微生物菌劑對(duì)連作蒙古黃芪生物量及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

栗瑞紅，李紅霞，李長(zhǎng)勝，劉培京，王 飛，顧 揚(yáng)

（1.呼和浩特市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；3．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌 330045；4．內(nèi)蒙古盛齊堂生態(tài)藥植有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 011500）

黃芪（Astragalus membranaceusvar.mongholicus）是多年生豆科植物，以干燥根入藥，是臨床上常見(jiàn)的中藥材之一，主要產(chǎn)于我國(guó)內(nèi)蒙古、黑龍江、河北等地[1]。隨著人們對(duì)黃芪需求量的增多，黃芪的栽培面積也越來(lái)越大。但黃芪多年連作，使土壤營(yíng)養(yǎng)元素缺失，微生物菌群失衡，有害菌群繁殖，土傳病害增加[2-3]，再加上中藥材栽培過(guò)程中長(zhǎng)期施用化肥，忽視有機(jī)肥的使用，造成肥效下降、肥料利用率不高、土壤板結(jié)等弊端。土壤條件的惡化使中藥材的品質(zhì)降低，而合理施肥可以改善土壤條件，提高中藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

近年來(lái)，利用有益微生物進(jìn)行病害生物防治，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，并調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)成分，改善品質(zhì)，顯示出有利潛力。微生物肥料可以通過(guò)改變土壤有效成分、土壤酶活性、土壤微生物種類和數(shù)量來(lái)改善植物的生長(zhǎng)環(huán)境，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)并改變其品質(zhì)[5-6]。李娟等[7]研究發(fā)現(xiàn)，生物肥料HZ-24 對(duì)黃芪根直徑和干重有顯著促進(jìn)作用，推測(cè)生物肥料中的假節(jié)桿菌可以改變黃芪根際細(xì)菌/真菌比例，增強(qiáng)土壤脲酶等活性，增加根瘤重。郭捷等[8]篩選到兩株拮抗芽孢桿菌，可以顯著促進(jìn)黃芪皂苷Ⅰ和Ⅱ含量。也有研究表明，在鹽堿地上，以甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌為主的微生物菌劑對(duì)蒙古黃芪的抗逆性、光合作用效率、生長(zhǎng)特性和根系產(chǎn)量沒(méi)有顯著性影響，而有機(jī)肥增產(chǎn)作用明顯[9]。張會(huì)會(huì)等[10]研究發(fā)現(xiàn)3 種微生物菌劑和生物有機(jī)肥對(duì)黃芪根腐病的防治效果不甚理想?？梢?jiàn)，微生物肥料在黃芪栽培上的應(yīng)用效果在不同地域存在較大差異，作用機(jī)制研究還很缺乏，不利于黃芪栽培產(chǎn)量和品質(zhì)的提升。

本試驗(yàn)以主產(chǎn)于內(nèi)蒙古的蒙古黃芪為材料，針對(duì)多年連作黃芪土壤，比較考察ETS 復(fù)合菌劑（ETS）、多維特抗菌劑（DWTK）、多功能維生素菌劑（WSS）3 種微生物菌劑對(duì)蒙古黃芪生物量以及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為提高連作黃芪產(chǎn)量和抗病性提供施肥措施和技術(shù)途徑。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)地點(diǎn)為內(nèi)蒙古盛齊堂生態(tài)藥植有限公司第一基地，位于呼和浩特市和林格爾縣城關(guān)鎮(zhèn)馬群溝村。該區(qū)域?qū)儆谥袦貛О敫珊荡箨懶约撅L(fēng)氣候，春季多風(fēng)，氣溫回升快且冷暖變化大，夏季降水多，主要集中在7月和8月，年均降水量約392 mm。土壤類型為栗褐土，連續(xù)5年種植蒙古黃芪。土壤有機(jī)質(zhì)含量7.6%、全氮含量0.45 g/kg、有效磷含量17.00 mg/kg、速效鉀含量126.00 mg/kg、pH 值8.6。

