慢性心力衰竭合并腎功能不全患者心功能與TLR4/NF-κB信號通路表達分析

吳華芹，宋慶橋，李雨濛，徐霞，王亞嬌，張并璇

心力衰竭（心衰）是大多數(shù)心血管疾病患者的最終歸宿，其具有極高的發(fā)病率和死亡率，目前仍是臨床研究的重點和難點。心臟與許多臟器關(guān)系密切，尤其依賴由腎臟調(diào)節(jié)的體內(nèi)水鈉平衡，而腎臟亦依賴心臟的泵血，因此兩臟器關(guān)系極為特殊，很早就引起了學(xué)者們的關(guān)注。調(diào)查顯示，2012年我國慢性腎臟?。–KD）患病率為10.8%[1]，而慢性心力衰竭（CHF）患者中約25%～40%伴有慢性腎功能不全（CRI），23%的患者罹患進行性腎功能損傷，使CHF病死率顯著增加，且CHF的死亡率與腎損傷嚴重程度呈顯著正相關(guān)[2]。CHF合并腎功能不全患者患病率和死亡率居高不下、治療棘手、醫(yī)療支出較大、是當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的難題之一。因此積極開展疾病的病生理機制研究，對于防治疾病的進展具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組納入2017年1月至2018年1月于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科住院的CHF患者共147例，其中男性74例，女性73例，年齡36～94（74.5±12.5）歲。CHF診斷標準：采用Framingham心力衰竭診斷標準[3]并參照2013年美國心臟病學(xué)會（ACC）及美國心臟協(xié)會（AHA）發(fā)布的《成人慢性心力衰竭治療指南》[4]制定如下標準：①心臟功能或結(jié)構(gòu)改變：左室射血分數(shù)（LVEF）＜45%，或血清N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）＞900 pg/ml；②具備心衰的癥狀、體征：呼吸困難、乏力、水腫等；③美國紐約心臟病學(xué)會（NYHA）心功能分級Ⅱ～Ⅳ級。CHF合并CRI診斷標準：①符合CHF的診斷標準；②估算的腎小球濾過率（eGFR）＜60 ml/（min·1.73 m2）；③慢性腎功能不全。心功能分級標準：參考1994年NYHA心功能分級診斷標準[5]。納入標準：①符合CHF的診斷標準，原發(fā)病為冠心?。虎谀挲g在30～90歲之間；③心功能Ⅱ～Ⅳ級；④CHF&CRI組在以上基礎(chǔ)上符合CRI的診斷標準；⑤已簽署知情同意書。排除標準：①因瓣膜性心臟病、先天性心臟病、心肌炎、心肌病等導(dǎo)致CHF者；②既往患有基礎(chǔ)腎臟病或急性腎功能衰竭所致的腎功能不全者；③患有嚴重肝功能損傷、嚴重內(nèi)分泌疾病者。根據(jù)eGFR分為CHF組[eGFR≥60 ml/（min·1.73 m2）]65例，CHF+CRI組[eGFR＜60 ml/（min·1.73 m2）]82例，并收集健康人群20例的一般資料。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集收集患者基本信息：人口學(xué)資料：姓名、性別、年齡、住院日期等；臨床資料：CHF病程，伴隨疾病包括高血壓、2型糖尿病、房顫，合并用藥，心功能評價數(shù)據(jù)包括入院后首次NYHA分級、心臟超聲、實驗室檢查（NTproBNP、血常規(guī)、肝功能、腎功能、血脂）。

1.2.2 估算的腎小球濾過率的計算采用基于血肌酐（Scr）的CKD-EPI公式[6]計算eGFR，計算公式為eGFR=a×[血肌酐濃度（mg/dl）/b]c×（0.993）年齡。a值根據(jù)性別與人種分別采用如下數(shù)值：①黑人：女性=166，男性=163；②其他人種：女性=144，男性=141。b值根據(jù)性別不同分別采用如下數(shù)值：女性=0.7，男性=0.9。c值根據(jù)年齡與血肌酐值的大小分別采用如下數(shù)值：①女性：血肌酐≤0.7 mg/dl=-0.329，血肌酐＞0.7 mg/dl=-1.209；②男性：血肌酐≤0.7 mg/dl= -0.411，血肌酐＞0.7 mg/dl=-1.209。

1.2.3 TLR4/NF-κB信號通路表達檢測采用ELISA法檢測患者外周血漿中C反應(yīng)蛋白（CRP）、白介素-1β（IL-1β）、白素素-18（IL-18）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子-κB p65（NF-κB p65）、Toll樣受體4（TLR4）的分子表達含量。采用qPCR法檢測患者外周血單個核細胞（PBMC）中NF-κB p65 mRNA、TLR4 mRNA表達水平，具體如下：采外周靜脈血5 mL，吸取單個核細胞，置入15 ml離心管內(nèi)，洗滌，確保核蛋白復(fù)合物徹底分離。采用Trizol法提取PBMC中的總RNA。嚴格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將PBMC中RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以獲得的cDNA為模板，參考SYBR FAST實時熒光定量PCR試劑盒說明，使用ABI7500系統(tǒng)檢測PBMC中NF-κB p65和TLR4的mRNA表達水平。目的基因使用的引物序列及擴增產(chǎn)物大小（表1）。

