還原態(tài)硫介導(dǎo)沉積物-水系統(tǒng)硝酸鹽還原過程研究

陳宇華，魯 汭，榮 鵬，王 培，吳振斌，肖恩榮①

〔1.中國科學(xué)院水生生物研究所/ 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室，湖北 武漢 430072；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074〕

沉積物-水系統(tǒng)中氮循環(huán)主要包括固氮作用、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和硝酸鹽異化還原成銨(dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA)等[1]。其中，反硝化和DNRA是沉積物-水系統(tǒng)中硝酸鹽還原的兩條主要途徑，影響著硝酸鹽的最終去向[2]。反硝化作用將硝酸鹽還原為氮氣從系統(tǒng)中排出[3]；DNRA將硝酸鹽還原為可被生物利用的氨氮[4]，有利于被水生植物吸收同化，但是在缺乏水生植物的水體中，則會提高上覆水氨氮濃度，可能加劇水質(zhì)惡化[5]。

沉積物中存在的硫元素能與反硝化、DNRA過程耦合，影響硝酸鹽還原[6]。在厭氧或缺氧環(huán)境中，某些無機化能營養(yǎng)型、光能營養(yǎng)型硫氧化細菌利用還原態(tài)硫(S2-、S0、S2O32-等)作為電子供體，以硝酸鹽為電子受體，將其還原為氮氣[7]，這個過程被稱為硫自養(yǎng)反硝化。但是，已有研究表明硫化物對大多數(shù)微生物有很高的毒性[8]。BRUNET等[9]研究發(fā)現(xiàn)1 mmol·L-1硫化氫能夠抑制微生物NO還原酶和N2O還原酶活性，從而抑制反硝化。反硝化被抑制后積累的硝酸鹽和亞硝酸鹽被DNRA細菌利用，有利于DNRA發(fā)生[10]。然而，許多研究發(fā)現(xiàn)，在還原態(tài)硫作用下，具有硫自養(yǎng)反硝化功能的微生物，如Thiobacillus往往能成為絕對的優(yōu)勢菌屬[11]，其豐度的增加將提高系統(tǒng)的反硝化能力。因此，還原態(tài)硫在沉積物-水系統(tǒng)中是促進還是抑制反硝化作用和DNRA的發(fā)生，以及還原態(tài)硫濃度在哪個水平能夠促進或抑制反硝化和DNRA的發(fā)生有待進一步探究。

該研究擬通過向構(gòu)建的沉積物-水微宇宙中添加還原態(tài)硫，解析其對沉積物中硝酸鹽還原過程的影響，揭示還原態(tài)硫驅(qū)動下的反硝化作用和DNRA過程的機制，為湖泊內(nèi)源氮污染控制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與裝置

供試沉積物采自武漢市某湖泊，去除其中的石塊、水生植物殘體后混合均勻，初始沉積物成分：質(zhì)量含水率為40.53%，w(總氮)為1.87 mg·g-1，w(有機氮)為1.78 mg·g-1，w(氨氮)為0.07 mg·g-1，w(硝態(tài)氮)為0.02 mg·g-1，間隙水ρ(SO42-)為1.85 mg·L-1。

試驗裝置為圓柱形2 000 mL燒杯(直徑約為13 cm)，在燒杯中先填入1 000 mL沉積物，再加入800 mL自來水，構(gòu)建沉積物-水微宇宙系統(tǒng)(圖1)。分別在沉積物中距燒杯底面6.5和1.5 cm位置設(shè)置間隙水取樣器(型號為Rhizon FLEX 19.60.26F，上海賽弗生物科技有限公司)用于采集上層間隙水和下層間隙水。用黑色塑料膜包裹燒杯外壁，遮住沉積物，防止光照對沉積物產(chǎn)生影響。

圖1 裝置示意

1.2 試驗設(shè)計

分別設(shè)置0、50和75 mg·L-13個還原態(tài)硫濃度梯度，依次標記為N、L和H組。每組設(shè)置2個平行，共計6個裝置。選用硫代硫酸鈉(Na2S2O3)作為還原態(tài)硫的成分[12-13]。每隔20 d向裝置中添加相應(yīng)濃度Na2S2O3溶液以維持還原態(tài)硫濃度梯度。試驗持續(xù)100 d，期間用自來水補充因蒸發(fā)或取樣而減少的上覆水體積。

