壯藥補肺消積飲顆粒的制備工藝及薄層色譜鑒別

洪曉華　莫春梅 王同彪 榮 震　

壯藥補肺消積飲顆粒的制備工藝及薄層色譜鑒別

洪曉華1莫春梅2王同彪3榮 震2

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530000；2.深圳寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 518000； 3.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530000）

目的：依據(jù)因素選擇和正交實驗優(yōu)選出壯藥補肺消積飲顆粒的最佳提取、濃縮、干燥和成型工藝，為制備壯藥補肺消積飲顆粒、研究其質(zhì)量標準給予指導。方法：以主母藥半枝蓮中野黃芩苷含量和總干膏為綜合評價指標，優(yōu)化該制劑的制備工藝；同時對黃芪、白花蛇舌草、三七、半枝蓮開展薄層色譜（TLC）鑒別。結果：壯藥補肺消積飲的最佳水提工藝參數(shù)建議為10倍量水煎煮該復方十二味中藥材，提取1 h×2次；提取液濃縮在70℃條件下的最優(yōu)相對密度是1.30～1.32，最佳干燥工藝為在70℃下干燥2 h，干燥至含水量6%以下；最優(yōu)成型工藝為加入輔料混合比例為2∶1糊精與羧甲淀粉鈉，稠膏與輔料比例為1∶1.4。經(jīng)質(zhì)量標準初步研究，薄層色譜中能鑒定出白花蛇舌草、半枝蓮、三七和黃芪。結論：該生產(chǎn)工藝科學穩(wěn)定、規(guī)范合理、成品率好且質(zhì)量可控，所得的工藝參數(shù)可為壯藥補肺消積飲顆粒的生產(chǎn)提供參考，適合醫(yī)藥企業(yè)放大生產(chǎn)。

補肺消積飲顆粒；正交設計；制備工藝；薄層色譜；質(zhì)量標準；含量測定

引言

肺癌（Lung Neoplasms，LN）是一種復雜的惡性疾病，具有多組織學和多分子類型，其位列全球癌癥死亡主要原因的榜首[1,2]。此外，該病“雙率”（發(fā)生率與病死率）在我國惡性腫瘤中也皆位列第一[3]。經(jīng)流行病學證實，LN病人以NSCLC（非小細胞肺癌）為主，同時肺腺癌是最常見的亞型[4,5]。當前對于LN的治療，多采用切除、化療、放療、靶向治療和免疫治療等聯(lián)合使用，治療效果及患者生存期較前獲益，但現(xiàn)代各治療藥物所帶來的近、遠期毒副作用及易產(chǎn)生耐藥性的問題仍較為顯著[6]。壯藥補肺消積飲是我國首批桂派中醫(yī)大師、名老中醫(yī)榮遠明教授的經(jīng)驗方，前期研究[7-10]發(fā)現(xiàn)，壯藥補肺消積飲聯(lián)合化療或靶向治療中晚期肺腺癌時具有增效減毒、干預腫瘤免疫逃逸、降低腫瘤標志物表達、延長總生存期（Overall survival，OS）和無進展生存期（Progression-free survival，PFS）的作用，患者取得較好的臨床獲益。壯藥補肺消積飲針對LN整體屬虛，局部屬實，因?qū)嵵绿?，因虛而實，實則不外噓（氣）滯、勒（血）瘀、熱毒、痰濁數(shù)端的病機，方中主母藥白花蛇舌草解熱毒、除濕毒、除瘀血、通龍路；半枝蓮清熱解毒；主公藥黃芪補虛健體；母幫藥莪術、三七通龍路，除瘀血；麥冬補虛健體；公幫藥五味子補虛生津、收斂固澀；公引藥紫菀、浙貝母、款冬花通氣道，止咳嗽；桑白皮解毒清肺、通氣道、通水道；母引藥鱉甲祛瘀軟堅散結。該方補虛祛邪，暢通三道兩路，使三氣同步，陰陽調(diào)和，諸證得平。為克服湯劑煎煮、攜帶的不便，故以主母藥半枝蓮的主要成分野黃芩苷的含量輔以水提物總干膏作為主要指標，對驗方壯藥補肺消積飲制備顆粒制劑的工藝及質(zhì)量標準進行初步探究。

