遼東地區(qū)胡桃楸人工林根際和非根際土壤細(xì)菌多樣性

吳光偉，傅靖棋，赫亮亮，范新蕊，蘇治鑫，朱 瑞，孫建文，張麗杰

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院/遼寧省林木遺傳育種與培育重點實驗室,沈陽 110161；2.遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心，沈陽 110032；3.撫順縣三塊石林場，遼寧 撫順 113108；4.撫順市林業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 撫順 113006）

土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤形成、有機質(zhì)合成與分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)化與能量傳遞等方面具有調(diào)控作用[1-7]。而細(xì)菌作為土壤微生物中最豐富的類群，以其對環(huán)境變化的敏感性和活躍性成為影響土壤健康的重要指示指標(biāo)[8-14]；在森林生態(tài)系統(tǒng)中，細(xì)菌群落及多樣性不僅影響著土壤養(yǎng)分及有機質(zhì)的變化，而且也影響著樹木的生長發(fā)育，參與了物種更新及植物群落演替的過程[15-18]；同時，森林凋落物、根系分泌物以及微環(huán)境也影響著土壤理化性質(zhì)及土壤微生物群落分布[19-21]。因此，植物根系、土壤環(huán)境及土壤微生物之間相互影響形成穩(wěn)定的互惠關(guān)系促進樹木的生長發(fā)育[22-23]。

胡桃楸（Juglans mandshurica）為胡桃科胡桃屬落葉喬木，是我國東北地區(qū)珍貴的闊葉鄉(xiāng)土樹種，也是東北地區(qū)重要的木本油料樹種[24-26]。由于過度采伐等因素的干擾使胡桃楸天然林日益減少，已被列為國家Ⅱ級珍稀瀕危樹種[26-28]。在遼東山區(qū)現(xiàn)有天然林中，胡桃楸中幼林占有大部分比例，且多為萌生林，其干形、分叉較多，成材率降低。因此，大力發(fā)展胡桃楸人工林，培育速生優(yōu)質(zhì)大徑材成為當(dāng)前迫切任務(wù)[29]。目前關(guān)于胡桃楸的研究主要集中在林分分布規(guī)律[30]、次生林物種組成及多樣性[31]、地位指數(shù)[32]、天然林優(yōu)樹選擇及果實多樣性[33]、生殖生物學(xué)[34-35]、花芽發(fā)育物質(zhì)代謝[36]和化學(xué)物質(zhì)[37-39]等方面，而有關(guān)遼東山區(qū)胡桃楸示范林土壤微生物細(xì)菌群落多樣性未見報道。因此，本研究選取2017年在遼寧省撫順縣三塊石林場建立的胡桃楸示范林根際和非根際土壤，通過Illumina NovaSeq 高通量測序技術(shù)分析土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，以期闡明胡桃楸人工林土壤細(xì)菌微生物多樣性，為培育速生優(yōu)質(zhì)胡桃楸大徑材林木提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地位于遼寧省撫順縣三塊石林場長水溝11 林班26 小班（東經(jīng)124°21'～125°38'，北緯41°45'～42°28'）。研究地年平均氣溫6.04℃，年均降水886.4mm，全年無霜期145d。該地區(qū)土壤類型為暗棕色森林土，氣候類型為溫帶大陸性季風(fēng)氣候。

1.2 材料

2020年5月初，在人工示范林內(nèi)分別設(shè)置3 塊15m×15m的樣方，在每個樣方內(nèi)沿S形路徑隨機設(shè)置10個采集地點，去除表層土壤，根際土取樣時先將3a 生胡桃楸苗木挖出，自然抖落法收集根際土壤，距離根系大于1cm的土壤記為非根際土壤，將采集的土壤放入自封袋中做好標(biāo)記放入冰盒，用于土壤微生物高通量測序以及土壤理化性質(zhì)的測定。

1.3 試驗方法

采用pH 計測定土壤pH 值；使用元素分析儀測定土壤全碳（TC）、全氮（TN）和速效氮（AN）含量；使用H2SO4-HClO4酸溶法測定全磷（TP）含量；使用NH4F-HCl 測定有效磷（AP）含量[39]。土壤基因組DNA 采用試劑盒法（MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA）提取，應(yīng)用細(xì)菌16S V4-V5 區(qū)引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和909R（5'-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3'）進行PCR 擴增和構(gòu)建文庫，使用Illumina 測序平臺進行上機測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

