蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

歐志敏,馬 蘭

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

歐志敏,馬 蘭

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

對(duì)蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusCGMCC No.12336發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了研究.分別測定了B.cereusCGMCC No.12336發(fā)酵過程中菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度、脂肪酶的活性濃度和還原糖的質(zhì)量濃度,運(yùn)用Logistic, Luedeking-Piret等方程對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了非線性擬合,闡明了B.cereusCGMCC No.12336分批發(fā)酵過程中菌體細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型并擬合得到了動(dòng)力學(xué)參數(shù).為檢驗(yàn)動(dòng)力學(xué)模型的可靠性,對(duì)得到的模型進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.結(jié)果表明:動(dòng)力學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好,能較好地描述B.cereusCGMCC No.12336分批發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)特征.

蠟樣芽孢桿菌;脂肪酶;分批發(fā)酵;動(dòng)力學(xué)模型

微生物脂肪酶作為有機(jī)合成中一種重要的生物催化劑,可以用來催化水解、氨解和醇解等反應(yīng)[1],且具有區(qū)域選擇性、底物專一性、成本低、反應(yīng)條件溫和[2]、環(huán)境友好、對(duì)映選擇性高以及不需要輔酶等優(yōu)點(diǎn)[3],在手性藥物的合成、生物傳感器和食品加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[4].來源于微生物的脂肪酶一般為胞外酶,并且具有相對(duì)比較廣泛的溫度和pH作用范圍[5],因此微生物脂肪酶更適用于工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用,隨著非水相酶學(xué)、固定化技術(shù)[6]和界面酶學(xué)等生物技術(shù)的發(fā)展[7],微生物脂肪酶被越來越廣泛地應(yīng)用.目前對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的研究多在菌種篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化和脂肪酶的分離純化等方面,而對(duì)脂肪酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究較少.

以從土壤中篩選到的B.cereusCGMCC No.12336作為出發(fā)菌株,在優(yōu)化該菌株發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上,研究其動(dòng)力學(xué)特征.運(yùn)用Logistic,Luedeking-Piret等方程,用軟件模擬動(dòng)力學(xué)方程,獲得了菌體細(xì)胞生長、脂肪酶的生成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù),為以后放大實(shí)驗(yàn)、工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)化與控制提供了可靠的實(shí)踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)[8].

1 材料與方法

1.1 菌 種

浙江工業(yè)大學(xué)校園土壤中篩選得到的B.cereusCGMCC No.12336,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心.

1.2 材 料

斜面固體培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨2,葡萄糖9,瓊脂20.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):酵母粉5,蛋白胨2,氯化鈉2,硫酸鎂0.5,葡萄糖9,磷酸二氫鉀2,磷酸氫二鉀2.

主要化學(xué)試劑:(R)-(-)-扁桃酸、(R)-(-)-扁桃酸乙酯,上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司.

1.3 培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng):250 mL的錐形瓶中含有發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,培養(yǎng)獲得的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種至錐形瓶中,然后置于溫度30 ℃和轉(zhuǎn)速180 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)38 h.

1.4 分析方法

1) 菌體質(zhì)量濃度的測定:發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min,離心得到的濕菌體用蒸餾水洗兩次,然后置于已稱重的坩堝中,于80 ℃的恒溫干燥箱中烘干至恒重,稱重[9].細(xì)胞質(zhì)量濃度以細(xì)胞干重計(jì)算.

2) 酶活測定:取1 mL發(fā)酵液,加入20 mmol/L(R)-(-)-扁桃酸乙酯,于30 ℃,180 r/min恒溫?fù)u床上反應(yīng)4 h后,高效液相色譜(HPLC)分析測定其轉(zhuǎn)化率[10].色譜條件為:色譜柱是反相C18柱(0.46 mm×250 mm),流動(dòng)相是由水(含有3.0 mmol/L CuSO4和6.0 mmol/L L-苯丙氨酸)和甲醇構(gòu)成,體積比為90∶10,流速是0.5 mL/min,UV檢測波長是300 nm[11].本研究中單位酶活定義為每小時(shí)轉(zhuǎn)化1 mmol(R)-(-)-扁桃酸乙酯生成相應(yīng)的(R)-(-)-扁桃酸所需要的酶量為l U.

3) 還原糖含量測定:DNS法[12].

4) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得:搖瓶中發(fā)酵培養(yǎng)B.cereusCGMCC No.12336,每2 h取一次樣,測定菌體細(xì)胞干重、脂肪酶活性濃度和還原糖質(zhì)量濃度在不同時(shí)間段的數(shù)據(jù),每組都做3次平行實(shí)驗(yàn),求平均值.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合,得出發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型及動(dòng)力學(xué)參數(shù)[13].

