腫瘤相關成纖維細胞外泌體miR-34c-5p調(diào)控喉癌干細胞樣生物學特性的體外實驗研究△

次旺卓瑪 吳春萍 柳曉進 黃強 蔡國遇 格桑 周梁 杜懷棟

(1.西藏自治區(qū)日喀則市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科 西藏 857000；2.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科 上海 200031)

腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境中最重要的基質(zhì)細胞，具有明顯的促進腫瘤生長效應，對于腫瘤的發(fā)生和進展起到至關重要的作用[1]。CAFs能夠增強乳腺癌[2]、胃癌[3]、結(jié)腸癌[4]及肝癌[5]等多種腫瘤細胞的干細胞樣生物學特性及腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)的自我更新能力[例如提高干細胞相關基因(SOX2及BMI1等)表達及增強球體形成能力等]。近年來發(fā)現(xiàn)CAFs可通過外泌體這一重要介質(zhì)調(diào)控腫瘤細胞的生物學特性。外泌體是直徑為30～150 nm的微囊泡結(jié)構，包裹著蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、lncRNA等生物活性分子，是腫瘤微環(huán)境細胞之間信息傳遞的重要載體[6]。CAFs分泌的外泌體miR-34a-5p能夠調(diào)控口腔癌細胞的增殖、侵襲等腫瘤干細胞樣生物學特性[7]。然而，在喉癌CAFs對喉癌細胞生物學特性的調(diào)控作用中是否存在類似的調(diào)控機制以及究竟是何種miRNA起到這樣的關鍵調(diào)控作用尚不清楚。

我們的前期預實驗表明，喉癌組織中分離出來的CAFs無論是通過和喉癌細胞共培養(yǎng)還是用CAFs的培養(yǎng)液上清，都能夠明顯促進喉癌細胞系的體外增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)成瘤等CSC樣生物學特 性[8]。因此推測，喉癌CAFs外泌體中存在異常表達的miRNAs，這類miRNAs借助于CAFs外泌體傳遞給喉癌細胞并對后者進行了生物學特性的調(diào)控。我們的前期高通量測序檢測發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的喉癌CAFs外泌體中存在異常表達的幾個關鍵miRNAs，其中miR-34c-5p表達顯著下調(diào)。本研究的目的為進一步驗證表達下調(diào)的外泌體miR-34c-5p對喉癌細胞的增殖、侵襲、球體形成及平板克隆形成能力等CSC樣生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 喉癌CAFs的原代培養(yǎng)及鑒定參見文獻[8]。CAFs 培養(yǎng)于高糖DMEM (4 500 mg/L,Hyclone,美國) +1%青鏈雙抗(Invitrogen,美國)+10%無外泌體胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Invitrogen，Gibco)中。AMC-HN-8細胞系來源于復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院頭頸外科課題組并且培養(yǎng)于DMEM或來自CAFs的不同條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM) 。2種細胞均置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 CAFs外泌體提取及鑒定

1.2.1 外泌體提取 本研究采用試劑盒法提取CAFs外泌體，參照課題組先前的方法[9]，將CAFs培養(yǎng)液上清4 ℃離心(1 500×g，10 min)；再取上清4 ℃離心(10 000×g，30 min)；再用0.22 μm濾膜過濾去除細胞碎片以及用超濾離心(Amicon? Ultra-15 100 kDa;Merck KGaA)進行濃縮；之后用外泌體提取試劑盒(Ribo? Exosome Isolation Reagent，銳博生物，廣州)，根據(jù)操作說明進行外泌體提取。收集的CAFs外泌體沉淀，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)后保存于_80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外泌體鑒定 采用納米粒徑追蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)檢測外泌體粒子的大小和濃度。取100 μL外泌體懸液，4 ℃ PBS 稀釋后加入比色皿，置入粒度電位儀樣品池,布朗運動(60 s)后用粒子追蹤軟件分析納米粒子的大小、分布和濃度。

采用透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM) 觀察外泌體顆粒的外貌和大小。取PBS稀釋后的外泌體懸液20 μL，滴加到碳覆膜銅網(wǎng)后吸除多余液體。室溫過夜后用1%戊二醛固定及醋酸雙氧鈾染色(避光，30 s)，吸除多余液體。室溫風干后80 kV TEM觀察并拍照。