1 實驗部分

1.1 藥材與試劑

壯藥補肺消積飲中的十二味中藥材（包含有白花蛇舌草、半枝蓮、三七等），經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院鑒定，白花蛇舌草符合《廣西中藥材標準》（1996年版）項下有關規(guī)定，另含黃芪、三七與半枝蓮等在內(nèi)的十一味中藥材同2015版《中華人民共和國藥典》項下的相關標準相符。

1.2 方法與結果

1.2.1 工藝研究

工藝流程圖如圖1所示。

圖1 工藝流程圖

1.2.2 正交實驗因素水平選擇

由于壯藥補肺消積飲為榮遠明教授的臨床驗方，傳統(tǒng)使用方法為水煎煮后患者口服藥液，為不影響壯藥補肺消積飲原湯劑的療效，故壯藥補肺消積飲的提取方式選用水煎煮法。根據(jù)中藥制劑的常規(guī)方法及生產(chǎn)實際情況的經(jīng)驗，選出同煎煮提取率有關的3項關鍵因素：煎煮時間（A）、煎煮次數(shù)（B）和加水倍量（C），每個因素各選三個水平進行考察，因素水平選擇見表1。

表1 正交因素水平表

1.2.3 正交實驗的結果

進行壯藥補肺消積飲的水提L9（34）正交實驗，按配方比例，稱取藥材9份，每份396 g，安排9次正交實驗，合并水煮液，濃縮定溶200 mL，制成1～9樣品溶液，作為供試溶液。在測定總干膏方面，先準確吸量25 mL供試溶液，放于蒸發(fā)皿（已干燥恒重）里，再實施水溶蒸干操作，之后于105℃下對殘渣實施180 min干燥處理，接著移至干燥器里，冷卻0.5 h，再馬上稱量，同時對各實驗點得分展開求解。野黃芩苷含量的測量是用液相色譜測定上述9個樣品的野黃芩苷含量，單位為mg/mL，計算各實驗點的得分。運用綜合評分法進行評價，采取正交實驗，涉及的指標包括野黃芩苷含量、總干膏，綜合評分=（野黃芩苷含量/野黃芩苷量的最大值）×0.5＋（總干膏/總干膏最高值）×0.5。并對統(tǒng)計結果實施方差分析（ANOVA），結果顯示A、C因素具有顯著性，結合客觀情況、節(jié)能減成本等情況，綜合分析的結果顯示，A2B2C2為最優(yōu)組合，即煎煮60 min，實施兩遍煎煮，加入10倍水量。結果如表2、表3所示。

表2 正交實驗的方差分析

注：F1-0.05(2,2)=19.00 , F1-0.01(2,2)=99.00

表3 水提L9（34）正交實驗的設計與結果

1.2.4 驗證試驗

根據(jù)壯藥補肺消積飲正交實驗結果，對上環(huán)節(jié)確定的最優(yōu)水提工藝（A2B2C2）開展兩組驗證試驗，分別對野黃芩苷的含量與總干膏實施測定。兩次試驗中野黃芩苷含量和總干膏穩(wěn)定在較優(yōu)水平，野黃芩苷含量均值是0.216 mg/mL，平均總干膏為32.55%，提示本水提工藝穩(wěn)定可行，可見A2B2C2為最適提取工藝，即此中藥方劑的12味藥材，加10倍水量，煎煮提取次數(shù)為兩次，單次用時是1 h。結果表4所示。

表4 驗證實驗結果

1.2.5 提取液濃縮試驗

合格顆粒的制成，要求提取液濃縮所得的稠膏含水量須在一定范圍內(nèi)，經(jīng)試驗，稠膏濃縮至相對密度1.30～1.32（70℃）與輔料混勻制粒，制粒效果較好，故壯藥補肺消積飲顆粒提取液濃縮的最佳相對密度為1.30～1.32（70℃）。