使用SPSSV22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析，用皮爾遜相關(guān)系數(shù)評價土壤的理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性指數(shù)的相關(guān)性，以及優(yōu)勢細(xì)菌類群與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡桃楸人工示范林土壤的理化性質(zhì)

由表1可知，示范林根際土壤pH為6.15，極顯著高于非根際土壤；根際土壤全碳含量為28.65g·kg-1，顯著高于非根際土壤；根際土壤全氮含量為2.37g·kg-1，顯著高于非根際土壤；根際土壤速效氮含量為284.73mg·kg-1，低于非根際土壤；根際土壤全磷含量為0.94g·kg-1，極顯著高于非根際土壤；根際土壤有效磷含量為12.82mg·kg-1，極顯著高于非根際土壤。

表1 胡桃楸示范林地土壤理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of soil in Juglans mandshurica demonstration forest land

2.2 胡桃楸人工示范林土壤細(xì)菌多樣性

由表2 可知，示范林地胡桃楸根際土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)為6.55，顯著高于非根際土壤；根際土壤細(xì)菌ACE 指數(shù)為2112.60，顯著高于非根際土壤；Chao1指數(shù)為1985.72，極顯著高于非根際土壤。

表2 示范林地胡桃楸土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)Table 2 Bacteria diversity index of Juglans mandshurica demonstration forest land

2.3 胡桃楸人工示范林土壤細(xì)菌α多樣性與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

由圖1可知，示范林地胡桃楸土壤細(xì)菌的香農(nóng)指數(shù)與土壤pH、全磷含量和有效磷含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.959，p＜0.01；r=0.955，p＜0.01；r=0.925，p＜0.01），且與土壤全碳含量和全氮含量呈顯著正相關(guān)（r=0.903，p＜0.05；r=0.917，p＜0.05）；ACE 指數(shù)與土壤pH、全磷含量和有效磷含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.949，p＜0.01；r=0.971，p＜0.01；r=0.931，p＜0.01），且與土壤全碳含量和全氮含量呈顯著正相關(guān)（r=0.903，p＜0.05；r=0.914，p＜0.05）；Chao1指數(shù)與土壤pH、全磷含量和有效磷含量呈極 顯 著 正 相 關(guān)（r=0.957，p＜0.01；r=0.964，p＜0.01；r=0.944，p＜0.01），且與土壤全碳含量和全氮含量呈顯著正相關(guān)（r=0.895，p＜0.05；r=0.909，p＜0.05）；辛普森指數(shù)與土壤pH、全碳含量、全磷含量和有效磷含量呈極顯著正相關(guān)（r=0.937，p＜0.01；r=0.963，p＜0.01；r=0.968，p＜0.01；r=0.945，p＜0.01；r=0.881，p＜0.01）。

圖1 土壤細(xì)菌α多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析Figure 1 Pearson correlation analysis between soil bacteria α diversity index and soil physical and chemical properties

2.4 胡桃楸人工示范林土壤細(xì)菌群落豐度分析

由圖2a可知，在細(xì)菌門水平上，胡桃楸根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌主要為：放線菌門（Actinobacteriota）占42.57%；變形菌門（Proteobacteria）占24.94%；酸桿菌門（Acidobacteriota）占15.00%；綠彎菌門（Chloroflexi）占4.71%；芽單胞菌門（Gemmatimonadota）占2.18%；甲基微菌門（Methylomirabilota）占1.90%；粘球菌門（Myxococcota）占1.73%。非根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌主要為：放線菌門（Actinobacteriota）占41.31%；變形菌門（Proteobacteria）占23.79%；酸桿菌門（Acidobacteriota）占16.20%；綠彎菌門（Chloroflexi）占4.67%；甲基微菌門（Methylomirabilota）占2.52%；芽單胞菌門（Gemmatimonadota）占2.00%；粘球菌門（Myxococcota）占1.55%。

