基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)的黃淮海玉米雜優(yōu)模式分析

柴文波，李淑芬，李洪濤，許瀚元，祝 慶，王 軍

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇連云港 222000）

玉米（Zea mays）是世界上重要的糧食作物，目前種植面積位居糧食作物第一，隨著人們對(duì)玉米需求量的逐漸增大，提高玉米產(chǎn)量已成為亟待解決的問(wèn)題，而玉米的產(chǎn)量又與玉米種子的優(yōu)良與否有著極其重要的關(guān)系[1]。雜交模式是玉米育種的重要基礎(chǔ)性工作，玉米雜種優(yōu)勢(shì)群及其雜優(yōu)模式的研究對(duì)于提高玉米育種的效率具有重要意義[2]。雜優(yōu)模式受到了國(guó)內(nèi)外的廣泛重視，特別是近十年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展為在分子水平上研究玉米的雜種優(yōu)勢(shì)群及其雜優(yōu)模式提供了新的手段[3-5]。有學(xué)者利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP 等[6]分子標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)玉米血緣關(guān)系明確的玉米材料進(jìn)行了雜種優(yōu)勢(shì)群劃分，所得結(jié)果與趙旭等研究的系譜基本吻合，同時(shí)也有對(duì)血緣關(guān)系模糊的材料進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分，所得結(jié)果與生產(chǎn)實(shí)踐中實(shí)際應(yīng)用的雜種優(yōu)勢(shì)配對(duì)模式也基本一致[7-8]。

SSR 又稱微衛(wèi)星，是由簡(jiǎn)單的重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，主要包括核心序列以及兩側(cè)的側(cè)翼序列[9]。一般情況下，微衛(wèi)星核心序列的串聯(lián)重復(fù)數(shù)與其等位基因數(shù)有很大的正相關(guān)性[10]，而且序列重復(fù)次數(shù)越多，變異的可能性越大，則該微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)目就越多。微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)在不同物種間、品種間的多態(tài)性比較大，但是微衛(wèi)星兩側(cè)的側(cè)翼序列是相對(duì)比較保守的單拷貝序列[11]?？筛鶕?jù)對(duì)其保守的邊界序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過(guò)PCR 技術(shù)獲得微衛(wèi)星片段來(lái)分析串聯(lián)重復(fù)次數(shù)的遺傳變異。目前，SSR 標(biāo)記是進(jìn)行分子指紋譜圖構(gòu)建和親緣關(guān)系劃分的主要方法。

雜種優(yōu)勢(shì)群的選擇有利于真實(shí)地反映遺傳自交系的背景，有助于自交系的改良和雜交種的選配。L239 是國(guó)外雜交種選系，L7221 是昌7-2 變異株自交選育，利用L239 和L7221 雜交選育并大規(guī)模推廣的品種有很多，如隆平206 和紅旗968，隆平206具有高產(chǎn)、抗逆、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，是黃淮海地區(qū)廣泛栽培的玉米品種。本試驗(yàn)主要采用了40 份玉米自交系分析其與L239 和L7221 的親緣關(guān)系，從而確定其雜種優(yōu)勢(shì)群，為黃淮海地區(qū)雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料包括42 個(gè)玉米自交系，由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。經(jīng)文獻(xiàn)查詢[12-14]，42 份玉米自交系的親本來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 供試玉米自交系的親本來(lái)源

1.2 DNA 提取方法

采用DNA 快速提取法[15]提取玉米基因組DNA。將玉米種子置于沙土中發(fā)芽，待其長(zhǎng)到三葉期時(shí)取葉片。

1.3 SSR 引物合成

引物序列參考王鳳格等[16]的研究，篩選的原則是在染色體上平均分布。56 條引物由上海生物工程有限公司合成。

1.4 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增體系為20 μL，其中含有10×Buffer 2 μL，DNTPs 1.6 μL，上下游引物稀釋為10 ng/μL并加入1 μL，50 ng/μL 的基因組2 μL，酶0.2 μL，水12.2 μL。

熱循環(huán)反應(yīng)體系為：94 ℃模板DNA 預(yù)變性5 min，94 ℃模板DNA 變性1 min，50～65 ℃引物與模板靶位點(diǎn)結(jié)合30 s，72 ℃引物沿模板延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min。

1.5 SSR 分析檢測(cè)

對(duì)擴(kuò)增完的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為12 倍，然后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在相同分子量大小的位置上，有帶的記為“1”，無(wú)帶的記為“0”。按NEI 等[17]的方法分別計(jì)算自交系間的遺傳距離（genetic distance，GD），公式為

式中，Pij是自交系i和自交系j共同具有的帶數(shù)；Pi和Pj分別為自交系i和j具有的帶數(shù)。

用SPSS 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件按WARD 連接法對(duì)GD進(jìn)行聚類。按SMITH 等[18]提供的公式計(jì)算每1 對(duì)SSR 引物的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC），即

式中，Pi為i位點(diǎn)的基因頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火溫度的確定

采用其中的骨干自交系鄭58 為模板進(jìn)行梯度PCR，確定不同引物的最適退火溫度。根據(jù)圖1 選擇條帶最亮的溫度作為該引物的退火溫度。經(jīng)過(guò)引物篩選，確定了56 條引物，引物退火溫度見(jiàn)表2。采用每條引物的最適退火溫度進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖1 ole1 引物擴(kuò)增篩選圖譜