1.3 測定指標與方法

1.3.1水質(zhì)指標

上覆水和間隙水TN濃度測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法(HJ 636—2012)，NH4+濃度測定采用納氏試劑分光光度法(HJ 535—2009)，NO3-濃度測定采用紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)，亞硝氮(NO2-)濃度測定采用N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法(GB 7493—87)，有機氮(ON)濃度通過TN濃度減去NH4+、NO3-、NO2-3者濃度之和得到，硫酸鹽(SO42-)濃度測定采用鉻酸鋇分光光度法(HJ/T 342—2007)。

1.3.2沉積物指標

采用底泥采樣器從每個裝置采集沉積物樣品。采集的沉積物經(jīng)過冷凍干燥機(型號SCIENTZ-10N，寧波新芝生物科技股份有限公司)干燥后研磨，并用150 μm孔徑篩網(wǎng)過濾得到待測的固態(tài)沉積物。沉積物TN濃度測定采用過硫酸鹽消化法。沉積物NH4+、NO3-和NO2-濃度測定采用氯化鉀溶液提取-分光光度法(HJ 634—2012)。ON濃度由TN濃度減去NH4+、NO3-、NO2-3者濃度之和得到。

1.3.3基于Miseq平臺的微生物群落分析

取試驗60 d時各裝置沉積物樣品保存于-80 ℃ 冰箱中，委托生工生物工程(上海)股份有限公司對微生物樣品進行DNA提取、PCR擴增、高通量測序分析等操作，具體操作參照XU等[14]的研究。其中，DNA提取采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒。PCR擴增所用引物為Nobar_341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；Nobar_805R：GACTACHVGGGTATCTAATC[15]。高通量測序采用Illumina公司的Miseq測序儀進行測序分析，測序完成后，通過barcode區(qū)分各樣本序列。微生物原始測序數(shù)據(jù)已上傳至National Center of Biotechnology Information(NCBI)的Sequence Read Archieve(SRA)數(shù)據(jù)庫(登錄號：PRJNA727978)。

微生物群落多樣性選取Chao指數(shù)(Schao1)和Shannon指數(shù)(Hshannon)進行分析，兩個指數(shù)的計算方法為

(1)

式(1)中，Schao1為估計的OUT數(shù)；Sobs為實際觀測到的OUT數(shù)；n1為只含有一條序列的OUT數(shù)；n2為只含有兩條序列的OUT數(shù)。

(2)

式(2)中，Sobs為實際觀測到的OUT數(shù)；Ni為第i個OUT包含的序列數(shù)；N為所有個體數(shù)目，此處為序列總數(shù)。

1.4 分析方法

每個試驗組設(shè)置兩個平行，試驗數(shù)據(jù)取平均值進行分析。間隙水?dāng)?shù)據(jù)采用上、下層間隙水平均值進行分析。采用SPSS 25軟件對處理組間差異顯著性做Wilcoxon符號檢驗以及Spearman相關(guān)性分析，以0.05作為差異顯著性和相關(guān)性的界限。采用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮的賦存形態(tài)和濃度變化

上覆水總氮濃度變化見圖2，N、L和H組上覆水ρ(總氮)從試驗初始的0 mg·L-1分別上升至3.65、2.65和3.05 mg·L-1，隨后表現(xiàn)為上升與下降交替進行。通過差異性分析發(fā)現(xiàn)，L和H組上覆水總氮濃度顯著低于N組(P<0.05)，說明上覆水總氮濃度的降低與還原態(tài)硫有關(guān)。3組裝置氨氮濃度變化趨勢相似，在0～60 d期間呈先上升后下降變化，60 d以后較為穩(wěn)定。N、L和H組上覆水ρ(氨氮)分別為1.06～3.04、0.84～2.10和0.53～2.01 mg·L-1(圖2)。試驗結(jié)果顯示，L和H組上覆水氨氮濃度均顯著低于N組(P<0.05)，說明還原態(tài)硫?qū)ι细菜钡獫舛鹊慕档陀蟹e極作用。圖2顯示，硝態(tài)氮濃度分別在0～40與40～90 d期間各出現(xiàn)1次先上升后下降變化，且第2次波動幅度比第1次大。N、L和H組上覆水ρ(硝態(tài)氮)分別為0.16～2.62、0.42～1.74和0.50～1.93 mg·L-1。ρ(亞硝態(tài)氮)均不超過1.11 mg·L-1。

