外周血SEPT9 基因甲基化檢測在胃癌診斷中的研究進展

趙路瑤 綜述，李慕然，劉艷迪 審校

（1.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071；2.天津市人民醫(yī)院消化科，天津 300121）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)顯示，胃癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中排名第5位，但其死亡率卻相對更高，位列第3 位[1]。目前胃癌的診斷金標準為內(nèi)鏡下活檢的病理結(jié)果，但這種方法技術(shù)復(fù)雜，受檢者依從性差，特別是對無癥狀的個體很難開展。臨床上，用于胃癌預(yù)后指標的腫瘤標志物主要有癌胚抗原（CEA）、糖類抗原CA19-9 和CA72-4，單獨診斷胃癌的敏感性為20.1%～27.6%，聯(lián)合檢測敏感性為48.2%[2]。這些檢測手段或是技術(shù)復(fù)雜，或是敏感性和特異性低，迫切需要尋找簡便易行、敏感高效的檢測手段。Septins 是一種GTP 結(jié)合蛋白，Septin 9 基因是Septin 基因家族中的一員，在結(jié)直腸癌中，SEPT9 可以作為腫瘤生物標志物來診斷疾病，同時可預(yù)測預(yù)后、復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移風(fēng)險，其價值已在臨床中得到證實[3]。由于結(jié)直腸癌和胃癌都是胃腸道腫瘤，它們都有一些分子特征，包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定、高甲基化和基因突變，SEPT9 甲基化檢測對于在胃癌中的篩查價值也逐漸引起關(guān)注[4-5]。本文對SEPT9 基因的結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)功能、致癌機制，以及檢測胃癌外周血SEPT9 基因甲基化的研究進展做一綜述。

1 Septins 家族概述

Septins 在進化和結(jié)構(gòu)上都與RAS 癌基因相關(guān)，廣泛分布于除植物外的所有真核生物中。結(jié)構(gòu)特征（圖1）為一個G 結(jié)構(gòu)域（G1 是以P-環(huán)的存在為特征，能夠與核苷酸磷酸基團相互作用，G3 和G4與GTP 結(jié)合相關(guān)），以及N 端多堿性氨基酸結(jié)構(gòu)域（polybasic domain）和C 端卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiledcoil domain）[6]。哺乳動物基因組編碼13 種不同的Septins（Septin1～12、14）。根據(jù)序列同源性和螺旋結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，可分為4 組：SEPT2（Septin 1，2，4，5）、SEPT3（Septin 3，9，12），SEPT6（Septin 6，8，10，11，14）、SEPT7[7]。不同組成員間有很強的親和力，它們通過兩個相互作用界面：G 界面和NC 界面，在折疊時相互靠近，聚合形成非極性三、六、八聚體[8]。其中由兩個Septin 2/6/7/9 復(fù)合物組成的回文八聚體是大多數(shù)哺乳動物Septin 蛋白的基本單位，可進一步聚合成更高階的結(jié)構(gòu)，如細絲、環(huán)，以及通過端端和橫向連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等[9]。

圖1 Septins 基本結(jié)構(gòu)

Septin 蛋白家族是繼微管、微絲及中間纖維蛋白后發(fā)現(xiàn)的第4 種細胞骨架成分[10]，在細胞分裂、胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運、擴散屏障、細胞周期調(diào)控與細胞凋亡、細菌-細胞間相互作用、細胞突起、溶酶體穩(wěn)態(tài)、囊泡轉(zhuǎn)運、T 細胞發(fā)育等生理過程中發(fā)揮著重要作用[11-15]。多項研究表明，Septin 表達異常與多種疾病相關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)肌肉疾病、阿爾茨海默病、生育障礙、惡性腫瘤等。在惡性腫瘤中，Septin與癌癥發(fā)生的多種機制有關(guān)，如細胞持續(xù)增殖、抗細胞凋亡、血管生成、細胞遷移和侵襲、染色體不穩(wěn)定、抗癌藥物耐藥以及癌癥相關(guān)微環(huán)境改變等[10,16-17]。

2 Septin 9 概述

2.1 Septin 9 結(jié)構(gòu)特征 Septin9 基因位于人類染色體17q25.3，包含17 個外顯子，其長度約24×103bp[18]。與家族其他成員相比，Septin9 N 端含有長的脯氨酸區(qū)域，C 端缺少卷曲結(jié)構(gòu)域。Septin9 是Septin 家族中唯一直接促進肌動蛋白聚合、交聯(lián)的成員[19]。在哺乳動物中，SEPT9 經(jīng)歷了最多的選擇性剪接，5′端產(chǎn)生6 個不同的mRNA 變異剪接體（SEPT9 v1、2、3、4、4*、5），3′端的外顯子內(nèi)部不對稱的變異剪接亦可產(chǎn)生3 種不同mRNA（SV1、2 和3），因此，SEPT9 可有18 種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，編碼包括長型（SEPT9_v1、SEPT9_v2、SEPT9_v3）、中等型（SEPT9_v4、SEPT9_v4*）和短型（SEPT9_v5）等15 種多肽[20]，造就復(fù)雜的生物學(xué)功能。