由圖2b可知，在細(xì)菌綱水平上，胡桃楸根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌分別為：嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）占26.29%；α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）占17.45%；放線菌綱（Actinobacteria）占11.01%；γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）占7.49%；維氏細(xì)菌綱（Vicinamibacteria）占7.21%；酸桿菌綱（Acidobacteriae）占3.52%；KD4_96 占2.91%；芽球菌綱（Blastocatellia）占2.57%；MB_A2_108 占2.53%，酸微菌綱（Acidimicrobiia）占2.42%；芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）占2.08%；甲基微菌綱（Methylomirabilia）占1.90%。非根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌主要為：嗜熱油菌綱（Thermoleophilia）占27.26%；α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）占17.06%；放線菌綱（Actinobacteria）占8.99%；維氏細(xì)菌綱（Vicinamibacteria）占7.06%；γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）占6.73%；酸桿菌綱（Acidobacteriae）占4.64%；KD4_96 占2.86%；芽球菌綱（Blastocatellia）占2.84%；MB_A2_108 占2.65%；甲基微菌綱（Methylomirabilia）占2.52%；酸微菌綱（Acidimicrobiia）占2.06%；芽單胞菌綱（Gemmatimonadetes）占1.94%。

圖2 示范林地胡桃楸土壤細(xì)菌群落相對豐度Figure 2 Relative abundance of Juglans mandshurica soil bacterial community in demonstration forest land

由圖2c 可知，在細(xì)菌目水平上，根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌分別為：蓋勒氏菌目（Gaiellales）占17.26%；根瘤菌目（Rhizobiales）占13.97%；土壤紅桿菌目（Solirubrobacterales）占8.28%；維氏細(xì)菌目（Vicinamibacterales）占6.56%；伯克氏菌目（Burkholderiales）占4.59%；法蘭克目（Frankiales）占3.94%；芽單胞菌目（Gemmatimonadales）占2.08%；擬單胞菌目（Pyrinomonadales）占2.01%；羅氏桿菌目（Rokubacteriales）占1.88%；酸桿菌目（Acidobacteriales）占1.84%；小單孢菌目（Micromonosporales）占1.74%；黃單胞菌目（Xanthomonadales）占1.62%；IMCC26256占1.52%；丙酸桿菌目（Propionibacteriales）占1.17%。非根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌主要為：蓋勒氏菌目（Gaiellales）占18.64%；根瘤菌目（Rhizobiales）占14.12%；土壤紅桿菌目（Solirubrobacterales）占7.98%；維氏細(xì)菌目（Vicinamibacterales）占6.40%；伯克氏菌目（Burkholderiales）占3.99%；法蘭克目（Frankiales）占3.47%；羅氏桿菌目（Rokubacteriales）占2.51%；酸桿菌目（Acidobacteriales）占2.45%；擬單胞菌目（Pyrinomonadales）占2.32%；芽單胞菌目（Gemmatimonadales）占1.94%；黃單胞菌目（Xanthomonadales）占1.52%；IMCC26256 占1.32%；小單孢菌目（Micromonosporales）占1.27%；丙酸桿菌目（Propionibacteriales）占1.03%。

由圖2d可知，在細(xì)菌科水平上，根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌分別為：黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）占11.07%；蓋勒氏菌科（Gaiellaceae）占4.67%；67_14占4.20%；土壤紅桿菌科（Solirubrobacteraceae）占4.08%；芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）占2.08%；核單胞菌科（Pyrinomonadaceae）占2.01%；小單孢菌科（Micromonosporaceae）占1.74%；熱酸菌科（Acidothermaceae）占1.61%；叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）占1.21%；類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）占1.17%；亞硝化單胞菌科（Nitrosomonadaceae）占1.14%，黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）占1.03%。非根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌主要為：黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）占11.74%；蓋勒氏菌科（Gaiellaceae）占5.12%；67_14占4.62%；土壤紅桿菌科（Solirubrobacteraceae）占3.36%；芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）占1.94%；核單胞菌科（Pyrinomonadaceae）占2.32%，小單孢菌科（Micromonosporaceae）占1.27%；熱酸菌科（Acidothermaceae）占1.72%，類諾卡氏菌科（Nocardioidaceae）占1.03%。