1.2.6 顆粒劑成型工藝試驗

由于本方提取液濃縮所得的稠膏粘性較大，若單獨使用糊精作為輔料，所制顆粒易出現(xiàn)溶化性不合格的情況。經(jīng)試驗得出使用糊精與羧甲淀粉鈉（2∶1）混合后再與稠膏制粒效果最佳。確定糊精、羧甲淀粉鈉作為輔料后，為便于生產(chǎn)操作及確保顆粒成型和成品率，故對糊精、羧甲淀粉鈉的用量進行比較試驗，取濃縮得到的稠膏按不同比例加入糊精、羧甲淀粉鈉進行混合制粒，根據(jù)成型難易程度及成品率，確定糊精、羧甲淀粉鈉用量。從試驗結果（見表5）可知，稠膏與輔料比例為1∶1.4時，混合、制粒、成品率均良好。干燥工藝為濕顆粒在70℃下干燥2小時，而后過14目篩整粒，干燥至含水量6%以下。

表5 成型工藝考察結果

1.2.7 穩(wěn)定性試驗

取三批壯藥補肺消積飲顆粒試驗樣品（批號：180606、180613、180620）開展長期、加速這兩項穩(wěn)定性試驗。將上述三批樣品在臨床用藥品包裝條件下，分別置于室溫貯藏的條件下和置于穩(wěn)定性試驗箱中（條件為：75%±5%的相對濕度，40±2℃的溫度），除當月（0月）考核一次外，連續(xù)三個月和第六月各考核一次。經(jīng)連續(xù)考核六個月，并觀察直接與藥品接觸的包裝材料對藥品穩(wěn)定性的影響。結果顯示，三批壯藥補肺消積飲顆粒試驗樣品無論在性狀、鑒別、檢查和含量測定方面均符合規(guī)定，此外微生物限度測試報告也表明同要求相符。本次試驗的結果表明：壯藥補肺消積飲顆粒在臨床用藥品包裝條件下，兩年內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.8 白花蛇舌草、半枝蓮、三七、黃芪的薄層色譜鑒別白花蛇舌草、半枝蓮、三七、黃芪的薄層色譜鑒別[11-13]如下。

1.2.8.1 白花蛇舌草溶液的制作

（1）供試品溶液：備10 g供試品，同時研細，再添加30 mL甲醇（MT），實施0.5 h超聲處理，待液體溫度降至室溫，再濾過，接著蒸濾液達近干狀態(tài)，將2 g中性氧化鋁（Al2O3）放到殘渣內(nèi)拌勻，繼續(xù)將其干燥。把已干燥的移至中性Al2O3柱（5 g，100至200目，內(nèi)徑1 cm）上，運用20 mL的MT進行洗脫，而后棄去；然后再次洗脫時使用20 mL50%MT，收集并蒸干洗脫液，用1 mL的MT溶解，得到供試品溶液。（2）陰性對照溶液：陰性樣品取10 g，并研細（無白花蛇舌草成分），參照以上步驟完成陰性對照液的制備。（3）對照藥材溶液：備對照藥材百花蛇草1 g，同時研細，參照上述操作完成對照藥材溶液的制備。參考2015版《中國藥典》四部（通則0502），實施TLC試驗，吸取上述（1）（2）（3）步驟的溶液各0.01 mL，同時皆滴加于同一張含CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）黏合劑的硅膠G薄層板上，把2∶4∶2∶0.5的PE（石油醚）- TL（甲苯）- EAC（乙酸乙酯）-MT作為展開劑，展開后再取出晾干，之后向板上噴涂硫酸（H2SO4）乙醇溶液（10%），再置于105℃條件下，待呈現(xiàn)清晰斑點停止加熱。在紫外燈波長為365 nm時，檢視供試品色譜。結果發(fā)現(xiàn)在和對照品色譜相對區(qū)域，有相同顏色的熒光斑點顯現(xiàn)，陰性未見干擾，如圖2所示。