間隙水總氮、氨氮和硝態(tài)氮濃度隨時間的變化見圖2。3組裝置間隙水總氮濃度變化相似，均呈現(xiàn)先上升后下降的變化過程。0～40 d期間ρ(總氮)從12.88 mg·L-1上升至19.10 mg·L-1以上，40 d以后逐漸下降至15.53 mg·L-1以下。間隙水總氮中占比較高的是氨氮，其占比在44.67%～81.13%之間，其主要來源于沉積物有機氮的礦化。N、L和H組間隙水ρ(氨氮)在0～60 d期間由10.45 mg·L-1逐漸下降至8.83 mg·L-1以下，隨后在70～100 d期間有所上升，并在9.63～10.88 mg·L-1之間波動。N、L和H組ρ(氨氮)分別為8.39～10.88、8.83～10.56和7.52～10.45 mg·L-1，且H組顯著低于N組(P<0.05)。3組裝置ρ(硝態(tài)氮)不高于0.86 mg·L-1，隨著時間推移呈現(xiàn)上升下降交替變化。亞硝態(tài)氮濃度均低于檢出限。

沉積物中有機氮(ON)占總氮(TN)比例最高(90%以上)，氨氮(以NH4+計)占比次之(3%～7%)，硝態(tài)氮(NO3-)占比在2%以下，亞硝態(tài)氮濃度低于檢出限。有機氮被微生物礦化為氨氮釋放到間隙水中[16]，故其濃度隨著試驗時間的增加而不斷下降(圖2)。N、L和H組w(有機氮)分別為1.68～1.90、1.49～1.78和1.52～1.78 mg·g-1，3組裝置有機氮濃度受還原態(tài)硫的影響顯著(P<0.05)，在整個試驗中均表現(xiàn)為L組

N、L和H指還原態(tài)硫投加量分別為0、50和75 mg·L-1。

分析上覆水、間隙水和沉積物各形態(tài)氮濃度變化可知，沉積物中有機氮經(jīng)過礦化作用轉(zhuǎn)化為氨氮，氨氮在沉積物、間隙水和上覆水之間形成明顯的濃度差，并沿縱向向上擴散到上覆水中。因此，0～60 d期間上覆水ρ(氨氮)從初始的0 mg·L-1上升至0.53 mg·L-1以上，而間隙水ρ(氨氮)從大于10 mg·L-1減少到不足9 mg·L-1，在XU等[17]的研究中也觀察到類似現(xiàn)象。在有氧環(huán)境中，上覆水氨氮被亞硝化細菌與硝化細菌氧化為硝態(tài)氮[18]。上覆水硝態(tài)氮濃度呈現(xiàn)先上升后下降的周期性變化，其濃度上升是因為硝化作用生成了硝態(tài)氮，而其濃度下降則是因為硝態(tài)氮在上覆水與間隙水之間存在明顯的濃度差，導(dǎo)致其從上覆水向間隙水?dāng)U散[19]。硝態(tài)氮的擴散使其在間隙水中的濃度上升，而間隙水中發(fā)生的硝酸鹽還原反應(yīng)導(dǎo)致間隙水硝態(tài)氮濃度下降[20]，從而使間隙水硝態(tài)氮濃度也出現(xiàn)上升與下降交替變化。進一步分析各組間硝態(tài)氮濃度差異，發(fā)現(xiàn)3組裝置上覆水與間隙水硝態(tài)氮濃度未顯示出顯著差異。然而，作為硝態(tài)氮來源的上覆水與間隙水氨氮卻受到還原態(tài)硫的顯著影響，L和H組上覆水氨氮濃度顯著低于N組(P<0.05)，H組間隙水氨氮濃度顯著低于L組(P<0.05)。

2.2 氧化態(tài)硫濃度變化

直至試驗結(jié)束時，累計投加到L組的還原態(tài)硫有250 mg，其中，有25.58%被轉(zhuǎn)化為SO42-存在于上覆水，有12.44%被轉(zhuǎn)化為SO42-存在于間隙水；累計投加到H組的還原態(tài)硫有375 mg，其中，有19.22%被轉(zhuǎn)化為SO42-存在于上覆水，有14.05%被轉(zhuǎn)化為SO42-存在于間隙水。

