MiR-34a靶向SIRT1促進THP-1人巨噬細胞的脂質蓄積并降低膽固醇流出的作用分析

王文娟，郭志浩，彭雪，趙莉，趙紅英，谷倩倩

動脈粥樣硬化以脂質代謝異常和多因素慢性疾病異常炎癥反應為特征，是全球心血管疾病發(fā)病和死亡的主要原因之一[1]。巨噬細胞膽固醇流出的不平衡最終導致巨噬細胞性泡沫細胞增加，并聚集在動脈壁上，成為動脈粥樣硬化早期病變的標志[2]。沉默信息調節(jié)因子-1（SIRT1）在膽固醇穩(wěn)態(tài)和動脈粥樣硬化發(fā)生的關鍵生物學過程中發(fā)揮關鍵作用。一旦被激活，SIRT1則會誘導巨噬細胞中與膽固醇外流有關的級聯(lián)基因[3]。肝臟X受體（LXR）鑒定為SIRT1的下游級聯(lián)基因，能促進巨噬細胞膽固醇外流，維持細胞膽固醇穩(wěn)態(tài)，對動脈粥樣硬化的保護作用[4]。微小RNA（microRNA，miR）通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3' -UTR）結合來調節(jié)基因表達。表達譜研究表明，與健康動脈相比，許多miR在動脈粥樣硬化斑塊中異常表達，提示它們與動脈粥樣硬化的進展有關[5]。越來越多的miR被發(fā)現(xiàn)參與巨噬細胞性泡沫細胞的形成和動脈粥樣硬化[6]。利用生物信息學分析，預測可能靶向人SIRT1的miR，發(fā)現(xiàn)miR-34a調控SIRT1的概率很高。既往研究表明，miR-34a與甲狀腺乳頭狀癌、肝癌、乳腺癌和脂肪生成有關[7]。然而，miR-34a是否通過靶向SIRT1促進THP-1人巨噬細胞的脂質蓄積并降低膽固醇流出的研究較少。因此，本研究探討miR-34a對THP-1細胞SIRT1的靶向作用，為動脈粥樣硬化的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料THP-1人巨噬細胞（中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞中心）；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自（浙江天杭生物科技有限公司）。Lipofectamine 3000轉染試劑盒、miRNA陰性對照（miRNA negative control，miR-NC）（5'-GAACCUCCGAGGUUU UCACAC-3'）、miR-34a inhibitor（5'-CCUUG CUUCCCUCCGGGUGUU-3'）和miR-34a mimic（5'-GGACAGGUCGUGGGCUGAGG-3'）（上海吉瑪制藥技術有限公司）；RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen公司）；mRNA反轉錄試劑盒和實時熒光PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；PCR引物序列由大連TaKaRa公司設計并合成：miR-34a上游引物為5'-CUGAUUGUAUG GACCAACUGUA-3'，下游引物為：5'-UCAAUU AAGCUUCGUUAGUGAC-3'；SIRT1上游引物為5'-ACGAGGCCCAGCAGCATCCATC-3'，下游引物為：5'-GGTAATTGTCAGTCGTGGAG-3'；U6上游引物為5'-CCCACTTCGGTCGAGCA-3'，下游引物為：5-ACGCTTCAAATTGCGTCGTA-3'；佛波酯、紅油O、膽固醇和載脂蛋白A-I（美國Sigma公司）；RIPA裂解液（上海生工生物工程有限公司）；SIRT1、LXR、β-actin和HRP標記山羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗儀器CO2培養(yǎng)箱（美國Ther-mo Revco公司）；Real-time PCR 擴增儀（美國ABI公司）；顯微鏡（德國Leica公司）；高效液相色譜儀（德國奧普斯儀器有限公司）；BIO-RAD垂直電泳儀和BIO-RAD ChemiDocTM成像系統(tǒng)（美國BIORAD公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 THP-1細胞培養(yǎng)和處理THP-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，當細胞融合到80%左右時進行實驗。將THP-1細胞分為陰性對照組、miR-NC組、miR-34a inhibitor組和miR-34a mimic組。對照組細胞不進行處理，miR-NC組按Lipofectamine 3000說明書方法將miR-NC轉染到THP-1細胞，miR-34a inhibitor組按Lipofectamine 3000說明書方法將miR-34a inhibitor轉染到THP-1細胞，miR-34a mimic組按Lipofectamine 3000說明書方法將miR-34a mimic轉染到THP-1細胞，同時用佛波酯（160 nmol/L）孵育細胞24 h，誘導其分化成巨噬細胞。

1.3.2 RT-PCR檢測THP-1巨噬細胞中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達按1.2.1處理細胞后用RNA提取試劑盒進行總RNA的提取，根據(jù)mRNA反轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說明，用RT-PCR試劑盒（體系共20 μl：其中2×Taq PCR MasterMix 10 μl，cDNA 1 μl、每個引物0.5 μl，SYBR-Green 0.3 μl，ddH2O7.7 μl）在反應條件為95 ℃ 5 min、94 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s、40個循環(huán)，評估m(xù)iR-34a和SIRT1的表達水平，以U6作為內參基因。

