為外植體進(jìn)行體外培養(yǎng)。

在不定芽誘導(dǎo)過程中，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)品種N82 外植體在2，4-D 與6-BA 共同誘導(dǎo)條件下，成功誘導(dǎo)出再生芽，且低濃度2，4-D（0.5 mg/L）和較高濃度6-BA（1.0 mg/L）組合誘導(dǎo)效果最優(yōu)。但2，4-D 與6-BA 組合對(duì)品種N136 不定芽誘導(dǎo)效果不佳，誘導(dǎo)率極低。試驗(yàn)又以NAA 和6-BA 組合，重新對(duì)品種N136 外植體進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)不定芽誘導(dǎo)效果良好，且較高濃度的NAA（1.0 mg/L）與6-BA（1.0 mg/L）組合誘導(dǎo)率更高。張艷波[14]研究得出，在培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 2，4-D 與0.5 mg/L 6-BA 可誘導(dǎo)毛百合愈傷組織發(fā)生。而陳姝男[15]研究發(fā)現(xiàn)，在加入1.0 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA 的基礎(chǔ)上，再添加少量AC，可使寶興百合產(chǎn)生不定芽且效果明顯。本試驗(yàn)結(jié)果與張艷波[14]和陳姝男[15]研究結(jié)果存在差異，出現(xiàn)差異的原因可能是試驗(yàn)所選取的百合品種、外植體部位和誘導(dǎo)方向不同所致，本試驗(yàn)通過由外植體直接形成器官原基誘導(dǎo)形成不定芽的方式，獲得完整的再生植株。

在不定芽增殖試驗(yàn)中，蘇菁華[16]利用0.2 mg/L TDZ 誘導(dǎo)渥丹與川百合的不定芽，誘導(dǎo)率高達(dá)86%。呂翠竹等[17]在綠花百合組培芽增殖研究中，添加0.2 mg/L TDZ 與0.2 mg/L NAA 來促進(jìn)不定芽增殖，增殖系數(shù)為5.59。與本試驗(yàn)所得結(jié)果相同，表明低濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑TDZ，對(duì)不定芽的增殖有明顯的促進(jìn)作用。

在生根誘導(dǎo)過程中，本試驗(yàn)選擇生長(zhǎng)素（NAA、IBA）與AC 分別對(duì)不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)。而仙鶴等[18]在對(duì)蘭州百合組培苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)時(shí)探究糖源對(duì)生根的影響得出40 g/L 蔗糖+1/2MS 為最優(yōu)生根培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)一定濃度的蔗糖利于組培苗生根。邵果園等[18]則在黃色馬蹄蓮組培快繁研究中得到最優(yōu)生根培養(yǎng)基為0.4 mg/L IBA+1/2MS；張艷波[13]在試驗(yàn)中得出毛百合最優(yōu)生根培養(yǎng)基為0.5 g/L AC+MS。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高濃度生長(zhǎng)素對(duì)食用百合N82 組培苗生根更為有效，且生根迅速，新生根系發(fā)達(dá)；AC 為品種N136 組培苗生根提供暗環(huán)境，促進(jìn)根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用。

本試驗(yàn)中2 個(gè)品種均表現(xiàn)出較高的移栽成活率，說明選取的3 種基質(zhì)及配比對(duì)幼苗移栽影響顯著。邵果園等[19]研究得出，腐質(zhì)土∶椰糠∶珍珠巖=1∶1∶1時(shí)，黃色馬蹄蓮的移栽成活率最高；韓淞名等[10]研究得出，草炭土∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1 時(shí)，雄性不育百合的移栽效果最佳；陳少鵬等[20]研究得出，毛百合的最優(yōu)移栽基質(zhì)為草炭土∶園土∶河沙=1∶1∶1 時(shí)，移栽狀態(tài)良好。本試驗(yàn)所選移栽基質(zhì)成分與其他學(xué)者所選存在差異，其原因在于試驗(yàn)材料的品種生長(zhǎng)特性與原生環(huán)境不同所致。