表1 相關(guān)基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；偏態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較兩組患者在年齡、性別、Scr、eGFR、血脂、血紅蛋白、高血壓病史方面相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），在性別、CHF病程、尿素（Urea）、肝功能、是否合并糖尿病、是否合并房顫方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者心功能比較與CHF組相比，CHF+CRI組患者心功能Ⅲ、Ⅳ級比例顯著升高，分別為54.9%和24.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，CHF+CRI組LVEF顯著下降，NT-proBNP顯著升高，與CHF組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。但兩組患者在心臟結(jié)構(gòu)改變?nèi)缱笫沂鎻埬﹥?nèi)徑（LVEDD）、右室前后徑（RV）、左房前后徑（LA）、右房前后徑（RA）及左室短軸縮短率（FS）方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），表3。

表3 兩組患者心功能情況比較

2.3 各組TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)炎性因子表達水平比較與健康組相比，CHF組和CHF&CRI組患者外周血中TLR4、NF-κBp65、CRP、IL-1β、IL-18、TNF-α含量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CHF組比較，CHF&CRI組患者外周血中TLR4、NFκBp65、CRP、L-1β、IL-18、TNF-α含量升高更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表4。

表4 各組外周血TLR4/NF-κB通路相關(guān)炎癥因子表達水平

2.4 各組PBMC中NF-κB p65 mRNA、TLR4 mRNA表達水平比較與健康組比較，CHF和CHF&CRI組患者PMBC中NF-κB p65 mRNA和TLR4 mRNA表達含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），與CHF組比較，CHF&CRI組患者PMBC中NF-κB p65 mRNA、TLR4 mRNA表達含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表5。

表5 各組PBMC中NF-κBp65mRNA、TLR4mRNA表達水平比較

3 討論

現(xiàn)階段合并腎功能不全患者在心力衰竭住院人群中占比逐年升高，已成為導(dǎo)致CHF患者病情惡化和死亡的重要原因之一。目前認為CHF腎損傷的發(fā)生與機體血流動力學(xué)異常、靜脈系統(tǒng)淤血和貧血、神經(jīng)內(nèi)分泌的異常激活、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[7]，這些機制相互串聯(lián)、影響，形成惡性循環(huán)，加重心腎損害。

本研究發(fā)現(xiàn)，CHF合并CRI患者血脂水平更高，血紅蛋白水平更低。脂代謝異?？梢饎用}粥樣硬化，從而使腎臟成為繼心、腦之后又一個靶器官。多項研究顯示，血脂異常人群出現(xiàn)eGFR下降及腎功能損害的風(fēng)險更高[8,9]，本研究雖發(fā)現(xiàn)CHF合并CRI患者TC、LDL-C較CHF患者升高，但總體而言，仍處于正常范圍以內(nèi)，且較一般人群偏低。CHF患者因消化道淤血或出血、稀釋性貧血、營養(yǎng)狀態(tài)差、炎癥反應(yīng)等極易出現(xiàn)貧血，且合并CRI時因腎功能不全導(dǎo)致促紅細胞生成素分泌不足，同時腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活引起水鈉潴留，使血液稀釋，加重貧血。

本研究結(jié)果進一步顯示，合并腎功能不全患者較單純心衰患者心功能惡化明顯，NYHA心功能分級明顯加重，LVEF顯著下降，NT-proBNP顯著升高。心衰嚴重時，低心排血狀態(tài)引起腎組織灌注減少，導(dǎo)致缺血性腎損傷，進而RAAS和交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活，促進心腎重構(gòu)，加重心腎功能惡化[10,11]。此外，左室舒張末壓增高使靜脈系統(tǒng)淤血，腎靜脈充血，壓迫腎血管和腎小管亦造成腎功能減退[12]。雖然NT-proBNP需經(jīng)腎小球濾過清除，其水平與eGFR呈顯著負相關(guān)，對結(jié)果解讀造成了一定影響，但除NT-proBNP外，本研究中NYHA心功能分級及LVEF的顯著差異足以說明CHF合并CRI患者心功能更差。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CHF&CRI患者外周血炎癥因子TLR4、NF-κBp65、CRP、IL-1β、IL-18、TNF-α含量較CHF組明顯增高，qPCR結(jié)果進一步證實，CHF&CRI組患者PBMC中NF-κBp65 mRNA、TLR4 mRNA表達水平較CHF組明顯升高，可見上述炎因子是介導(dǎo)CHF時腎損傷的主要炎癥因子，與CHF時發(fā)生腎損傷密切相關(guān)。CHF患者體內(nèi)處于微炎癥狀態(tài)，促使腎小球及腎間質(zhì)募集大量白細胞及纖維生成細胞，與激活的腎組織內(nèi)固有免疫細胞共同作用，生成大量炎性因子，造成腎小球濾過屏障及重吸收功能受損，促進腎功能惡化[13]。TLR4/NF-κB信號通路被認為是介導(dǎo)上述炎性反應(yīng)的關(guān)鍵通路[14]。CHF時由于血流動力學(xué)改變、神經(jīng)內(nèi)分泌異常激活、腎缺血-再灌注損傷，使TLR4高表達，下游效應(yīng)細胞因子NF-κB過度激活，促炎因子釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和細胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致心腎損害。臨床研究證實IL-18、TNF-α、CRP等可作為CHF患者腎損害發(fā)生、病情評估、預(yù)后判斷的重要標志物[15]。

綜上推論，合并CRI的CHF患者心功能顯著下降，炎癥反應(yīng)是疾病嚴重程度及進展的重要促進因素，TLR4/NF-κB通路可能是介導(dǎo)上述炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路。