采用Western印跡檢測外泌體蛋白標記物。用RIPA裂解液(碧云天，南通)裂解對照細胞及外泌體，測定蛋白濃度。蛋白分離用SDS凝膠(碧云天)電泳，再轉(zhuǎn)PVDF膜(Millipore,美國)。5%脫脂奶粉封閉后加入兔一抗CD63 (1∶1 000,Abcam,美國)、calnexin (1∶2 000,Abcam) 及TSG101 (1∶2 000,Abcam)4 ℃過夜孵化，隨后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG二抗(1∶2 000，Jackson)室溫孵化1 h。最后用BeyoECL Plus試劑盒(超敏ECL化學發(fā)光試劑盒，碧云天)顯色并拍照。

1.3 miR-34c-5p過表達及轉(zhuǎn)染效率評估 以真核表達載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR (Invitrogen)為基礎，用分子克隆的方法構建miR-34c-5過表達質(zhì)粒。將CAFs接種于6孔板，密度為2×105個細胞/孔。培養(yǎng)24 h，用Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染(按操作說明進行)。對照組(NC)為轉(zhuǎn)染無關干擾序列的CAFs。用250μL Opti-MEM I(Invitrogen)稀釋4 μg過表達/空載質(zhì)粒，用250 μL Opti-MEM Ⅰ 稀釋10 μL Lipo2000，室溫靜置5 min后將兩者輕輕混勻，室溫下再靜置20 min后加入6孔板培養(yǎng)，Mock對照組為只添加Lipofectamine 2000的CAFs，空白對照組為不添加任何試劑的CAFs。miR-34c-5p過表達效果的驗證采用實時聚合酶鏈反應 (real time polymerase chain reaction，RT-PCR)法，snRNA U6為內(nèi)參。miR-34c-5p轉(zhuǎn)染效率用轉(zhuǎn)染后4～6 h顯微鏡下CAF熒光細胞計數(shù)/同一視野白光細胞計數(shù)比例進行評估。

1.4 CAFs外泌體miR-34c-5p過表達RT-PCR驗證 收集以下4組不同CAFs CM培養(yǎng)液上清的外泌體，用RT-PCR驗證各組miR-34c-5p表達水平。第①～③組：將miR-34c-5p過表達CAFs的實驗組、NC組及Mock組均培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液上清，用以上試劑盒法提取外泌體備用。第④組為不做任何處理的CAFs，培養(yǎng)48 h。提取培養(yǎng)液上清中的外泌體備用，作為空白對照。TRIzol法提取4組外泌體提取物中的RNA，用PrimeScriptTM RT reagent Kit 試劑盒(Takara,大連)逆轉(zhuǎn)錄RNA，PCR擴增用SYBR? Premix Ex TaqTM 試劑盒(Takara,大連) 根據(jù)說明操作。snRNA U6為內(nèi)參，2-ΔCT法計算miR-34c-5p的相對表達水平。熱循環(huán)條件：95 ℃ 預變性30 s，40個循環(huán)(95 ℃ 變性5 s及60 ℃退火延伸34 s)，溶解曲線(95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)。引物序列見表1。

表1 miRNAs引物序列

1.5 2種CAF外泌體CM的制備 將未處理CAFs及過表達miR-34c-5p的CAFs培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液上清，按照以上1.2.1試劑盒法提取外泌體。以5 mL CAFs培養(yǎng)液上清所提取外泌體加200 μL PBS作為后續(xù)實驗的外泌體母液制備CM，保存于-80 ℃。分別命名為未處理CAF exosome CM及miR-34c-5p 過表達CAF exosome CM。

1.6 增殖實驗 用CCK-8試劑盒實驗來檢測各組喉癌細胞增殖能力的差異。將喉癌AMC-HN-8細胞消化后懸浮于高糖DMEM +1%青鏈雙抗+10%無外泌體FBS培養(yǎng)液中。向培養(yǎng)液中分別加入以上2種不同的CAFs外泌體母液，每5 mL培養(yǎng)液中加入以上2種不同外泌體母液400 μL，調(diào)整細胞濃度為104個細胞/mL，取0.2 mL接種于96孔培養(yǎng)板，密度為2 000個細胞/孔。以不加外泌體CM的AMC-HN-8細胞為對照。在細胞培養(yǎng)的0、24、48、72、96 h分別用CCK-8試劑盒檢測，按照說明書操作,37°C孵化 3 h，每組設置6個復孔，并設置只加培養(yǎng)液不加細胞的6個孔為空白對照，酶標儀檢測波長為450 nm的吸光度值。