上覆水SO42-濃度波動幅度較大，L組在225.58～370.70 mg·L-1之間，H組在270.33～406.68 mg·L-1之間(圖3)。間隙水SO42-濃度隨著還原態(tài)硫的累計投加而增加，L組間隙水ρ(SO42-)在36.05～182.18 mg·L-1之間，H組間隙水ρ(SO42-)在124.25～313.88 mg·L-1之間，L和H組間隙水ρ(SO42-)均顯著高于對照組N組(1.85～26.65 mg·L-1)(P<0.05)。L和H組間隙水SO42-濃度與還原態(tài)硫累計投加量之間呈正相關(guān)關(guān)系(R2>0.89)(圖4)，說明L和H組間隙水中存在硫氧化作用，投加到裝置中的還原態(tài)硫被氧化為SO42-。

L和H指還原態(tài)硫投加量分別為50和75 mg·L-1。

L和H指還原態(tài)硫投加量分別為50和75 mg·L-1。

進一步分析間隙水SO42-濃度與上覆水硝態(tài)氮濃度的關(guān)系，可以看出兩者之間呈負相關(guān)關(guān)系(R2>0.84)(圖5)，即間隙水SO42-濃度的增加很可能是導(dǎo)致上覆水硝態(tài)氮濃度下降的直接原因。間隙水中發(fā)生的硫氧化作用將還原態(tài)硫氧化為SO42-，該過程可為硝酸鹽還原提供電子[21]，進而導(dǎo)致間隙水硝態(tài)氮濃度降低，進一步擴大間隙水與上覆水之間硝態(tài)氮濃度差，濃度差的擴大促使上覆水硝態(tài)氮向間隙水?dāng)U散，引起上覆水硝態(tài)氮濃度下降。

L和H指還原態(tài)硫投加量分別為50和75 mg·L-1。

在沉積物-水系統(tǒng)中反硝化與DNRA的差別主要體現(xiàn)在最終產(chǎn)物的差異上，反硝化作用將硝酸鹽最終還原為氮氣釋放，導(dǎo)致總氮下降；而DNRA作用將硝酸鹽最終還原為氨氮，不會引起總氮變化[5]，但是會導(dǎo)致間隙水氨氮上升。直至試驗結(jié)束時，L、H組總氮分別為1 230.04和1 260.11 mg，比N組減少11%和8%，說明還原態(tài)硫?qū)е驴偟獪p少，硫氧化作用促進了反硝化的發(fā)生。此結(jié)果與李生來[22]的研究結(jié)果相一致，其探究了5個濃度梯度硫化物對底泥反硝化過程的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)ρ(硫化物)增加到75 mg·L-1時，反硝化過程被明顯促進；而當(dāng)硫化物濃度繼續(xù)增加時則會抑制反硝化過程。此外，間隙水氨氮占總氮比例隨時間推移呈高低起伏變化(表1)，說明3組裝置均可能發(fā)生了DNRA；然而L和H組的變化趨勢與N組相近，說明L和H組DNRA本來就存在于沉積物環(huán)境中，并沒有受到還原態(tài)硫的影響。

表1 間隙水NH4+占TN的比例

由于筆者試驗中在沉積物-水系統(tǒng)中添加了還原態(tài)硫，其硝酸鹽的還原并不能確定是由反硝化菌介導(dǎo)的微生物代謝過程還是由還原劑引發(fā)的純化學(xué)氧化還原反應(yīng)所至。因此，對沉積物中微生物群落進行分析。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)變化

選取Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)對微生物群落多樣性進行分析，Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)越小，表明微生物群落多樣性越低。L和H組Chao指數(shù)分別為2 937.60和2 975.03，Shannon指數(shù)分別為5.58和5.61，均低于對照組N的3 547.02和5.91，說明還原態(tài)硫?qū)е鲁练e物微生物群落豐富度和多樣性下降，可能是還原態(tài)硫的毒性抑制了某些種類微生物生長。圖6(A)、(B)分別顯示門和屬水平上N、L和H組微生物群落組成?？梢钥闯觯@3組在門水平上的微生物組成相似，均隸屬于17個門。相對豐度最高的微生物是變形菌門(Proteobacteria)，在37.85%～44.35%之間。變形菌門包含了大多數(shù)硝酸鹽去除過程中常見的反硝化菌[23-24]，其在微生物群落中占據(jù)絕對優(yōu)勢，有利于系統(tǒng)中硝酸鹽的去除。此外，占據(jù)相對優(yōu)勢地位的還有綠彎菌門(Chloroflexi)(10.53%～14.68%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(5.44%～5.56%)等，隸屬于綠彎菌門和酸桿菌門的微生物也被報道在反硝化過程中起重要作用[25]。在屬水平上，N、L和H組Thiobacillus相對豐度分別為4.95%、5.76%和6.91%。Thiobacillus是典型的硫自養(yǎng)反硝化菌，其在3組裝置中均占據(jù)優(yōu)勢地位，表明系統(tǒng)中硝酸鹽的還原以硫自養(yǎng)反硝化路徑為主。其余相對豐度較高的菌屬還包括Gp6(2.36%～2.62%)、Streptophyta(1.81%～2.53%)等。