1.2 不同菌劑對(duì)連作蒙古黃芪生物量的影響

試驗(yàn)時(shí)間為2019年4—11月。試驗(yàn)共設(shè)置空白（CK）、ETS 復(fù)合菌劑（ETS）、多維特抗菌劑（DWTK）、多功能維生素菌劑（WSS）4 個(gè)處理，各處理均含3 個(gè)平行重復(fù)，每個(gè)平行為1 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積60 m2（3 m× 20 m），小區(qū)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)約移栽種苗1 000 株。各菌劑用量為9 kg，ETS為ETS 復(fù)合菌劑用清水稀釋150 倍后噴施地上部及灌根，DWTK 將多維特抗菌劑（DWTK）稀釋300 倍灌根，WSS 采用多功能維生素菌劑（WSS）1∶50 倍液進(jìn)行灌根。收獲后，地上部分刈割后稱量重量，根部清洗植株表面泥土?xí)窀杀砻嫠趾蠓Q量重量。

1.3 不同菌劑對(duì)連作蒙古黃芪土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

OTU（operational taxonomic unit）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個(gè)分類單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的同一標(biāo)志。要了解一個(gè)樣本測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作。通過(guò)歸類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè)OTU。根據(jù)不同的相似度水平，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU 劃分，通常對(duì)97%相似水平下的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。Alpha 多樣性反映微生物群落的豐富度和多樣性，Shannon-Wiener 是用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)，Shannon-Wiener 值越大，群落多樣性越高。Chao1 用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，與群落豐富度正相關(guān)。Observed species指數(shù)表示該樣本中含有的物種數(shù)，數(shù)值越高，表明樣本物種豐富度越高。PD_whole_tree 是基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)計(jì)算的一種多樣性指數(shù)，它用各個(gè)樣本中OTUs的代表序列構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的距離，將某一個(gè)樣本中的所有代表序列的枝長(zhǎng)加和得到數(shù)值，且數(shù)值越大，群落多樣性越高。

收獲后采集蒙古黃芪根部新鮮土樣，經(jīng)土壤總DNA 提取試劑盒提取總DNA 后，利用特異性引物擴(kuò)增真菌ITS1 基因的ITS1～I(xiàn)TS2 區(qū)（引物序列為CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；TGCGTTCTTCATC GATGC）、使用Agencourt AMPure XP 核酸純化試劑盒（AXYGEN 公司）進(jìn)行PCR 產(chǎn)物純化，由北京奧維森科技有限公司使用Illumina Misep PE300 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序[11]。本試驗(yàn)對(duì)測(cè)得的Fastq 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控處理，對(duì)所有序列進(jìn)行OTU 劃分，通常對(duì)97%相似水平下的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，參考Unite（Release 7.2 http：//unite.ut.ee/index.php）的真菌數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌分類信息的注釋?；贠TU 的豐度結(jié)果，使用Qiime 軟件計(jì)算樣本的Shannon-Wiener 指數(shù)等。

Shannon-Wiener 指數(shù)

式中，Pi為樣品中屬于第i種的個(gè)體的比例，如樣品總個(gè)體數(shù)為N，第i種個(gè)體數(shù)為ni，則Pi=ni/N。

式中，Schao1 為估計(jì)的OTU 數(shù)，Sobs為觀測(cè)到的OTU 數(shù)；n1為只有一條序列的OTU 數(shù)目；n2為只有兩條序列的OTU 數(shù)目。

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)蒙古黃芪生物量和土壤主要優(yōu)勢(shì)真菌的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差（ANOVA）分析，采用最小顯著性差異法（LSD）分析不同處理間的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌劑對(duì)連作蒙古黃芪生物量影響

由表1 可知，不同菌劑對(duì)蒙古黃芪地上部生物量的增長(zhǎng)作用不同。所選用的3 種菌劑中，多維特抗菌劑（DWTK）具有顯著的促生作用，蒙古黃芪地上部生物量達(dá)到每小區(qū)24.20 kg，比CK 顯著增加了17.5%（P＜0.05）。與CK 相比，ETS 復(fù)合菌劑（ETS）和多功能維生素菌劑（WSS）對(duì)蒙古黃芪地上部生物量無(wú)顯著影響（P>0.05）。

表1 不同菌劑對(duì)連作蒙古黃芪生物量的影響 單位：kg

不同菌劑對(duì)蒙古黃芪根部生物量影響不同。所選用的3 種菌劑中，多維特抗菌劑（DWTK）顯著提升蒙古黃芪根部生物量（P＜0.05），達(dá)到每小區(qū)31.7 kg，比CK 顯著增加了18.4%。與CK 相比，ETS 復(fù)合菌劑（ETS）和多功能維生素菌劑（WSS）對(duì)蒙古黃芪根部生物量無(wú)顯著影響（P>0.05）。黃芪根部有很高的藥用價(jià)值，其根部生物量作為產(chǎn)量測(cè)算。由此可知，3 種微生物菌劑中多維特抗菌劑增產(chǎn)效果顯著。