1.7 侵襲實驗 用Transwell檢測各組喉癌細胞的侵襲能力。將喉癌AMC-HN-8細胞消化后懸浮于高糖DMEM +1%青鏈雙抗培養(yǎng)液(不含F(xiàn)BS)中，調(diào)整細胞濃度為104個細胞/mL，取0.2 mL接種于底部含基質(zhì)膠的Transwell上室(Corning，美國，孔徑8 μm)，向每孔上室中加入50 μL 以上2種不同的CAFs外泌體母液。Transwell下室中加入600 μL無外泌體10%FBS血DMEM。以不加外泌體CM的AMC-HN-8細胞為對照。培養(yǎng)24 h后從培養(yǎng)箱取出上室，棄培養(yǎng)液后PBS 洗滌，用棉簽擦凈上室底部上表面喉癌細胞。將上室底部用多聚甲醛固定20 min后再用0.25% 結(jié)晶紫染液染色15 min。顯微鏡下觀察上室底部下表面穿過Transwell 小孔的喉癌細胞個數(shù)，取10個隨機視野進行計數(shù)。

1.8 無血清球體實驗 將喉癌AMC-HN-8細胞消化后懸浮于無血清培養(yǎng)液StemPro NSC SFM kit (A10509-01，Invitrogen)，密度為5 000個細胞/mL，接種于6孔板，每孔2 mL。向每孔培養(yǎng)液中分別加入以上2種不同的CAFs外泌體母液160 μL，以不加外泌體CM的AMC-HN-8細胞為對照。置入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 10 d后在相差顯微鏡下觀察3組細胞的球體形成情況。1.9 平板克隆實驗 將喉癌AMC-HN-8細胞消化后懸浮于高糖DMEM +1%青鏈雙抗+10%無外泌體FBS培養(yǎng)液。向培養(yǎng)液中分別加入以上2種不同的CAFs外泌體母液，每5 mL培養(yǎng)液中加入母液400 μL，調(diào)整細胞濃度為150個細胞/mL，取2 mL接種于6孔培養(yǎng)板，密度為300個細胞/孔。以不加外泌體CM的AMC-HN-8細胞為對照。3組細胞培養(yǎng)2周后PBS洗滌，甲醇固定15 min，0.1% 結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌后在相差顯微鏡下觀察拍照，超過50個細胞的克隆為有效克隆?？寺⌒纬陕视萌缦鹿接嬎悖?有效克隆數(shù)/300)×100%。

1.10 RT-PCR檢測干細胞基因mRNA表達水平 將喉癌AMC-HN-8細胞培養(yǎng)于加入2種不同CM(未處理CAF exosome CM和miR-34c-5p 過表達CAF exosome CM)的DMEM培養(yǎng)液48 h，每5 mL培養(yǎng)液中加入以上2種不同外泌體母液400 μL，以單獨培養(yǎng)于相同DMEM培養(yǎng)基(含10%無外泌體FBS及1%青鏈雙抗)中的喉癌AMCHN-8細胞為對照。檢測3組喉癌細胞的干細胞相關基因(OCT4、SOX2、BMI1及NANOG)表達水平。TRIzol提取總RNA，PrimeScript?RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,大連)逆轉(zhuǎn)錄，SYBR?Premix Ex TaqTM 試劑盒 (Takara) 根據(jù)操作說明進行PCR擴展。熱循環(huán)條件：預變性 95 ℃ 10 min,40個循環(huán)(95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s)。熔解曲線(60 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃)。內(nèi)參為GAPDH。采用2-ΔΔCT法計算mRNA的相對表達水平。引物序列見表2。

