結(jié)直腸癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞研究進(jìn)展*

羅善山

2016 年，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率為17.4/105，位于惡性腫瘤排行榜中第2 位，死亡率為7.9/105[1]，其惡性程度高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、危害大。我國結(jié)直腸癌患者僅約11%診斷為早期，大部分患者就診時(shí)，已經(jīng)出現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及多步驟、多因素的復(fù)雜過程，具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，以極少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到血液、骨髓、淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官中，運(yùn)用常規(guī)病理檢測手段（非免疫組化和分子生物學(xué)技術(shù)等）難以發(fā)現(xiàn)，這種現(xiàn)象稱為腫瘤的微轉(zhuǎn)移[3]。腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，腫瘤細(xì)胞脫落、遷移、侵襲并進(jìn)入血液循環(huán)，為最終形成可被影像學(xué)檢測的腫瘤轉(zhuǎn)移病灶提供了基礎(chǔ)與條件。研究發(fā)現(xiàn)，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）伴隨著腫瘤發(fā)展過程并攜帶了其分子生物信息[4]。因此，隨著生物技術(shù)等方面的發(fā)展，CTCs 檢測及其與腫瘤的相關(guān)性逐漸成為臨床研究的熱點(diǎn)。本文就結(jié)直腸癌外周血CTCs 檢測、臨床意義方面進(jìn)行綜述。

1 CTCs概述

在1869 年，澳大利亞病理學(xué)家Ashworth 發(fā)現(xiàn)血液中存在一種特別的細(xì)胞，和尸檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤細(xì)胞相似，首次提出并報(bào)道了CTCs[5]。目前CTCs 的定義為：自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。進(jìn)入循環(huán)未被清除的腫瘤細(xì)胞通過遷移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶[6]。CTCs 是上皮組織來源的癌細(xì)胞，經(jīng)過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）后，具有了遷移和侵襲血管的能力，研究認(rèn)為其是導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因[7-8]；大多數(shù)CTCs 受機(jī)體微環(huán)境影響而發(fā)生凋亡，一部分到達(dá)適宜的生態(tài)部位后，會發(fā)生EMT，重新獲得腫瘤干細(xì)胞特性，并就此固定形成新的轉(zhuǎn)移病灶[9]。區(qū)別于腫瘤標(biāo)志物，CTCs 是具有腫瘤學(xué)生物活性的腫瘤細(xì)胞，其攜帶了腫瘤的所有分子生物學(xué)信息，在動態(tài)的監(jiān)測下，可直接地反映腫瘤在各個(gè)階段連續(xù)變化過程[8]。越來越多研究深入到腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制，以及生物醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)的巨大進(jìn)步，CTCs 的檢測已有較大進(jìn)展，這些檢測系統(tǒng)在可重復(fù)性、敏感性、特異性和成本控制等許多方面已取得較為理想結(jié)果，其中較為成熟應(yīng)用廣泛富集技術(shù)，可從血液樣本中富集CTCs，以及細(xì)胞計(jì)數(shù)、表型分析和單細(xì)胞分析等各種檢測，有助于發(fā)現(xiàn)提前或早期腫瘤、預(yù)測預(yù)后、選擇化療和靶向治療。