1.3.3 紅油O染色按1.2.1處理細胞后將蓋玻片置于6孔板中，24 h后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，經(jīng)50%的異丙醇固定1 min后用紅油O染色10 min，再用雙蒸水洗滌3次，蘇木素染色5 min，雙蒸水洗滌3次，用1%鹽酸酒精分化、在自來水中返藍，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 高效液相色譜檢測THP-1巨噬細胞內膽固醇水平按1.2.1處理細胞，24 h后加入200 μl RIPA裂解液，冰上裂解（30 min），用三氯乙酸沉淀蛋白，離心取上清，以豆甾醇為內標，用高效液相色譜儀進行總膽固醇（TC）測定。取100 μl上清液加入200 μl氫氧化鉀溶液進行水解，進行膽固醇脂（CE）和游離膽固醇（FC）檢測。

1.3.5 膽固醇流出檢驗按1.3.1處理細胞后同時加入0.2 μCi/L[3H]-膽固醇，24 h后用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞，加入血清白蛋白，再加入10 mg/L載脂蛋白A-I孵育12 h，用閃爍計數(shù)法分別檢測培養(yǎng)液和細胞的[3H]-膽固醇，計算膽固醇流出率[膽固醇流出率=培養(yǎng)液每分鐘記數(shù)/（培養(yǎng)液CPM+細胞CPM）×100%]。

1.3.6 Western Blot法檢測THP-1巨噬細胞中SIRT1和LXR蛋白按1.3.1處理細胞，24 h后加入200 μl RIPA裂解液，冰上裂解（30 min）離心取上清，進行電泳（20 μg/孔），蛋白質經(jīng)8%SDSPAGE分離后轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脫脂牛奶封閉，將膜與SIRT1和LXR抗體進行孵育，過夜（4 ℃），洗膜后與相應的HRP標記山羊抗鼠二抗孵育30 min，使用增強化學發(fā)光試劑盒進行顯色，用BIO-RAD ChemiDocTM成像系統(tǒng)進行光密度定量，選擇β-actin作為內對照。

1.4 統(tǒng)計學分析運用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達的影響與陰性對照組和miR-NC組比較，miR-34a inhibitor組miR-34a表達降低，SIRT1 mRNA表達增加（Q=5.116、4.840、8.451、8.113，P＜0.05），而miR-34a mimic組miR-34a表達升高，SIRT1 mRNA表達降低（Q=10.233、10.509、3.549、3.887，P＜0.05）；與miR-34a inhibitor組比較，miR-34a mimic組miR-34a表達升高，SIRT1 mRNA表達降低（Q=15.349、12.001，P＜0.05），表1。

表1 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達的影響

2.2 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞脂質蓄積的影響通過轉染miR-34a inhibitor降低miR-34a后，THP-1巨噬細胞中紅色脂滴明顯減少，通過轉染miR-34a mimic增加miR-34a后，THP-1巨噬細胞中可見大量的紅色脂滴（圖1）。

圖1 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞脂質蓄積的影響（A：陰性對照組；B：miR-NC組；C：miR-34a inhibitor組；D：miR-34a mimic組）

2.3 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞膽固醇含量的影響與陰性對照組和miR-NC組比較，miR-34a inhibitor組TC、CE和FC含量降低（Q=6.524、6.671、 5.047、5.257、8.070、7.414，P＜0.05），而miR-34a mimic組TC、CE和FC含量增加（Q=16.340、16.194、13.529、13.319、16.759、17.415，P＜0.05）；與miR-34a inhibitor組比較，miR-34a mimic組TC、CE和FC含量增加（Q=22.865、18.576、24.830，P＜0.05），表2。

表2 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞膽固醇含量的影響

2.4 轉染miR-34a對載脂蛋白A-I介導的膽固醇流出的影響與陰性對照組和miR-NC組比較，miR-34a inhibitor組膽固醇流出率增加（Q=14.258、14.005，P＜0.05），而miR-34a mimic組膽固醇流出率降低（Q=5.306、5.509，P＜0.05）；與miR-34a inhibitor組比較，miR-34a mimic組膽固醇流出率降低（Q=19.565，P＜0.05），表3。

表3 轉染miR-34a對載脂蛋白A-I介導的膽固醇流出的影響

2.5 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞中SIRT1和LXR蛋白的影響與陰性對照組和miR-NC組比較，miR-34a inhibitor組SIRT1和LXR蛋白含量增加（Q=10.818、9.803、7.867、7.586，P＜0.05），而miR-34a mimic組SIRT1和LXR蛋白含量降低（Q=5.070、6.085、3.652、3.933，P＜0.05）；與miR-34a inhibitor組比較，miR-34a mimic組SIRT1和LXR蛋白含量降低（Q=15.889、11.520，P＜0.05），（表4，圖2）。