表2 RTPCR 引物序列

1.11 Western印跡檢測干細胞基因蛋白表達水平 將3組喉癌AMC-HN-8細胞用與1.10相同的方法培養(yǎng)48 h。再用RIPA裂解液裂解，后續(xù)蛋白濃度檢測、電泳、抗體孵化等步驟同前1.2.2。所用一抗為兔OCT4 (BIOSS,1∶1 000)、兔BMI1(Arigo,1∶1 000)、小鼠SOX2 (Arigo,1∶1 000)及兔NANOG (Abcam,1∶1 000)、兔β-actin(Abcam,1∶6 000)，二抗為羊抗兔/小鼠辣根過氧化物酶 (KPL,1∶50 000) 。

1.12 統(tǒng)計學處理 每組實驗數(shù)據(jù)至少3次重復，用均數(shù)±標準差表示。2組數(shù)據(jù)之間比較用獨立樣本成組t檢驗，設置P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism 9 (GraphPad Software,美國)軟件 繪圖。

2 結(jié)果

2.1 CAFs外泌體鑒定、miR-34c-5p過表達及轉(zhuǎn)染效率評估 TEM觀察發(fā)現(xiàn)包膜完整、直徑為50～300 nm的顆粒，其中大部分顆粒直徑為100～200 nm (圖1A)。Western印跡結(jié)果提示CD63及 CD81陽性，這是2個經(jīng)典的外泌體陽性蛋白指標。另外，蛋白標記物calnexin表達為陰性(圖1B)。NTA檢查結(jié)果提示粒徑分布范圍為(125.7±50.4)nm(圖1C)。miR-34c-5p過表達轉(zhuǎn)染效率為85%～90%(圖1D～F)。

圖1 CAFs外泌體鑒定及轉(zhuǎn)染效率評估 A.TEM觀察發(fā)現(xiàn)大部分顆粒的直徑為100～200 nm(比例尺：500 nm)；B.Western印跡發(fā)現(xiàn)外泌體為CD63及CD81陽性，calnexin陰性；C.NTA檢查提示粒徑分布直徑均數(shù)為125 nm；D～F.分別為miR-34c-5p轉(zhuǎn)染效率評估的白光視野、熒光視野和合成視野。

2.2 CAFs外泌體miR-34c-5p表達RT-PCR驗證 miR-34c-5p表達水平最高的是miR-34c-5p過表達實驗組CAFs外泌體RNA的提取物，而3個對照組(NC組、Mock組及空白對照組)CAFs外泌體RNA中miR-34c-5p表達水平均很低，3組表達水平差異無統(tǒng)計學意義。詳見圖2。

圖2 4組CAFs外泌體miR-34c-5p表達RT-PCR結(jié)果 miR-34c-5p過表達實驗組CAFs外泌體RNA的提取物中miR-34c-5p表達水平最高，而NC組、Mock組及空白對照組miR-34c-5p表達水平均較低。n.s.示P>0.05，**示P<0.01。

2.3 CCK8增殖及Transwell侵襲實驗 CCK8增殖實驗結(jié)果提示：加入未處理CAF外泌體CM后，AMCHN-8喉癌細胞的增殖能力明顯增強，提示CAFs外泌體的加入明顯增強了喉癌細胞的體外增殖能力。當加入miR-34c-5p過表達CAFs的外泌體CM后，CAFs的這一促增殖能力明顯下降，提示外泌體miR-34c-5p的過表達抑制了這一促增殖作用(圖3A、B)。

類似的，Transwell侵襲結(jié)果提示：加入未處理CAF外泌體CM后，AMC-HN-8喉癌細胞的侵襲能力明顯增強，提示CAFs外泌體的加入明顯增強了喉癌細胞的體外侵襲能力。當加入miR-34c-5p過表達CAFs外泌體CM后，CAFs的這一促侵襲能力明顯下降，提示外泌體miR-34c-5p的過表達抑制了這一促侵襲作用（圖3C）。喉癌細胞穿透基質(zhì)膠的數(shù)量從多到少依次為：未處理CAF外泌體CM組(81.20±4.482)個細胞，miR-34c-5p過表達CAFs外泌體CM組(52.50±3.14)個細胞以及對照組(31.80±2.394)個細胞。詳見圖3D～F。