2.2 SSR 引物的確定

依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳中的可讀性、多態(tài)性，并且考慮在染色體上的分布情況，最終確定了56 條引物擴(kuò)增的數(shù)據(jù)是可行的，并對(duì)42 份供試材料進(jìn)行分析。56 條引物在染色體上的分布情況見(jiàn)圖2，共檢測(cè)到284 個(gè)等位基因變異，同時(shí)計(jì)算各引物在42 個(gè)玉米資源上的等位基因數(shù)、引物的多態(tài)性（PIC）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因型多樣性（H′）。

圖2 56 條引物在玉米10 條染色體上的定位

由表3 可知，56 條引物在42 份玉米自交系中擴(kuò)增出的等位基因數(shù)為2～9。56 條引物的多態(tài)性信息量為0.43～0.86。umc1887 的多態(tài)性信息量最低，為0.43；tip5 的多態(tài)性信息量最高，為0.86。在56 條引物中有47 條引物的多態(tài)性信息量高于0.60，表明本試驗(yàn)所用的引物是合格的。有效等位基因數(shù)為1.75～7.04，基因型多樣性為0.62～2.83。該結(jié)果表明引物在42 份供試材料中基因變異較為豐富，多態(tài)性較高。

表3 56 條引物在42 份供試材料中的遺傳信息

2.3 L239 與L7221 與其他自交系之間的遺傳距離

根據(jù)56 條SSR 引物的分析結(jié)果，利用DPS軟件計(jì)算L239 與L7221 與其他自交系間的遺傳距離。 L239 與CA375 的遺傳距離最近，為0.50；L7221 與LX9801 和農(nóng)大178 的遺傳距離較近，分別為0.43 和0.56。

2.4 42 份供試種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 分析42 份玉米自交系的遺傳相似性，并繪成樹狀圖。由圖3 可知，L7221主要屬于塘四平頭群，與LX9801 的種質(zhì)資源關(guān)系聚為一類，同時(shí)與農(nóng)大178 的親緣關(guān)系較近，猜測(cè)可能同時(shí)含有PN 血緣。而L239 主要與改良Reid 群的種質(zhì)資源關(guān)系比較近，同時(shí)與含有熱帶血緣的鐵7922 和齊205 以及含有本土血緣的鄭22 聚為一類，說(shuō)明L239 是以改良Reid 群為主導(dǎo)，同時(shí)含有熱帶血緣和本土基因。

圖3 42 份玉米自交系樹狀圖

3 討論與結(jié)論

研究現(xiàn)有玉米種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系對(duì)正確認(rèn)識(shí)我國(guó)玉米種質(zhì)資源基礎(chǔ)，提高其利用效率具有重要意義。目前，采用分子標(biāo)記的方法來(lái)研究物種的親緣關(guān)系和雜種優(yōu)勢(shì)普遍存在，RFLP、RAPD、SSR、AFLP得到了廣泛的應(yīng)用。MELCHINGER 等[19]采用RFLP分子標(biāo)記的方法研究了劃分玉米雜種優(yōu)勢(shì)群的可行性。SMITH 等[18]研究了利用SSR 和RFLP 標(biāo)記對(duì)58 個(gè)玉米自交系的劃群分析，表明兩種劃分結(jié)果高度相似并且與系譜分析基本吻合。本試驗(yàn)所選用的56 條SSR 引物是經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證的，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)的PCR 擴(kuò)增數(shù)據(jù)時(shí)可以直接讀出片段的大小，結(jié)果易于統(tǒng)計(jì)分析。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)42 份玉米自交系進(jìn)行分析，共檢測(cè)到284 個(gè)等位基因變異，每56 條引物的等位基因數(shù)為2～9，多態(tài)性信息量為0.43～0.86，說(shuō)明L239 等42 份材料間存在著豐富的遺傳變異，同時(shí)也說(shuō)明了本試驗(yàn)所用的56 條SSR 引物多態(tài)性高，毛細(xì)管電泳檢測(cè)分辨率高，可以準(zhǔn)確地鑒定出供試材料的遺傳關(guān)系。這也進(jìn)一步說(shuō)明SSR 分子標(biāo)記技術(shù)可以從分子水平上對(duì)系譜不清晰、血緣不明確的品種進(jìn)行劃分。

選育高配合力的雜種優(yōu)勢(shì)群，有利于提高我國(guó)玉米的產(chǎn)量。分析L239 與L7221 親緣關(guān)系有利于預(yù)測(cè)玉米的雜種優(yōu)勢(shì)，對(duì)玉米的育種有很大影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，L7221 主要來(lái)源于塘四平頭類群，說(shuō)明其遺傳背景豐富，不僅包括了塘四平頭類群，還含有熱帶PN 類群的遺傳背景，同時(shí)含有本土的遺傳因素。由于PN 與國(guó)內(nèi)4 大種質(zhì)都有較高的配合力，組配的雜交種具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、根系發(fā)達(dá)、耐旱、抗倒伏等優(yōu)點(diǎn)，高抗多種病害，PN 種質(zhì)得到廣泛應(yīng)用[20]。L239 主要屬于改良Reid 群，同時(shí)融入了優(yōu)良的熱帶種質(zhì)資源的基因和本土優(yōu)良基因。L239 與L7221雜優(yōu)模式群主要為改良Reid 群×塘四平頭群。正是由于獲得的雜交種遺傳背景豐富，才使其獲得的玉米品種在黃淮海地區(qū)大面積推廣。從L239 與L7221親緣關(guān)系來(lái)看，符合黃淮海地區(qū)的主要雜種優(yōu)勢(shì)模式為改良Reid 群×塘四平頭群。雜種優(yōu)勢(shì)群的確定，有利于提高玉米雜交的效率，從而選育出高產(chǎn)的玉米品種。