注：1～3：供試樣品（20180806、20180813、20180820）；4：白花蛇舌草對照藥材；5：陰性對照。

1.2.8.2 半枝蓮溶液的制作

（1）供試品溶液：供試品取10 g，并研細，再添加30 mL的MT，同時實施0.5 h超聲處理，待液體降至室溫，之后濾過，再將濾液蒸干，通過20 mL水對殘渣進行溶解，并通過20 mL水飽和NBA（正丁醇）實施2遍振搖提取操作，將溶液統(tǒng)一起來，并蒸干，用1 mL的MT對殘渣進行溶解，此即供試品溶液。（2）陰性對照溶液及（3）對照藥材溶液與1.2.7.1法同。參考2015版《中國藥典》四部（通則0502），實施TLC試驗，吸量以上（1）（2）（3）溶液皆0.01 mL，同時皆滴加于同一張含CMC-Na黏合劑的硅膠G薄層板上，將比值為5∶4∶1∶0.2的TL- EAC-MT-甲酸當做展開劑，展開后再取出晾干，之后向板上噴涂AlCl3（三氯化鋁）乙醇溶液（5%），吹熱風顯示清晰斑點為止。在紫外燈波長為365 nm時，檢視供試品色譜。發(fā)現(xiàn)在和對照品色譜相對區(qū)域，有相同顏色的熒光斑點顯現(xiàn)，陰性未見干擾，如圖3所示。

注：1～3：供試樣品（20180806、20180813、20180820）；4：半枝蓮對照藥材；5：陰性對照。

1.2.8.3 三七溶液的制作

（1）供試品溶液：供試品取10 g，并研細，再添加30 mL的MT，同時實施0.5 h超聲處理，待液體降至室溫，濾過，接著蒸濾液為近干狀態(tài)，取2 g中性Al2O3放入殘渣內(nèi)拌勻，繼續(xù)將其干燥。之后移至中性Al2O3柱（1 cm內(nèi)徑，5 g，100至200目）上，洗脫時是使用20 mL的MT來進行，而后棄去；然后在洗脫時是使用20 mL的50%MT來進行，收集并蒸干洗脫液，用1 mL的MT溶解，得到供試品溶液。（2）陰性對照溶液及（3）對照藥材溶液與1.2.8.1法同。參考2015版《中國藥典》四部（通則0502），實施TLC試驗，吸量以上（1）（2）（3）溶液皆0.01 mL，同時皆滴加于同一張含CMC-Na黏合劑的硅膠G薄層板上，將比值為4∶4∶1.5的TL- EAC-MT當做展開劑，展開后再取出晾干，之后向板上噴涂H2SO4乙醇溶液（10%），吹熱風顯示清晰斑點為止。在紫外燈波長為365 nm時，檢視供試品色譜。結果發(fā)現(xiàn)在和對照品色譜相對區(qū)域，有相同顏色的熒光斑點顯現(xiàn)，陰性未見干擾，如圖4所示。

注：1～3：供試樣品（20180806、20180813、20180820）；4：三七對照藥材；5：陰性對照。

1.2.8.4 黃芪溶液的制作

（1）供試品溶液：供試品取10 g，并研細，添加30 mL的MT，同時實施0.5 h超聲處理，待溫度下降至室溫水平，再濾過，接著蒸濾液為近干狀態(tài)，將2 g中性Al2O3放到殘渣內(nèi)，并拌勻，繼續(xù)將其干燥。之后移至中性Al2O3柱（1 cm內(nèi)徑，5 g，100至200目）上，洗脫時是通過使用20 mL的MT進行，而后棄去；然后在此洗脫的時候使用20 mL的50%MT來進行，收集并蒸干洗脫液，用1 mL的MT溶解，得到供試品溶液。（2）陰性對照溶液及（3）對照藥材溶液與1.2.7.1法同。參考2015版《中國藥典》四部（通則0502），實施TLC試驗，吸量以上（1）（2）（3）步驟的溶液皆0.01 mL，同時皆滴加于同一張含CMC-Na黏合劑的硅膠G薄層板上，將比值為10∶1的三氯甲烷-MT作為展開劑，展開后再取出晾干，之后通過氨蒸氣，實施熏蒸顯色操作。在紫外燈波長為365 nm時，檢視供試品色譜。發(fā)現(xiàn)在和對照品色譜相對區(qū)域，有相同顏色的熒光斑點顯現(xiàn)，陰性未見干擾，如圖5所示。