2.2 不同菌劑對(duì)連作蒙古黃芪土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)中產(chǎn)生有效OTU 2 981 個(gè)，CK、DWTK、ETS、WSS 樣本分別有1 019、1 984、1 652、1 461 個(gè)OTU。3 種微生物菌劑均能一定程度上增加土壤真菌OTU 數(shù)量，其中施用多維特抗菌劑處理的土壤真菌OTU 數(shù)量遠(yuǎn)高于CK，且比CK 提高了94.7%。對(duì)連作蒙古黃芪的根際土壤真菌群落進(jìn)行聚類，由圖1 可知，4 個(gè)樣本共同包含515 個(gè)OTU，占總樣本數(shù)量的17.3%；DWTK 特有OTU 376 個(gè)，占其樣本數(shù)量的19.1%，與CK 共有28 個(gè)OTU；ETS 特有378 個(gè)，與CK 共有35 個(gè)OTU；WSS 特有191 個(gè)OTU，與CK 共有25 個(gè)OTU。

圖1 不同處理蒙古黃芪根際土壤真菌特異OTU 數(shù)量

由圖2 可知，與CK 相比，DWTK 和ETS 處理均顯著增加Shannon-Wiener（P＜0.05）、Chao1（P＜0.000 1）、Observed species（P＜0.000 1）和PD_whole_tree 指數(shù)（P＜0.000 1），WSS 處理顯著增加Chao1、Observed species 和PD_whole_tree 指數(shù)（P＜0.05）。DWTK、ETS和WSS 處理均可顯著增加連作蒙古黃芪的根際土壤真菌多樣性和豐富度，且DWTK、ETS 處理連作蒙古黃芪的根際土壤真菌多樣性和豐富度高于WSS處理。

圖2 不同處理的蒙古黃芪根際土壤真菌Alpha 多樣性指數(shù)

采用RDP Classifier 算法對(duì)OTU 代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，并在各個(gè)水平（family、genus）注釋其群落的物種信息，用柱狀圖可視化觀察不同樣本（或者分組）的物種組成情況（圖3）。圖3 顯示的是相對(duì)豐度1%以上的物種信息。

樣本真菌群落結(jié)構(gòu)可以反映不同處理樣本在同一分類水平中菌群數(shù)量的差異。由圖3a 可知，在科水平下，不同處理連作蒙古黃芪的根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)各類真菌類群所占比例均有一定差異，與CK相比，DWTK、ETS 和 WSS 處理癬囊腔菌科（Plectosphaerellaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）和牛肝菌科（Boletaceae）豐度升高，而叢赤殼科（Nectriaceae）、小脆柄菇科（Psathyrellaceae）、似鎖瑚菌科（Clavulinaceae）和小球腔菌科（Leptosphaeriaceae）豐度降低；與ETS 組相比，DWTK 處理Nectriaceae和 Clavulinaceae 豐 度 升 高 ，Mortierellaceae、Psathyrellaceae、Boletaceae 和Leptosphaeriaceae 豐度降低。由圖3b 可知，在屬水平下，與CK 相比，DWTK、ETS 和 WSS 處 理 癬 囊 腔 菌 屬（Plectosphaerella）、赤霉屬（Gibberella）、被孢霉屬（Mortierella）和牛肝菌屬（Boletus）豐度升高，而鐮刀菌屬（Fusarium）、似鎖瑚菌屬（Clavulicium）、小脆柄菇屬（Psathyrella）和白粉寄生孢屬（Ampelomyces）豐度降低，DWTK 和WSS 處理還增加盤菌屬（Peziza）豐度。與ETS 相比，DWTK 降低Mortierella、Boletus和Ampelomyces豐度。與其他3 個(gè)處理相比，DWTK提高了Gibberella豐度。與CK 相比，3 種微生物菌劑對(duì)土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響明顯。

