微小RNA-762表達(dá)與大鼠受損心臟中線粒體功能和心臟功能的關(guān)系研究

張志良，張玉鑫，張永杰，常超

心臟可為機(jī)體血液流動提供動力，向組織器官提供充足的血流量，維持細(xì)胞正常的代謝和功能，實現(xiàn)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對恒定[1]。心臟受損后，心肌細(xì)胞大量凋亡，可造成心臟功能及其線粒體功能減弱甚至喪失，最終引發(fā)心臟疾病及線粒體相關(guān)疾病[2]。微小RNA-762（miRNA-762）是一種可在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控細(xì)胞增殖及分化的單鏈非編碼小RNA分子，與心肌缺血再灌注損傷有關(guān)[3,4]，但miRNA-762與心肌損傷后心臟功能及其線粒體功能的關(guān)系尚不明確。為此，本研究分析了miRNA-762對心臟受損大鼠心臟線粒體功能和心臟功能的影響，以期明確miRNA-762表達(dá)與大鼠受損心臟中線粒體功能和心臟功能的關(guān)系，為心臟疾病及線粒體相關(guān)疾病的治療提供新的方向，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級的雄性的SD大鼠30只，體質(zhì)量（180±20）g，購于康美華大基因技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可SYXK（粵）2019-0205。

1.2 分組、模型制備及干預(yù)處理將30只大鼠隨機(jī)分為A組、B組、C組三組，每組各10只。模型制備方法：B組和C組給予戊巴比妥鈉溶液（美國Sigma公司，40 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠后固定于手術(shù)臺，剪短胸部被毛，碘伏（衛(wèi)輝市康寶生化科技有限公司）消毒剪毛區(qū)，在大鼠胸部的正中做一切口（1.5～2 cm），開胸之后將冠狀動脈左前降支結(jié)扎，0.5 h后剪斷結(jié)扎線，恢復(fù)大鼠的血流灌注，造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠結(jié)扎后的心電圖ST段抬高。A組將前室間支分離但不結(jié)扎。造模成功后，C組給予50 μl miRNA-762 antagomir（廣州市銳博生物科技有限公司，尾靜脈注射），B組和A組給予等量生理鹽水（南京樂診生物技術(shù)有限公司，尾靜脈注射）。造模失敗大鼠及死亡大鼠剔除，并隨機(jī)補(bǔ)足。各組于造模成功后的第14 d檢測以下項目。

1.3 評價項目①各組大鼠心臟功能：采用GDF-V90動物多普勒超聲診斷儀（鄭州甘道夫電子科技有限公司）檢測左室收縮末期內(nèi)徑（LVEDs） 、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）。②各組大鼠線粒體功能：將各組大鼠處死，取其心臟缺血區(qū)心肌組織，應(yīng)用線粒體分離試劑盒（上海和序生物科技有限公司）分離線粒體。A：檢測線粒體過氧化物生成量：向線粒體懸液內(nèi)加入5 μmol/L MitoSOX（廈門研科生物技術(shù)有限公司），30 min后，用100 μl HEPES緩沖液（南京森貝伽生物科技有限公司）重懸，檢測其熒光值。B：檢測線粒體膜電位：向線粒體懸液內(nèi)加入2 μmol/L JC-1（上海恒斐生物科技有限公司），孵育15 min后檢測其熒光值，以綠色熒光值與紅色熒光值之比評價線粒體損傷程度。C：檢測線粒體三磷酸腺苷（ATP）生成量：向線粒體懸液內(nèi)加入蛋白提取液（上海信裕生物科技有限公司），采用Mini-P25離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司），10000 rpm離心10 min，取上清，使用ATP生物發(fā)光試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）檢測ATP濃度。③各組心肌梗死面積：將各組大鼠處死，收集左心室稱重，然后將其切成1～1.5 mm心肌薄片，放入2%四氮唑紅磷酸鹽緩沖液（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）中，37℃避光孵育10 min，于10%甲醛溶液（上海欽誠生物科技有限公司）中固定，吸干并稱重，觀察顏色，紅色為非梗死心肌區(qū)，白色為梗死心肌區(qū)，切下梗死心肌區(qū)并稱重，然后計算心肌梗死面積，心肌梗死面積=心肌梗死重量/左心室重量×100%。④各組心肌細(xì)胞凋亡率：取各組大鼠心肌組織，消化并傳代后收集第3代細(xì)胞，將其制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/ml，使用1 M×Tris Buffer緩沖液（上海卉深生物科技有限公司）重懸細(xì)胞，將5 μl Annexin V-FITC（美國BioVision公司）、100 μl細(xì)胞懸液、5 μl PI染液（美國BioVision公司）加至流式管中，室溫避光反應(yīng)15 min，在CytoFLEX S流式細(xì)胞儀（上海實維實驗儀器技術(shù)有限公司）上檢測心肌細(xì)胞凋亡率。⑤各組心肌組織中miRNA-762表達(dá)量：取各組大鼠心肌組織，液氮研磨，采用總RNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取總RNA，然后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：β-actin：下游GATGG TGGTCCAGGGGTCTTACT；上游5’-TCAACGACCA CTTTGTCAAGCTCA-3’；miRNA-762：下游 5’ -AGACAGCCAGGAGAA ATCAAACAG-3’；上游5’-TGCACCTGACGCCCT TCAC-3’。PCR擴(kuò)增體系為：反應(yīng)體系共25 μl，cDNA模板5 μl，10 μmol/L上游引物各0.5 μl， 10 μmol/L下游引物0.5 μl，10×Taq DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液2.5 μl，dNTP 1 μl，ddH2O 15 μl。反應(yīng)條件為：95℃條件下預(yù)變性3 min，95℃條件下變性20 s，72℃條件下退火延伸30 s，總共38次循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描獲取電泳照片，然后測定各擴(kuò)增條帶吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析中兩兩計量資料相比采用snk-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率比較C組和B組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡率比A組增高（P＜0.05）；C組大鼠心肌梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡率比B組降低（P＜0.05），表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.2 各組大鼠線粒體功能比較C組和B組大鼠心臟線粒體過氧化物生成量比A組增高（P＜0.05）；C組大鼠心臟線粒體過氧化物生成量比B組降低（P＜0.05）；C組和B組大鼠心臟線粒體ATP生成量、線粒體膜電位比A組降低（P＜0.05）；C組大鼠心臟線粒體ATP生成量、線粒體膜電位比B組增高（P＜0.05），表2。