N、L和H指還原態(tài)硫投加量分別為0、50和75 mg·L-1。

篩選出微生物群落中與氮循環(huán)、硫循環(huán)相關(guān)的功能菌屬(圖7)，主要有硫酸鹽還原細菌(sulfate reducing bacteria，SRB)、硫自養(yǎng)反硝化細菌(sulfur autotrophic denitrifying bacteria，SADB)、異養(yǎng)硝酸鹽還原菌(heterotrophic nitrate reducing bacteria，HNRB)。SRB包括Desulfatiglans和Desulfobulbus，能以硫酸鹽、亞硫酸鹽為電子受體將其還原為硫化物[26]，其相對豐度在1.68%～1.82%之間，組間沒有顯著差異。它們的存在說明系統(tǒng)中發(fā)生了硫還原作用，與硫氧化作用共同組成硫循環(huán)。SADB包含Thiobacillus和Dechloromonas，它們均屬于β-變形菌綱[27]，具有氧化低價態(tài)硫元素的能力，常出現(xiàn)在以硫代硫酸鈉、單質(zhì)硫為電子供體的硫自養(yǎng)反硝化系統(tǒng)中[28]。圖7顯示，SADB相對豐度隨著還原態(tài)硫濃度的增加而上升，不同組別SADB相對豐度由低到高依次為N組(5.69%)、L組(6.52%)和H組(8.70%)。一般來說，SADB能夠從硫氧化作用中獲取能量用于自身生長[29]，而還原態(tài)硫是SADB進行硫氧化作用的底物，所以還原態(tài)硫濃度高的環(huán)境(L和H組)有利于其進行硫氧化作用和生長。HNRB主要有Anaeromyxobacter、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、Gemmobacter和Hyphomicrobium。由圖7可知，3組裝置中HNRB相對豐度相近且均低于SADB，分別為0.98%(N組)、0.91%(L組)和1.05%(H組)。雖然沉積物能為HNRB提供充足的碳源，但是HNRB在對硝態(tài)氮的競爭中處于劣勢地位，因而其相對豐度遠低于SADB。隸屬于HNRB的幾個菌屬中，相對豐度較高的僅有Anaeromyxobacter(0.82%～0.98%)，其余3種菌屬相對豐度很低，均在0.07%以下。值得一提的是，Anaeromyxobacter缺乏反硝化作用中的nirS和nirK基因，只能還原硝態(tài)氮生成氨氮來獲得能量[17]，其是典型的DNRA微生物[30]。Anaeromyxobacter相對豐度在3組裝置中沒有顯著差異，說明其生長沒有受到還原態(tài)硫的影響，因此，沉積物中DNRA過程沒有被顯著促進或抑制。

HNRB為異養(yǎng)硝酸鹽還原菌，SADB為硫自養(yǎng)反硝化細菌，SRB為硫酸鹽還原細菌。N、L和H指還原態(tài)硫投加量分別為0、50和75 mg·L-1。

3 結(jié)論

(1)在沉積物-水系統(tǒng)中，沉積物有機氮經(jīng)過礦化作用轉(zhuǎn)化為氨氮，氨氮沿沉積物-間隙水-上覆水?dāng)U散，上覆水氨氮經(jīng)過硝化作用轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，硝態(tài)氮沿上覆水-間隙水?dāng)U散，在間隙水中發(fā)生硝酸鹽還原作用。在還原態(tài)硫的作用下，硝酸鹽還原作用被促進，加速系統(tǒng)中氮營養(yǎng)鹽的轉(zhuǎn)化。

(2)硫自養(yǎng)反硝化菌Thiobacillus相對豐度隨著添加的還原態(tài)硫濃度的增加而增加，表明硫自養(yǎng)反硝化是沉積物中硝酸鹽還原的主要路徑。

(3)DNRA過程在沉積物硝酸鹽還原作用中占據(jù)很低的比例，且沒有受到還原態(tài)硫的顯著影響。