圖2 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞中SIRT1和LXR蛋白的影響

表4 轉染miR-34a對THP-1巨噬細胞中SIRT1和LXR蛋白的影響

3 討論

miR通過對mRNA的3' -非翻譯區(qū)（3'- Untranslated area，3'- UTR）不完全堿基配對來誘導其靶mRNA的抑制。一種miR通常調節(jié)多個靶基因，這些基因參與了特定的信號級聯(lián)或細胞機制。因此，miR成為了有效的生物調節(jié)劑。越來越多的研究表明，脂質代謝的錯誤調節(jié)促進了代謝性疾病。除了經(jīng)典的轉錄調控因子LXR，一些miR已經(jīng)被證明可以轉錄后調控脂質穩(wěn)態(tài)關鍵基因的表達，如miR-33和miR-27[8]。在小鼠模型中，miR在非酒精性脂肪肝中過表達，并在運動干預后降低，提示其在肝臟脂質代謝中的作用[9]。最近的研究表明，miR-34a被認為是一種腫瘤促進因子，在人類癌癥中負向調控癌基因，并且動脈粥樣硬化患者血清miR-34a水平顯著升高[10]。同時，miR-34a在喂食高脂飲食的apoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化病變和巨噬細胞中上調，表明其參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生[11]。然而，其在膽固醇代謝中的重要作用尚不明確?？紤]到巨噬細胞在動脈粥樣硬化進展中的重要性，本研究探討miR-34a在巨噬細胞泡沫細胞形成調控中的作用。結果顯示，轉染miR-34a mimic后，過表達的miR-34a加速了THP-1巨噬細胞的脂質蓄積。同時，轉染miR-34a inhibitor后導致miR-34a表達降低，顯著阻斷了佛波酯誘導的巨噬細胞脂質蓄積。與脂質積累的促進一致，miR-34a過表達顯著抑制巨噬細胞膽固醇流出。這些結果支持了miR-34a促進巨噬細胞泡沫細胞形成和動脈粥樣硬化的假設。

SIRT1被認為是一種有效的膽固醇傳感器，在膽固醇代謝中發(fā)揮基礎性作用。在動物模型中，SIRT1的低水平會導致脂質負載巨噬細胞的顯著積累[12]。同時，一些miR如miR-29c已經(jīng)被報道通過靶向SIRT1抑制巨噬細胞膽固醇外流[13]。與上述研究結果一致，Western Blot結果顯示，miR-34a顯著抑制THP-1巨噬細胞中SIRT1的表達，這為miR-34a抑制膽固醇外流提供了額外的證據(jù)。機制上，miR-34a過表達導致THP-1巨噬細胞中SIRT1表達顯著下降。miR-34a靶向SIRT1在前列腺癌細胞中也有報道[14]。由于SIRT1具有誘導LXR活性促進腺苷三磷酸結合盒轉運體A1抗體（ABCA1）表達的能力，我們假設靶向SIRT1可能參與了miR-34a介導的LXR下調[15]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是一種主要的代謝能量傳感器和代謝穩(wěn)態(tài)的主要調節(jié)器。AMPK除了調節(jié)巨噬細胞泡沫細胞的形成外，還對動脈粥樣硬化有保護作用[16]。5-氨基咪唑4-氨甲酰核糖核苷（AICAR） 是一種激動劑，可激活AMPK，增加ATP結合盒轉運體LXR，促進巨噬細胞來源的泡沫細胞膽固醇外流，并減少ApoE-/-敲除小鼠斑塊的形成[17]。同時，AMPK增強NAD+依賴的III型去乙酰化酶SIRT1活性，導致下游SIRT1靶點活性的調控，而SIRT1是LXR的正調控因子，上調其活性，對膽固醇穩(wěn)態(tài)非常重要[18]。SIRT1-/-細胞表現(xiàn)出膽固醇外排缺陷和LXR基因表達減少[19]。SIRT1也上調LXR及其靶基因的表達以預防動脈粥樣硬化[20]。本研究結果顯示，過表達miR-34a抑制了THP-1巨噬細胞中SIRT1和LXR表達，抑制細胞膽固醇外流。這些結果支撐了強SIRT1是miR-34a調控巨噬細胞泡沫細胞形成的直接靶點。

綜上所述，通過轉染促進miR-34a表達后，可以阻斷膽固醇流出促進巨噬細胞的脂質沉積。其機制可能是miR-34a靶向抑制SIRT1表達，促進巨噬細胞泡沫細胞的形成。上述結果表明，miR-34a是預防動脈粥樣硬化的一個潛在治療靶點，為進一步研究miR-34a在動物模型中預防動脈粥樣硬化的意義提供了依據(jù)。