2 CTCs的檢測

目前CTCs 的檢測呈現(xiàn)手段多樣化，敏感性和特異性高效的檢測系統(tǒng)可分兩大類：基于免疫親和富集法和基于生物物理特性富集法。

2.1 基于免疫親和富集法 基于免疫親和富集法應(yīng)用比較廣泛，其中應(yīng)用最多的是免疫磁分離方法，其中有正富集為上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和負(fù)富集基于CD45。EpCAM 是陽性富集技術(shù)中使用的標(biāo)志物典型代表，具有上皮特異性，并且在大多數(shù)腫瘤中高度表達(dá)。近年來，研究者開發(fā)出許多基于EpCAM 的CTCs富集技術(shù)。其中，CellSearch 系統(tǒng)是第一個(gè)，也是唯一項(xiàng)通過美國FDA 批準(zhǔn)用于臨床的CTCs 檢測技術(shù)。其原理是采用一種涂有EpCAM 且可同鐵微粒相結(jié)合的抗體，稱為鐵磁流體，這種鐵磁流體和CTCs 中EpCAM 有極強(qiáng)的特異性結(jié)合能力，結(jié)合后使用強(qiáng)力磁體將這些CTCs 從樣本中提取出，然后使用基于4’，6-二氨基-2-苯基吲哚細(xì)胞核染色，CD45 別藻藍(lán)蛋白特異性白細(xì)胞陰性選擇和細(xì)胞角蛋白8，18，19-藻紅蛋白特異性上皮細(xì)胞陽性選擇來識別細(xì)胞，以此來計(jì)數(shù)CTCs。Balic 等[9]分別使用CellSearch 系統(tǒng)和OncoQuick 法檢測外周血中CTCs，結(jié)果顯示，OncoQuick 系統(tǒng)中61 例患者中14 例（23%）和CellSearch 系統(tǒng)中33 例（54%）中檢測到至少一種CTCs（P<0.000 1），CellSearch檢測出CTC 數(shù)量（平均20 個(gè)/7.5 mL 血液）大于OncoQuick（3 個(gè)/7.5 mL；P<0.000 1），結(jié)論認(rèn)為，使用CellSearch 系統(tǒng)檢測CTCs 更準(zhǔn)確、更靈敏。CellSearch 系統(tǒng)是目前自動化程度最高的CTCs 檢測技術(shù)，受人為因素影響較小，具有較高的特異性、敏感性及可重復(fù)性，但由于缺乏腫瘤特異性抗原，敏感度相對較低，會出現(xiàn)漏診，且檢驗(yàn)費(fèi)用較高，使其在臨床上的廣泛應(yīng)用受到一定限制。

尋找出CTCs 特異性分子標(biāo)志物，是提高CTCs檢測的有效方法。腫瘤生長速度遠(yuǎn)快于機(jī)體正常組織，快速分裂的腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)葉酸受體（FRs），以此來吸收葉酸（FA），促進(jìn)DNA 和RNA的生物合成。Zhu 等[10]使腫瘤靶向分子FA 和磁性納米顆粒分別通過疏水相互作用和化學(xué)共軛作用涂覆在紅細(xì)胞表面，后者粘附到CTCs 上，并且在磁場中分離獲得的CTC-RBC 綴合物，離心后CTCs 捕獲并計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，捕獲效率在90%以上，純度高于75%。在相同條件下，遠(yuǎn)高于基于EpCAM 的免疫磁分離技術(shù)（捕獲效率為80%，純度為20%）。即使是特異性的分子標(biāo)志物，也面臨配體表達(dá)水平異質(zhì)性不足的問題，利用抗體之間的協(xié)同作用可以提高CTC 檢測技術(shù)的靈敏度，如使用在非小細(xì)胞肺癌中基于EGFR/HER3 的富集法[11]。

2.2 基于生物物理特性富集法 基于生物物理特性的富集技術(shù)，主要利用CTCs 和血細(xì)胞在大小、變形能力、密度和電學(xué)特性方面差異，進(jìn)行離心、微濾、微流體操控、電泳等方法進(jìn)行分離和計(jì)數(shù)。這種無須抗體標(biāo)記或特殊處理的分離CTCs 方法更適用下游分析[12]。其可以捕獲在各個(gè)階段包括稀有細(xì)胞表型在內(nèi)的各種表型的CTCs，有助于確定CTCs在指導(dǎo)治療和預(yù)測預(yù)后?；诩?xì)胞大小的分離技術(shù)，主要是利用CTCs（大小為10～20 μm，變形性差）和血細(xì)胞（紅細(xì)胞8 μm；白細(xì)胞7～12 μm；可變形性好）之間的差異性，選擇合適的閾值進(jìn)行分離。Oh 等[13]使用高密度微孔芯片過濾器富集76 例結(jié)直腸癌患者和20 例健康對照受試者CTCs，結(jié)果顯示，50 例患者（陽性率為65.8%）檢測到CTCs，陽性患者與高水平癌胚抗原表達(dá)和晚期癌癥明顯相關(guān)（P=0.038、0.017）。Ⅳ期患者CTCs 計(jì)數(shù)（12.47±24.00）顯著高于Ⅰ～Ⅲ期（2.84±5.29）（P=0.005）和健康對照組（0.25±0.55）（P<0.001），結(jié)論認(rèn)為這種基于細(xì)胞大小的新檢測平臺可預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后。CTCs 的密度介于血漿和紅細(xì)胞之間，但在白細(xì)胞密度范圍內(nèi)。利用密度介質(zhì)的差異沉降系數(shù)和基于密度的梯度進(jìn)行離心，使不同密度的細(xì)胞在分離液中實(shí)現(xiàn)分層分布，實(shí)現(xiàn)CTC 的分離。Campton 等[14]利用CTC 的特定密度，使用獨(dú)特基于密度的分離裝置將有核細(xì)胞從血液中分離，將白細(xì)胞和血小板的血沉棕黃層完全分離，移位到顯微鏡載玻片染色，使用顯微鏡對載玻片進(jìn)行成像，結(jié)果顯示，懸浮腫瘤細(xì)胞的回收率為90.5%～91%。雖然該系統(tǒng)的CTC 計(jì)數(shù)能力優(yōu)于 CellSearch，但由于白細(xì)胞和CTCs 之間存在一些物理性質(zhì)的重疊，導(dǎo)致特異性差和部分CTCs 丟失。