1.6.1 菌體生長模型

用Monod方程可以描述菌體細(xì)胞的生長,但Monod方程所描述的是均衡生長的模型,實(shí)際上分批發(fā)酵的過程比較復(fù)雜,不能將菌體質(zhì)量濃度及底物對(duì)生長的限制忽略,所以菌體細(xì)胞生長模型用Monod方程來表述并不適合[14].在發(fā)酵過程中,隨著菌體質(zhì)量濃度的不斷增加,會(huì)抑制菌體細(xì)胞的生長,對(duì)此有較好描述的是Logistic方程[15],所以擬合菌體細(xì)胞生長過程使用的是Logistic方程[16].Logistic方程為

(1)

以t=0時(shí),X=X0為初始條件,式(1)積分后,可得

(2)

式中:X為細(xì)胞質(zhì)量濃度(干重);X0為初始細(xì)胞質(zhì)量濃度(干重);Xm為最大細(xì)胞質(zhì)量濃度(干重);μm為最大比生長速率;t為發(fā)酵時(shí)間.

求得參數(shù)X0,Xm,μm值即可完成上述模型.

1.6.2 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

在發(fā)酵過程中,基于菌體生長與產(chǎn)物生成的關(guān)系,Gaden將產(chǎn)物的生成分為三類[17]:1) 產(chǎn)物的生成和菌體細(xì)胞的生長是相耦聯(lián)的,即兩者之間存在直接相關(guān)的關(guān)系;2) 產(chǎn)物的生成和菌體細(xì)胞生長的關(guān)系是部分耦聯(lián)的,即兩者存在的僅僅是間接的關(guān)系;3) 產(chǎn)物的生成與菌體細(xì)胞的生長無聯(lián)系,即兩者不相關(guān).從圖1中得出:脂肪酶的活性濃度是隨著菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度的增加而增加的,但在發(fā)酵末期菌體細(xì)胞的生長進(jìn)入了穩(wěn)定期,菌體細(xì)胞的質(zhì)量濃度基本上是不變的,但脂肪酶活性濃度還是在繼續(xù)上升的,由此可以得出脂肪酶的產(chǎn)生過程是生長部分耦聯(lián)型.

Leudeking-Piret方程用來表述產(chǎn)物合成過程[18],即

不良“校園貸”：以獲取高額回報(bào)為目的，通過采取不實(shí)宣傳或惡意隱瞞真實(shí)利率和資費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)、放寬貸款標(biāo)準(zhǔn)等手段，誘導(dǎo)學(xué)生貸款，并用暴力、非法手段催款的“校園貸”。

(3)

式中:α≠0,β≠0表示的是生長部分耦聯(lián);α≠0,β=0表示的是生長耦聯(lián);α=0,β≠0表示的是非生長耦聯(lián).

將式(1)代入式(3),以t=0時(shí),P=0為初始條件,積分后得

(4)

式中:α是和生長有關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù);β是和生長無關(guān)的產(chǎn)物合成參數(shù).

求參數(shù)α,β的值即可建立產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型.

1.6.3 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型

在分批發(fā)酵過程中,底物為葡萄糖,主要用于菌體細(xì)胞的生長,菌體細(xì)胞維持生命的能量消耗和產(chǎn)物的合成[19].由于產(chǎn)物的合成與菌體生長存在關(guān)系是呈部分相關(guān)的,因此可以使用類似于Leudeking-Piret的方程來表述基質(zhì)消耗的模型[20],即

(5)

分批發(fā)酵過程中,由于產(chǎn)物的生成和菌體細(xì)胞的生長是部分相關(guān)的關(guān)系,即底物的消耗和產(chǎn)物的生成相關(guān)關(guān)系是間接的,因此可以假設(shè)很小的一部分基質(zhì)是用于產(chǎn)物合成的,是可以忽略的,即葡萄糖主要用于菌體細(xì)胞代謝的維持和菌體細(xì)胞生長[21].式(5)可以寫為

(6)

將式(1)代入式(6)積分后得

(7)

式中:S為基質(zhì)質(zhì)量濃度;S0為發(fā)酵初始葡萄糖質(zhì)量濃度;m為細(xì)胞的維持系數(shù);YX/S表示菌體對(duì)底物的得率系數(shù);YP/S表示產(chǎn)物對(duì)底物的得率系數(shù).

求得參數(shù)S0,YX/S,m的值即建立基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型.

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酶發(fā)酵過程代謝變化特征

由圖1可知:0～6 h是菌體細(xì)胞生長的適應(yīng)階段,菌體生長緩慢,耗糖量較少,脂肪酶活性濃度也很低;6～18 h菌體細(xì)胞快速增長,菌體生長處于對(duì)數(shù)生長期,耗糖量明顯上升,脂肪酶活性濃度也隨著菌體量增加而快速上升;18～30 h菌體量繼續(xù)增加,并在30 h時(shí)達(dá)到最高值5.21 g/L,發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度下降減慢且處于較低水平,但脂肪酶活性濃度持續(xù)增加;30 h后細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期,發(fā)酵液中菌體和葡萄糖質(zhì)量濃度幾乎不變,但脂肪酶活性濃度還繼續(xù)升高,于38 h達(dá)到峰值為767 U/L.并由圖可知：細(xì)胞生長曲線大致為S形,葡萄糖消耗曲線則是反S形,脂肪酶的合成與菌體細(xì)胞的生長呈部分耦聯(lián)的關(guān)系.