圖3 物種組成分析柱狀圖

3 討論

研究和開(kāi)發(fā)綠色環(huán)保的專用肥料，實(shí)現(xiàn)黃芪生態(tài)種植，是提高中藥材栽培產(chǎn)量和質(zhì)量的重要措施。相比于傳統(tǒng)的化肥，微生物肥料可通過(guò)活化礦質(zhì)元素、提高土壤酶活性等機(jī)制提高土壤肥力，并提供生長(zhǎng)因子促進(jìn)植物生長(zhǎng)，已廣泛應(yīng)用于作物、蔬菜和果樹(shù)生產(chǎn)中[12]。合理的施用菌肥還能不同程度地緩解作物因連作出現(xiàn)的土傳病害問(wèn)題[13-14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同菌劑對(duì)黃芪增產(chǎn)效果參差不齊[7，10]。本試驗(yàn)所采用的3 種微生物菌劑中僅有多維特抗菌劑（DWTK）對(duì)提升蒙古黃芪生物量具有顯著的作用，另外兩種菌劑沒(méi)有促生效果。本試驗(yàn)結(jié)論與前人研究結(jié)果相似。因此，在黃芪種植中采用適宜的微生物菌劑對(duì)中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量至關(guān)重要。本試驗(yàn)多維特抗菌劑（DWTK）還需進(jìn)行多年、多點(diǎn)試驗(yàn)，明確增產(chǎn)提質(zhì)效果，才能在內(nèi)蒙古大規(guī)模推廣應(yīng)用。

黃芪連作栽培中的一種常發(fā)性土傳病害表現(xiàn)為根腐病，病原菌有3 種：腐皮鐮刀菌（Fusarium solaniun）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）[2-3，15]。本試驗(yàn)所在場(chǎng)地已連續(xù)5年種植蒙古黃芪，連作障礙明顯，在本試驗(yàn)對(duì)照組檢出土壤真菌種屬中Fusarium豐度較高，是潛在致病菌。本試驗(yàn)并沒(méi)有研究DWTK 菌劑對(duì)Fusarium的拮抗作用。今后，可開(kāi)展針對(duì)Fusarium真菌病害的拮抗菌或抑菌活性物質(zhì)的篩選研究工作，擴(kuò)大菌種資源，進(jìn)一步提高微生物菌劑的效果。

作物根際土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成變化能反映土壤生態(tài)現(xiàn)狀及變化趨勢(shì)，對(duì)作物健康十分重要[16]。土壤微生物種群的變化是發(fā)生連作障礙的原因之一[17]，特別是一些病原微生物的嚴(yán)重富集，真菌種類和數(shù)量的增多，細(xì)菌等有益菌群的減少[18]。李冰圳等[1]研究發(fā)現(xiàn)，采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)蒙古黃芪不同發(fā)育期根際細(xì)菌和真菌群落多樣性，黃芪根際真菌主要包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、接合菌門、壺菌門和球囊菌門，真菌群落結(jié)構(gòu)差異受發(fā)育期影響較小。HE 等[19]在研究不同種類深色有隔內(nèi)生真菌和里氏木霉對(duì)蒙古黃芪生長(zhǎng)的作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下，深色有隔內(nèi)生真菌Acrocalymma vagum、Paraboeremia putaminum和綠色木霉（Trichoderma viride）雙重接種可有效提高黃芪根際有效N、P 和K含量，子囊菌門（Ascomycota）是真菌群落的優(yōu)勢(shì)門，且聯(lián)合接種對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。本試驗(yàn)使用的3 種微生物菌劑也能影響蒙古黃芪土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，其中多維特抗菌劑（DWTK）降低病原菌Fusarium豐度，同時(shí)較其他3 個(gè)處理提高了Gibberella豐度。多維特抗菌劑（DWTK）組生物量比對(duì)照顯著增加的原因可能是降低病原菌Fusarium豐度，與Gibberella產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)的赤霉素的共同作用。關(guān)于Gibberella是否可以促進(jìn)蒙古黃芪生物量提高，對(duì)蒙古黃芪生長(zhǎng)的影響這點(diǎn)可以做進(jìn)一步研究。今后，可深入研究多維特抗菌劑降低病原真菌Fusarium等真菌菌群豐度的分子機(jī)制，為優(yōu)良菌劑的應(yīng)用推廣提供堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

在連續(xù)種植蒙古黃芪多年地塊上，多維特抗菌劑（DWTK）對(duì)蒙古黃芪具有顯著促生作用，地上部分生物量比對(duì)照增加了17.5%，根部生物量比對(duì)照顯著增加了18.4%。施用微生物菌劑均能一定程度上增加土壤真菌群落數(shù)量，從而改善土壤環(huán)境。施用多維特抗菌劑（DWTK）的連作蒙古黃芪根際土壤中，病原真菌Fusarium豐度顯著降低，Gibberella豐度顯著提高。