由圖2e可知，在細(xì)菌屬水平上，根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為：蓋勒氏菌屬（Gaiella）占4.67%；束縛菌屬(Conexibacter)占2.14%；慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)占2.05%；RB41 占2.01%，嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus）占1.61%，紅游動菌屬（Rhodoplanes）占1.44%，土壤紅桿菌屬（Solirubrobacter）占1.30%，游動放線菌屬（Actinoplanes）占1.03%。非根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌主要為：蓋勒氏菌屬（Gaiella）占5.12%；束縛菌屬(Conexibacter)占1.86%；慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)占2.31%；RB41 占2.32%，嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus）占1.72%，紅游動菌屬（Rhodoplanes）占1.51%。

2.5 胡桃楸土壤優(yōu)勢細(xì)菌類群與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

由圖3可知，土壤微生物中放線菌門（Actinobacteriota）和變形菌門（Proteobacteria）與土壤pH、全磷含量、全氮含量和有效磷含量呈正相關(guān)，且與土壤速效氮含量呈負(fù)相關(guān)；酸桿菌門（Acidobacteriota）與土壤理化性質(zhì)呈負(fù)相關(guān)（土壤速效氮含量除外）；綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和粘球菌門（Myxococcota）與土壤pH、土壤全碳含量和全氮含量呈正相關(guān)；甲基微菌門（Methylomirabilota）與土壤pH 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.916,p＜0.05）,與土壤有效磷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.925,p＜0.01）。

圖3 土壤優(yōu)勢細(xì)菌門類群與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between dominant bacterial phyla groups and soil physical and chemical properties

3 討論與結(jié)論

大量研究表明，不同林型和物種均會不同程度地影響根際與非根際土壤理化性質(zhì)。丁新景等[41]通過對黃河三角洲刺槐根際與非根際細(xì)菌結(jié)構(gòu)及多樣性研究發(fā)現(xiàn)，刺槐根際與非根際土壤pH、電導(dǎo)率、土壤含水量、硝態(tài)氮和速效鉀含量差異不顯著；根際土壤中有機質(zhì)含量、堿解氮、有效磷以及可溶性有機碳和可溶性有機氮含量顯著高于非根際土壤。周乃富等[42]通過對油茶林地土壤養(yǎng)分進行分析測定發(fā)現(xiàn)根際土壤有效磷的含量明顯高于非根際土壤；茍小林等[43]對不同氣候區(qū)的兩種優(yōu)勢植物根際土壤養(yǎng)分特征進行研究發(fā)現(xiàn)根際與非根際土壤全氮含量存在顯著差異（p＜0.05）；戴齊等[44]通過對不同植被類型草灌根際與非根際土壤理化性質(zhì)進行研究發(fā)現(xiàn)同一植被類型全磷含量在根際土壤中明顯低于非根際土壤；李德文等[45]對杜仲根際與非根際的土壤理化性質(zhì)分析得出根際土壤中的C、N、P含量均高于非根際土壤。在本研究中，通過對胡桃楸人工示范林根際和非根際土壤理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明：根際與非根際土壤理化性質(zhì)具有較大的差異，根際土壤全碳、全氮含量均顯著高于非根際土壤（p＜0.05），根際土壤全磷含量、土壤pH 值以及有效磷含量和胡桃楸非根際土壤達到極顯著水平差異(p＜0.01)，與上述研究結(jié)果一致，說明不同植被類型會影響土壤理化性質(zhì)。