綜上所述，基于免疫親和力或生物物理特性的CTCs 富集技術(shù)存在一定的優(yōu)勢和局限性，集成微流控裝置的出現(xiàn)很好地結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測的靈敏度和特異性。Jiang 等[15]通過確定性橫向位移（DLD）隔離結(jié)構(gòu)、帶有CD45 標(biāo)記的免疫磁珠的自動純化裝置和涂有鼠尾膠原蛋白的捕獲平臺，組合成的一個(gè)集成微流體裝置，通過從血液中捕獲綠色熒光蛋白（GFP）陽性細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者捕獲CTCs 陽性捕獲率為83.3%。該裝置與CellSearch 系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行檢測30 例腫瘤患者比較，結(jié)果顯示，兩種方法的捕獲效率之間沒有顯著差異。然而，集成微流控裝置在時(shí)間、樣本量和分析成本方面顯示出優(yōu)勢。

3 CTCs在結(jié)直腸癌中的臨床意義

研究顯示，在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中通過檢測，均發(fā)現(xiàn)了CTCs[16]。通過研究CTCs 在腫瘤病情發(fā)展過程中的變化，可能可為篩查、預(yù)后判斷、病情評估及治療反應(yīng)等方面提供預(yù)測信息。有關(guān)CellSearch 系統(tǒng)檢測結(jié)直癌患者外周血CTCs 的臨床研究，國內(nèi)外已有報(bào)道。Yang等[17]通過基于免疫親和負(fù)分離富集法檢測良性結(jié)直腸?。ńY(jié)直腸息肉）和非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者術(shù)前CTCs 發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者CTCs 計(jì)數(shù)顯著高于結(jié)直腸息肉患者（3.47±0.32）個(gè)/3.2 mL vs（1.49±0.2）個(gè)/3.2 mL（P<0.001）。Tsai 等[18]通過檢測健康對照受試者、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血CTCs，結(jié)果顯示，CTC 計(jì)數(shù)與惡化的疾病狀態(tài)緊密相關(guān)（P<0.000 1），在95%結(jié)直腸癌分期和79%腺瘤性病變中顯示出高度特異性（86%）和高度敏感性。與臨床常用檢查方法包括腸鏡檢查等比較，CTCs 檢測有著更好的依從性，但是結(jié)腸鏡檢查和活檢仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，篩查發(fā)現(xiàn)CTC陽性，可進(jìn)一步進(jìn)行內(nèi)鏡檢查和活檢確診。研究發(fā)現(xiàn)CTCs 與胃癌、小細(xì)胞肺癌、淋巴結(jié)陽性的黑色素瘤、晚期胰腺癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后密切相關(guān)[19-22]。Sastre 等[23]通過使用CellSearch系統(tǒng)檢測1 202 例結(jié)直腸癌外周血CTCs 表達(dá)，結(jié)果顯示，CTCs ≥3 個(gè)/7.5 mL 組與不良的預(yù)后因素（較差的ECOG 評分、Ⅳ期、3 個(gè)以上部位轉(zhuǎn)移、癌胚抗原水平升高）具有相關(guān)性。