圖3 CAFs外泌體miR-34c-5p調(diào)控AMC-HN-8喉癌細胞增殖和侵襲能力 A、B.3組AMC-HN-8細胞增殖能力比較統(tǒng)計圖；C.3組AMC-HN-8細胞侵襲能力比較統(tǒng)計圖；D～F.分別為未處理CAF外泌體CM組，miR-3c-5p過表達CAF外泌體CM組和對照組喉癌細胞Transwell侵襲實驗典型低倍鏡視野(×100)。*示P<0.05,**示P<0.01。

2.4 無血清球體形成及平板克隆實驗 無血清球體形成實驗表明，加入未處理CAF外泌體CM后，AMC-HN-8喉癌細胞的球體形成能力(球體的數(shù)量和大小)明顯增強(圖4C)，提示CAFs外泌體的加入明顯增強了喉癌細胞無血清球體的形成能力。當加入miR-34c-5p過表達CAFs的外泌體CM后，CAFs的這一促球體形成能力明顯下降(圖4B)，提示外泌體miR-34c-5p的過表達抑制了這一促球體形成作用。

類似的，未處理CAF外泌體CM加入組AMCHN-8喉癌細胞的平板克隆形成能力也明顯增強，有效克隆數(shù)量明顯增多。而miR-34c-5p過表達CAFs的外泌體CM的加入能夠?qū)ξ刺幚鞢AF外泌體 CM的這一促進克隆形成作用起到抑制效果，平板克隆形成的數(shù)量下降。3組細胞克隆形成率依次為：對照組10.76%(32.3/300)，未處理CAF外泌體CM組24.9%(74.7/300)和miR-34c-5p過表達CAFs CM組16.23%(48.7/300)，見圖4E、F。

圖4 CAFs外泌體miR-34c-5p調(diào)控AMC-HN-8喉癌細胞無血清球體和平板克隆形成能力 A～D.3組AMC-HN-8細胞無血清球體形成能力比較典型低倍鏡視野(×100)及統(tǒng)計分析圖；E、F.3組AMC-HN-8細胞平板克隆形成能力比較及統(tǒng)計處理。*示P<0.05,**示P<0.01。

2.5 CAFs外泌體miR-34c-5p調(diào)控喉癌細胞干細胞基因mRNA及蛋白表達 為了尋找CAFs外泌體miR-34c-5p CM對喉癌細胞干細胞樣生物學特性調(diào)控作用的分子生物學機制，我們檢測了3組喉癌細胞干細胞相關基因(OCT4、SOX2、BMI1及NANOG)的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入未處理CAF外泌體 CM后，AMC-HN-8喉癌細胞4個干細胞相關基因的表達水平均有所提高，提示CAFs外泌體CM的加入可以增強喉癌細胞的干細胞相關基因的表達。當加入miR-34c-5p過表達CAFs外泌體CM后，喉癌細胞4個干細胞相關基因的表達水平明顯下降，提示外泌體miR-34c-5p的過表達對喉癌干細胞相關基因的表達具有抑制作用(圖5A)。

同時用Western印跡驗證以上4個基因蛋白表達水平的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了總體類似的結(jié)果，除了OCT4的對照組及miR-34c-5p過表達組之間以及BMI1的未處理CAF外泌體CM組及miR-34c-5p過表達CAF外泌體CM組之間蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義外，4個干細胞相關基因蛋白表達水平的改變趨勢基本一致。未處理CAF外泌體CM能夠明顯提高喉癌細胞4個干細胞相關基因的蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義，而miR-34c-5p過表達后CAFs外泌體CM促進以上干細胞相關基因表達的效果被抑制。詳見圖5B、C。

圖5 CAFs外泌體miR-34c-5p調(diào)控AMC-HN-8喉癌細胞干細胞相關基因表達 A.3組AMC-HN-8細胞干細胞相關基因表達RT-PCR檢測結(jié)果統(tǒng)計分析；B、C.3組AMC-HN-8細胞干細胞相關基因表達Western印跡檢測結(jié)果及統(tǒng)計分析。n.s.示P>0.05,*示P<0.05,**示P<0.01。