胡桃楸在生長過程中根系會分泌大量的有機酸、胡桃醌等物質(zhì)，這些分泌物的產(chǎn)生會使胡桃楸根系生長范圍內(nèi)形成一個特殊的根際微環(huán)境，同時也影響了根際土壤微生物的種類和數(shù)量，使胡桃楸根際與非根際土壤理化性質(zhì)存在較大的差異[46]。土壤微生物群落的種類和數(shù)量影響著樹木對土壤中C、N 的吸收以及利用[47]。本研究利用NovaSeq 測序技術(shù)分析了遼東山區(qū)胡桃楸人工示范林內(nèi)根際與非根際土壤微生物種類及多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：胡桃楸根際土壤微生物中細(xì)菌豐富度高于非根際土壤，在細(xì)菌門水平上主要是放線菌門（Actinobac‐teriota）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteriota），其豐富度均超過15%，是該地區(qū)胡桃楸示范林根際與非根際土壤微生物的優(yōu)勢菌群，這一研究結(jié)果與前人[48-50]的研究一致。柳春林等[51]通過對不同演替階段的森林土壤細(xì)菌多樣性進行研究結(jié)果表明放線菌門和變形菌門以及酸桿菌門是細(xì)菌中主要優(yōu)勢菌群；杜瀅鑫等[52]在大慶鹽堿地中選取9 種植物對其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性研究，結(jié)果顯示土壤中存在的放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是細(xì)菌中的絕對優(yōu)勢種；汪其同等[53]通過測定楊樹人工林根際和非根際土壤微生物多樣性，結(jié)果表明楊樹的根際土壤細(xì)菌群落豐度高于非根際，該研究與本研究結(jié)果相一致，說明不同樹種根際微生物主要菌群相對豐度類似。變形菌門與土壤碳含量呈正相關(guān)，該研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致[54]。且放線菌門、變形菌門和酸桿菌門是胡桃楸根際土壤細(xì)菌中的絕對優(yōu)勢種，該研究結(jié)果與陳雅昕等研究結(jié)果一致[55]。變形菌門和酸桿菌門的比例是土壤養(yǎng)分含量的一個指標(biāo)，變形菌門與營養(yǎng)豐富的土壤有關(guān)，它可能在土壤細(xì)菌群落的建立中起關(guān)鍵作用。酸桿菌門可以有效的降解植物殘體，其相對豐度與土壤pH 值有關(guān)，在本研究中酸桿菌門與土壤pH值呈負(fù)相關(guān)，與劉彩霞等研究結(jié)果相一致[56]。在本研究中發(fā)現(xiàn)胡桃楸根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌屬中慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）占比例較高，而慢生根瘤菌是根瘤菌的一種，在缺氮土壤中尤為重要，其生長速度較慢，能夠與部分植物形成特殊的共生關(guān)系，植物為其提供所需的能量，慢生根瘤菌可固定氮來促進植物的新陳代謝。除了這些常見的微生物外，在本研究的土壤樣本中還發(fā)現(xiàn)了一些獨特的微生物，例如嗜酸棲熱菌屬，通常在酸性環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，但在植物根際中鮮有報道，它們的功能以及和植物之間的關(guān)系有待進一步研究。在根際土壤微生物中，有很多種類的細(xì)菌通過不同的機制影響著植物根系對土壤養(yǎng)分的吸收，同時與土壤理化性質(zhì)之間相互制約、相互影響，樹木從土壤中吸收養(yǎng)分并將代謝物釋放到土壤中，進而影響土壤中微生物的多樣性及土壤結(jié)構(gòu)。本研究首次探明了遼東山區(qū)胡桃楸人工林根際和非根際土壤細(xì)菌群落多樣性特征，并對土壤理化性質(zhì)和土壤微生物多樣性進行了相關(guān)性分析，該研究為胡桃楸人工林健康經(jīng)營和培育優(yōu)質(zhì)速生大徑材提供了理論基礎(chǔ)。

本研究通過對示范林胡桃楸根際土壤進行高通量測序探討根際與非根際土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，研究得出：根際與非根際土壤理化因子差異顯著，胡桃楸示范林根際和非根際土壤在門、綱、目、科、屬分類水平上的優(yōu)勢細(xì)菌類群主要為放線菌門（Actinobacteriota）、嗜熱油菌綱（Thermoleo‐philia）、蓋勒氏菌目（Gaiellales）、黃色桿菌科（Xanthobacteraceae）以及蓋勒氏屬（Gaiella）。土壤理化因子與微生物多樣性指數(shù)相關(guān)性較強。甲基微菌門（Methylomirabilota）與土壤pH 呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.916，p＜0.05）,與土壤有效磷含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.925，p＜0.01）。以土壤微生物優(yōu)勢細(xì)菌門類群與土壤理化性質(zhì)進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明土壤pH 值和有效磷含量是影響該地區(qū)胡桃楸人工林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的主控因子。該研究結(jié)果首次揭示了遼寧東部山區(qū)人工示范林內(nèi)胡桃楸土壤細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性，為高效培育胡桃楸人工示范林奠定了理論基礎(chǔ)，具有重要的實踐意義。