Huang 等[24]通過Meta 分析使用CellSearch 系統(tǒng)檢測11 項(xiàng)研究1 847 例結(jié)直腸癌患者的外周血CTCs，CTCs>5 個(gè)/7.5 mL 為陽性值，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組CTC 陽性率顯著高于無轉(zhuǎn)移組[OR=4.06，95%CI（1.74，9.50），P<0.01，I2=0%]，CTCs 陽性率與結(jié)直腸癌的總生存 率[HR=2.00，95%CI（1.49，2.69），P<0.01，I2=67.1%]和無進(jìn)展生存時(shí)間[HR=1.80，95%CI（1.5，2.13），P<0.01，I2=43.9%]明顯相關(guān)。Krebs 等[25]使用CellSearch 系統(tǒng)檢測48 例使用高強(qiáng)度化療方案卡培他濱、奧沙利鉑+/-伊立替康聯(lián)合貝伐單抗+/-西妥昔單抗治療結(jié)直腸癌病例的外周血CTCs，結(jié)果顯示，CTCs ≥3 個(gè)/7.5 mL 和CTCs<3 個(gè)/7.5 mL患者平均總生存時(shí)間分別為18.7 個(gè)月和22.3 個(gè)月（P=0.038），結(jié)論認(rèn)為，通過CTCs 計(jì)數(shù)分層可以篩選出可能從強(qiáng)化治療方案中受益的患者，避免低CTCs 組使用高毒性方案。同樣地，Aranda等[26]分析349 例使用卡培他濱和奧沙利鉑+/-伊立替康聯(lián)合貝伐單抗一線治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌外周血CTCs ≥3 個(gè)/7.5 mL 病例，結(jié)果顯示，卡培他濱、奧沙利鉑和伊立替康聯(lián)合貝伐單抗組患者和卡培他濱和奧沙利鉑聯(lián)合貝伐單抗中位無進(jìn)展生存時(shí)間分別為12.4 個(gè)月[95%CI（11.2，4.0）]和9.3 個(gè)月[95%CI（8.5，10.7）]，HR=0.64[95%CI（0.49，0.82），P=0.000 6]，結(jié)論認(rèn)為，通過CTCs 計(jì)數(shù)分層可以有助于高強(qiáng)度化療方案的選擇。Yang 等[27]通過動態(tài)監(jiān)測138 例結(jié)直腸癌根治術(shù)患者的CTCs，結(jié)果顯示，術(shù)前和術(shù)后CTCs 陽性患者3 年復(fù)發(fā)率（53.8%）比術(shù)前CTCs 陽性但術(shù)后陰性患者（78.9%）低25.1%（P=0.004），結(jié)論認(rèn)為術(shù)后CTCs 陽性根治性術(shù)患者是復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素。動態(tài)監(jiān)測CTCs 可用于評估指導(dǎo)風(fēng)險(xiǎn)調(diào)整和個(gè)體化診治。Tan等[28]使用基于細(xì)胞大小的生物物理特性富集法在化療過程中動態(tài)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血CTCs，CTC 計(jì)數(shù)趨勢與影像學(xué)測量定義的疾病進(jìn)展和癌胚抗原（CEA）水平趨勢呈正相關(guān)，并且CTCs 的變化更為敏感，提示可用于監(jiān)測治療期間對化療和疾病進(jìn)展/緩解的反應(yīng)。

結(jié)直腸癌惡性程度高、異質(zhì)性大、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高。不同患者對治療的反應(yīng)及預(yù)后相差巨大，使用單一的預(yù)測因子難以評估全部的治療效果和預(yù)后。盡管CTC 檢測作為結(jié)直腸癌判斷預(yù)后和治療選擇有用標(biāo)志物已引起廣泛關(guān)注，由于缺乏用于評估癌癥預(yù)后和進(jìn)展的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和臨界值，仍難入進(jìn)入廣泛的臨床應(yīng)用。外周血CTCs 是否比傳統(tǒng)的影像學(xué)等更早地準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤的進(jìn)展或緩解？諸如此類問題還需要更多的研究揭示。