2.2 Septin9 的生物學(xué)功能 Septin9 是一種細胞周期相關(guān)蛋白。電鏡觀察表明Septin9 與F-肌動蛋白直接結(jié)合，維持肌動蛋白生長和收縮的完整性，使肌動蛋白細絲交聯(lián)，彎曲成功能結(jié)構(gòu)（如細胞運動收縮環(huán)、肌動蛋白應(yīng)力纖維、細胞突起），促進局部黏附和上皮細胞運動[19，21]。此外，Septin9 結(jié)合并捆綁微管，通過介導(dǎo)胞外囊泡復(fù)合體到中體的定位，在胞質(zhì)分裂中發(fā)揮重要作用[22]。因此，Septin9 沉默后將導(dǎo)致細胞分裂異常，最終產(chǎn)生多核細胞。研究發(fā)現(xiàn)Septin9 阻止接頭蛋白CIN85（SH3KBP1）與泛素連接酶Cb1 的結(jié)合，負向調(diào)節(jié)泛素依賴的表皮生長因子受體（EGFR）降解，從而將Septin9 的分子活性與細胞增殖聯(lián)系起來[23]。

3 Septin9 與癌癥

3.1 Septin9 與多種惡性腫瘤 Septin9 參與許多生物過程，如胞質(zhì)分裂、極化、囊泡運輸、膜重建、脫氧核糖核酸修復(fù)、細胞遷移和凋亡，在多種惡性腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Septin9 表達的改變可導(dǎo)致癌癥，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、血液系統(tǒng)腫瘤、頭頸部鱗癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等。Septin9基因的組織特異性及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可變剪接，在不同腫瘤中轉(zhuǎn)錄表達模式不同，可以是表達減少、過度表達，也可以是產(chǎn)生融合基因，最終導(dǎo)致Septin9 各亞型表達失衡。如在結(jié)腸癌中，主要為SEPT9 v2 高度甲基化[24]；在卵巢癌上皮中SEPT9 v1 和v4* 高表達[25]；在乳腺癌中SEPT9 v1 高表達，v2 低表達[26]。隨著對Septin9 功能的了解不斷深入，人們逐漸認識到Septin不同于癌基因、抑癌基因，而是屬于更廣泛的癌癥基因類別。Septin9 基因常在多種腫瘤細胞中異常表達，因此Septin9 蛋白可作為某些惡性腫瘤的早期篩查、診斷和預(yù)后的標志，并有可能成為抗癌治療的新靶點。

3.2 Septin9 致癌機制 關(guān)于SEPT9 促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制，目前研究主要有HIF-1 信號通路、c-Jun 氨基未端激酶（JNK）信號通路、Rho 信號通路、細胞分裂異常、DNA 甲基化等機制。研究表明SEPT9_i1 的前25 個氨基酸（N25）與Septin 家族的其他成員相比是獨一無二的，該N25結(jié)構(gòu)域是SEPT9_i1 激活缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的關(guān)鍵區(qū)域，SEPT 9_i1 蛋白與HIF-1α 結(jié)合可增強其轉(zhuǎn)錄活性，同時防止其由RACK1 介導(dǎo)的降解來上調(diào)HIF-1 水平，增加下游基因如血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進血管生成和腫瘤的發(fā)生[27]。在整個細胞周期，特別是在G1 期，SEPT9_v1 上調(diào)激活JNK 信號通路，提高cyclinc D1 蛋白表達水平，抑制細胞凋亡和促進細胞增殖導(dǎo)致細胞周期以更快的速度進行[28]。SEPT9 還可以通過Rho 信號通路影響細胞骨架的形成，介導(dǎo)細胞間或與細胞基質(zhì)間的黏附，進而影響腫瘤細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[29]。在細胞分裂中，胞質(zhì)分裂是有絲分裂的最后一步，涉及膜斷裂的ESCRT（endocytic sorting complex required for transport）機制，Septins 在細胞中間體形成膜結(jié)合雙環(huán)，雙環(huán)提供ESCRT-Ⅲ膜組裝位點，SEPT9 是ESCRT-Ⅲ環(huán)形成和擴張所必需的，SEPT9 通過與TSG101 相互作用，招募并組裝ESCRT-Ⅱ/-Ⅲ亞基[11]。因此，SEPT9 表達異常致使有絲分裂紡錘體缺陷和無法完成細胞分裂，進而導(dǎo)致多倍體和非整倍體。