表2 各組大鼠線粒體功能比較

2.3 各組大鼠心臟功能比較C組和B組大鼠LVEDd、LVEDs比A組增高（P＜0.05）；C組大鼠LVEDd、LVEDs比B組降低（P＜0.05）；C組和B組大鼠LVEF、LVFS比A組降低（P＜0.05）；C組大鼠心臟線粒體LVEF、LVFS比B組增高（P＜0.05），表3。

表3 各組大鼠心臟功能比較

2.4 各組大鼠心肌組織中miRNA-762表達(dá)量比較C組和B組大鼠心肌組織中miRNA-762表達(dá)量比A組增高（P＜0.05）；C組大鼠心肌組織中miRNA-762表達(dá)量比B組降低（P＜0.05），表4。

表4 各組大鼠心肌組織中miRNA-762表達(dá)量比較

3 討論

心臟受損可造成心臟功能及其線粒體功能障礙，導(dǎo)致心肌組織壞死[5]。線粒體是真核生物體內(nèi)為能量代謝提供場所的細(xì)胞器，在細(xì)胞正常生命活動中扮演重要的角色。因此，研究心臟功能及其線粒體能量代謝異常的分子機(jī)制，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

miRNA-762是近年新發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員，目前主要發(fā)現(xiàn)其能參與胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為[6]。有多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA-762與心肌細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)[7,8]，但目前相關(guān)研究主要集中在細(xì)胞實驗，其在生物體內(nèi)作用尚不明確。本研究通過構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷（IR）模型大鼠，發(fā)現(xiàn)B組（模型組）miRNA-762表達(dá)量比A組（假手術(shù)組）增高，提示miRNA-762在心臟受損大鼠中呈高表達(dá)，其可能在心肌損傷過程起到促進(jìn)作用，與相關(guān)研究一致。而B組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、LVEDd、LVEDs偏高，LVEF、LVFS偏低也證實了這一點。主要目前關(guān)于miRNA-762對心肌細(xì)胞損傷機(jī)制研究較多，有研究認(rèn)為miRNA-762可能通過激活PI3K/Akt通路途徑促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[9]；還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA-762可通過調(diào)控線粒體通路介導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[10]。線粒體功能異常目前已經(jīng)證實與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其內(nèi)在機(jī)制可能與呼吸鏈酶變化、NO釋放、Ca超載、促凋亡蛋白表達(dá)異常等多種因素有關(guān)[11]。IR的始動環(huán)節(jié)為能量代謝障礙，電子顯微鏡下線粒體嵴斷裂、溶解和基底膜的部分缺失，其發(fā)病機(jī)制如自由基損傷、Ca2+超載、炎癥細(xì)胞的大量增多均與線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān)[12]。本研究顯示，B組大鼠心臟線粒體過氧化物生成量顯著高于A組，心臟線粒體ATP生成量、線粒體膜電位顯著低于A組，提示心臟受損大鼠存在明顯的心臟線粒體功能障礙。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)給予冠心病大鼠心肌細(xì)胞線粒體ATP敏感性K+通道開放劑二氮嗪后，給藥組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率較模型組大鼠降低，同時炎癥因子及氧化應(yīng)激水平也下降，提示改善心肌細(xì)胞線粒體功能能降低對心肌細(xì)胞損傷[13]。目前多項研究發(fā)現(xiàn)miRNAs能通過影響線粒體形態(tài)和功能、參與線粒體自噬過程對IR起作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-762能通過介導(dǎo)解耦連蛋白2（UCP2）和影響線粒體穩(wěn)態(tài)，從而降低心臟保護(hù)作用[15]。本研究采用miRNA-762拮抗劑干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)C組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡率、心臟線粒體過氧化物生成量、LVEDd、LVEDs顯著低于B組，C組大鼠心臟線粒體ATP生成量、線粒體膜電位、LVEF、LVFS顯著高于B組，提示抑制miRNA-762表達(dá)有利于心臟受損大鼠心臟功能和心臟線粒體功能恢復(fù)，可能是治療心臟疾病及線粒體相關(guān)疾病的新靶點。

綜上所述，抑制微小RNA-762表達(dá)能夠促進(jìn)大鼠受損心臟中線粒體功能和心臟功能恢復(fù)，這一結(jié)論可為心臟疾病及線粒體相關(guān)疾病的治療提供新的策略。但其具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。