注：1～3：供試樣品（20180806、20180813、20180820）；4：黃芪對照藥材；5：陰性對照。

2 討論

本研究通過因素水平選擇，確定了影響壯藥補肺消積飲顆粒水提效率的三個主要因素為煎煮時間、煎煮次數(shù)和加水倍量，并對該三個主要因素進行水提L9（34）正交實驗。根據(jù)實驗結果并結合實際情況及節(jié)能降成本等情況綜合考慮，確立了壯藥補肺消積飲顆粒的最佳水提工藝為A2B2C2，并進一步實施驗證實驗，證實此水提工藝具備可行性與穩(wěn)定性，重復性較好。其次考察了壯藥補肺消積飲提取液的濃縮工藝，得出了壯藥補肺消積飲顆粒提取液濃縮的最佳相對密度。最后對壯藥補肺消積飲顆粒的成型工藝進行了考察，得出輔料糊精與羧甲淀粉鈉混合比例為2∶1，此輔料比例與壯藥補肺消積飲稠膏制粒效果最佳，同時稠膏與輔料比例須為1∶1.4，此藥輔比例下混合性良好，所得的顆粒成品率高。本研究首次研制壯藥補肺消積飲顆粒，初步完成了此中藥制劑的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量標準的建立，優(yōu)化了該顆粒的制備工藝，提出了本方中特殊成分野黃芩苷的測定方法，進行方法學考察且符合相關標準。

3 結束語

本研究結果為測定壯藥補肺消積飲顆粒中野黃芩苷的含量提供了理論基礎。在本研究過程中，依托現(xiàn)代技術對黃芪、白花蛇舌草、三七、半枝蓮實施TLC鑒別，專屬性較強，對此中藥制劑的品質(zhì)能夠做到有效控制。此外，該顆粒穩(wěn)定性好，各項檢測均符合規(guī)定，為治療肺癌開發(fā)療效好、安全性高的中藥復方顆粒制劑提供了可靠的保證。

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Preparation Technology and Thin Layer Chromatography Identification of Zhuang Medicine Bufei Xiaojiyin Granules

Objective: According to factor selection and orthogonal experiment, the optimal extraction, concentration, drying and molding process of Zhuang medicine Bufei Xiaojyin granules were optimized, which provided guidance for the preparation of Zhuang edicine Bufei Xiaojyin granules and the study of its quality standard. Methods: Taking the content of scutellarin in Scutellaria barbata and total dry ointment as comprehensive evaluation indexes, the preparation process of the preparation was optimized; Meanwhile, Astragalus membranaceus, Hedyotis diffusa, Panax notoginseng and Scutellaria barbata were identified by thin layer chromatography (TLC). Results: The optimal water extraction parameters of Zhuang medicine Bufei Xiaojiyin is recommended to decoct the compound twelve-flavored Chinese medicines with 10 times the amount of water and extract them for 1h×2 times; the optimum relative density of the cextract concentrated at 70℃ is 1.30 to 1.32. The optimum drying process is to dry at 70℃ for 2 hours, drying to moisture content below 6%; the optimum molding process is to add excipients in a mixture ratio of 2∶1 dextrin and sodium starch glycolate, thick paste and the proportion of accessories is 1∶1.4. Preliminary research on quality standards showed that Oldenlandia diffusa, Scutellaria barbata, Panax notoginseng and Astragalus could be identified by thin layer chromatography. Conclusion: The process parameters optimized in this study can provide reference for the production of Zhuang medicine Bufei Xiaojiyin granules. The production process is scientific and stable, standardized and reasonable, with good yield and controllable quality, which is suitable for scale-up production of pharmaceutical companies.

Bufei Xiaojiyin granules; orthogonal design; preparation technology; thin layer chromatography; quality standard; content determination

R283; R29

A

1008-1151(2022)01-0048-05

2021-09-27

國家自然科學基金（81660774）；廣西自然科學基金面上項目（2020GXNSFAA238011）；廣西壯族自治區(qū)科技廳重點研發(fā)計劃項目（桂科AB17195067）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（YCBZ2021077）；廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目（2021KY0310）；國家中醫(yī)藥管理局榮遠明老中醫(yī)藥專家學術經(jīng)驗傳承工作室項目[2011]41號。

洪曉華（1992－），女，廣東中山人，廣西中醫(yī)藥大學在讀博士研究生，從事中醫(yī)藥防治惡性腫瘤。

榮震（1971－），男，廣西融安人，深圳寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院教授，博士研究生導師，從事中醫(yī)藥防治惡性腫瘤。