3 討論

外泌體是直徑為30～100 nm的細胞外遞質(zhì)，在腫瘤細胞之間以及腫瘤細胞與其他細胞之間的信息溝通中起到關鍵作用。其內(nèi)包裹著miRNAs、蛋白質(zhì)、mRNA、lncRNA等生物活性分子[10]。腫瘤微環(huán)境中最重要的基質(zhì)細胞是CAFs，CAFs產(chǎn)生大量的外泌體調(diào)控腫瘤細胞所處的微環(huán)境，并調(diào)控腫瘤細胞的生物學特性，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。本研究觀察到喉癌CAFs來源的外泌體對喉癌細胞增殖、侵襲、球體及平板克隆形成以及干細胞相關基因表達水平的改變等干細胞樣生物學特性的調(diào)控作用，并發(fā)現(xiàn)這一調(diào)控作用的機制可能為CAFs外泌體中的miR-34c-5p。

外泌體的常用提取方法目前有：超速離心法、沉淀法及試劑盒法等[12]。本研究所用方法為試劑盒提取法[9]。外泌體的鑒定采用目前標準的TEM觀察大小和形態(tài),Western印跡檢測蛋白標記物以及NTA檢測粒徑大小和濃度。結(jié)果TEM檢測發(fā)現(xiàn)了典型的外泌體形態(tài)，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)CD63及CD81表達陽性，而calnexin表達陰性，與文獻報道[13-14]一致。而NTA檢測發(fā)現(xiàn)粒徑直徑為(125.7±50.4)nm[15]。這3個實驗結(jié)果表明，我們所提取的外泌體為合格的外泌體。

我們的前期預試驗發(fā)現(xiàn)，miR-34c-5p在喉癌CAFs中表達很低，為了驗證這樣的表達水平是否對喉癌細胞的生物學特性起到關鍵的調(diào)控作用，我們把miR-34c-5p進行過表達，并進行了表達水平的驗證。

本研究檢測了CAFs外泌體miR-34c-5p對AMCHN-8喉癌細胞增殖和侵襲能力的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未處理CAF外泌體CM的加入能夠明顯提高喉癌細胞的體外增殖和侵襲能力，但是如果把CAFs外泌體中的miR-34c-5p過表達，那么CAF外泌體對喉癌細胞的促進增殖和侵襲能力將明顯減弱。進一步檢測了CAFs外泌體miR-34c-5p對AMC-HN-8喉癌細胞體外無血清球體形成能力和平板克隆形成能力的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未處理CAF外泌體CM的加入能夠明顯提高喉癌細胞的體外無血清球體形成能力以及平板克隆形成能力，但是如果把CAFs外泌體中的miR-34c-5p過表達，那么CAF外泌體對喉癌細胞的促進球體形成和平板克隆形成能力將明顯減弱。

為了證實CAFs外泌體miR-34c-5p對AMC-HN-8喉癌細胞以上諸多干細胞樣生物學特性(增殖、侵襲、球體及平板克隆形成)的調(diào)控作用是否存在內(nèi)在的分子機制，我們進一步檢測了CSCs最重要的4個基因(OCT4、SOX2、BMI1及NANOG)表達水平的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入未處理CAF外泌體CM后，AMC-HN-8喉癌細胞4個干細胞相關基因的表達水平在mRNA及蛋白層面均有不同程度提高。而當加入miR-34c-5p過表達CAFs外泌體CM后，喉癌細胞4個干細胞相關基因的表達水平明顯下降，提示外泌體miR-34c-5p的過表達對喉癌干細胞相關基因的表達具有抑制作用。

綜上所述，本研究觀察了喉癌組織CAFs外泌體中miR-34c-3p對喉癌干細胞樣生物學特性的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)CAFs外泌體中miR-34c-3p的低表達對于喉癌細胞干細胞樣生物學特性的維持至關重要。如果改變CAFs外泌體miR-34c-3p的低表達狀態(tài)，喉癌干細胞樣生物學特性就會受到明顯抑制，包括增殖、侵襲能力，以及無血清球體形成及平板克隆形成能力。此外，CAFs外泌體miR-34c-3p的低表達狀態(tài)還能夠直接影響喉癌細胞干細胞相關重要基因的表達水平，如OCT4、SOX2、BMI1及NANOG。這可能是CAFs外泌體miR-656-3p對喉癌細胞干細胞樣生物學特性調(diào)控的內(nèi)在分子機制，為進一步的深入研究奠定了基礎。