圖1 B. cereus CGMCC No.12336發(fā)酵過程曲線Fig.1 Process curve of batch fermentation of B. cereus CGMCC No.12336

2.2 菌體生長動(dòng)力學(xué)模型

在菌體細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)研究過程中發(fā)現(xiàn),菌體細(xì)胞在經(jīng)過短暫的遲緩期后,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,之后趨于穩(wěn)定(圖1).用Logistic方程描述菌體細(xì)胞生長過程,用origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合,得到了模型和參數(shù)值(表1).圖2為菌體生長動(dòng)力學(xué)模型擬合結(jié)果(R2=0.994),由擬合結(jié)果可知：B.cereusCGMCC No.12336的生長發(fā)酵過程可以用該模型進(jìn)行較好地表述[22],即

(8)

菌體細(xì)胞生長速率模型為

(9)

圖2 菌體生長擬合曲線Fig.2 Fitted curves of cell growth

2.3 脂肪酶合成動(dòng)力學(xué)模型

脂肪酶合成過程用Leudeking-Piret方程來描述,使用origin軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合,得到了模型和參數(shù)值(表1).圖3為產(chǎn)物合成模型擬合結(jié)果(R2=0.998),由此可知模型能較好地描述產(chǎn)物合成過程,即

(10)

脂肪酶合成速率模型為

(11)

圖3 產(chǎn)物生成擬合曲線Fig.3 Fitted curves of lipase formation

2.4 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型

在發(fā)酵過程中,葡萄糖主要用于細(xì)胞生長和代謝的維持,用origin軟件對(duì)其進(jìn)行非線性擬合,得到了模型和參數(shù)值(表1),圖4為基質(zhì)消耗模型擬合結(jié)果(R2=0.997).由此可知葡萄糖消耗情況可以用該基質(zhì)消耗模型較好地表述,即

(12)

基質(zhì)消耗速率模型為

(13)

圖4 基質(zhì)消耗擬合曲線Fig.4 Fitted curves of substrate consumption

參數(shù)X0XmμmαβS0YX/Sm模擬值0．1165．1350．304104．1561．8579．1770．6340．008

2.5 擬合曲線分析

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?在相同發(fā)酵條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),對(duì)比實(shí)驗(yàn)的平均值與模型預(yù)測值[23],表2為比較結(jié)果.由表2可以看出:實(shí)驗(yàn)平均值與模型預(yù)測值兩者之間的相對(duì)誤差大部分都是在±10%以下,但在菌體細(xì)胞生長的遲緩期、脂肪酶合成的初期和基質(zhì)消耗的末期相對(duì)誤差已大于10%,可能是因?yàn)榫w發(fā)酵過程復(fù)雜,難以控制發(fā)酵初期菌體細(xì)胞質(zhì)量濃度和發(fā)酵末期葡萄糖的質(zhì)量濃度,導(dǎo)致低濃度區(qū)域相對(duì)誤差較大,但總體上對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響不大,擬合結(jié)果較好.由驗(yàn)證結(jié)果可知,B.cereusCGMCC No.12336的分批發(fā)酵的過程能很好地用該發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型來描述.

表2 實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值的比較1)

續(xù)表2

注:1)Exp.為實(shí)驗(yàn)值;Cal.為模型預(yù)測值.

3 結(jié) 論

運(yùn)用非線性擬合得到了B.cereusCGMCC No.12336分批發(fā)酵過程中菌體細(xì)胞生長、脂肪酶的生成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型.脂肪酶發(fā)酵過程用該模型能夠較好地描述,模型的預(yù)測值能夠較好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)值.因此,該模型可以用來預(yù)測脂肪酶在發(fā)酵過程中濃度變化,優(yōu)化控制發(fā)酵過程,為進(jìn)一步放大實(shí)驗(yàn)和規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Kinetics models of batch fermentation ofBacilluscereusCGMCC No.12336 for lipase production

OU Zhimin, MA Lan

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The kinetics models for lipase batch fermentation byBacilluscereusCGMCC No.12336 were studied. During the fermentation process ofB.cereusCGMCC No.12336, cell density, lipase activity and reducing sugar content were determined, respectively. Based on the Logistic and Luedeking-Piret equation, the kinetics models of cell growth, lipase formation and substrate consumption were established by nonlinear least-squares fitting method and the kinetic parameters were obtained. The verification of the experimental results demonstrated the accuracy of the model and indicated that the kinetics models were in good agreement with the experimental data, which was used for the description of the fermentation process.

BacilluscereusCGMCC No.12336; lipase; batch fermentation; kinetics model

2016-11-14

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY15B060005)

歐志敏(1973—),女,遼寧鐵嶺人,教授,博士,研究方向?yàn)樯扑幒兔腹こ?E-mail:oozzmm@zjut.edu.cn.

TQ92

A

1674-2214(2017)01-0001-05