在細胞分化過程中，通過DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA 的改變等表觀遺傳事件使得某些基因的表達發(fā)生變化。與經(jīng)典的遺傳改變不同，表觀遺傳不涉及DNA 序列的變化，是潛在的可逆和可遺傳的。其中DNA 甲基化是CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基在5′-碳位置甲基化，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶。在正常細胞中，大多數(shù)CpG 二核苷酸散在分布整個基因組中，通常是甲基化的；而一些CpG 二核苷酸聚集組成的CpG 島，極少甲基化。但在腫瘤細胞中，以整個基因組的低甲基化和啟動子CpG 島高甲基化為特點。機制在于這些CpG 島一旦發(fā)生甲基化，可抑制基因表達：一方面，DNA 甲基化改變其構(gòu)象，使其不利于結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，抑制基因表達；另一方面，甲基化的DNA 分子招募并結(jié)合甲基化CpG 結(jié)合蛋白，這些甲基化CpG 結(jié)合蛋白繼續(xù)與其他蛋白（如組蛋白脫乙酰酶）結(jié)合，最終形成致密的、不活躍的異常染色質(zhì)，從而抑制基因的表達[6]。SEPT9 基因異常甲基化導(dǎo)致基因表達異常，引起機體生理功能異常，最終誘發(fā)腫瘤。

3.3 外周血SEPT9 基因甲基化在胃癌中的臨床檢測 一項在體細胞癌變目錄（COSMIC）數(shù)據(jù)庫中搜查SEPTS 突變情況的研究表明：SEPT9 在胃癌中的突變明顯多于所有其他的SEPTS（~14%）；在前十位最常見的SEPTS 突變中，SEPT14 和SEPT9 在皮膚癌和胃癌中的頻率分別為2.56%和1.86%，位居榜首[30]。因此我們可以認為SEPT9 與胃癌關(guān)系密切。Septin 突變發(fā)生的頻率較低，甲基化頻率高。啟示檢測幾個頻繁異常甲基化區(qū)域的甲基化可能比檢測單個或少數(shù)突變標志物具有更高的靈敏度。

研究表明胃癌組織中Septin9 基因甲基化顯著高于相應(yīng)的癌旁組織[31]?？紤]到樣本獲取的便利性，檢測外周血DNA 甲基化水平無疑為無創(chuàng)胃癌檢測提供了一個新的途徑。目前對于外周血甲基化檢測的研究（表1）有：2013 年Lee 等[32]對153 例胃癌患者的外周血樣本進行研究，發(fā)現(xiàn)外周血SEPT9 甲基化檢測的敏感度為17.7%，特異度為90.6%；且外周血甲基化SEPT9 陽性患者有遠處轉(zhuǎn)移傾向，無病生存率低；另外，該研究發(fā)現(xiàn)混合型（40.0%，2/5）、腸型（23.5%，12/51）患者的外周血SEPT9 基因甲基化與彌漫型（7.3%，6/82）相比有更高的陽性率。研究肯定了血漿mSEPT9 檢測在胃癌中的價值，特別是在腸道、混合型、Ⅳ期胃癌患者中。2017 年Song 等[3]使用Epi proColon 2.0 血液檢測試劑檢測胃癌患者外周血，發(fā)現(xiàn)49.4%（44/89）胃癌陽性。同樣地，2018 年Fu 等[33]研究血漿mSEPT9 對結(jié)直腸癌診斷價值時同樣發(fā)現(xiàn)70%（7/10）胃癌患者血漿mSEPT9 陽性。

表1 胃癌患者外周血SEPT9 基因甲基化檢測實驗研究

2019 年曹長琦等[34]通過對74 例早期胃癌（EGC）患者血漿進行Septin 9、RNF180 甲基化檢測發(fā)現(xiàn)：SEPT9 甲基化對EGC 的敏感度為28.3%，特異度為94.2%；在此基礎(chǔ)上比較了與傳統(tǒng)腫瘤標志物檢測的差別，并得出結(jié)論：聯(lián)合檢測SEPT9 與RNF180陽性率最高，其次依次為RNF180、SEPT9、CA724、CA125、CEA、CA199。另外，RNF180/Sptin9 基因甲基化檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）的臨床試驗證實，該試劑盒檢測胃癌的靈敏度為61.76%（420/680），特異性為85.07%（456/536）。分期靈敏性為Ⅰ期50.00%，Ⅱ期62.32%，Ⅲ期67.68%，Ⅳ期82.00%，分期不明為55.88%。2020 年Song 等[35]分析239 例胃癌患者血漿Septin9 基因甲基化水平時，發(fā)現(xiàn)其對胃癌的敏感度為47.7%，特異度為92.5%，而當(dāng)mSEPT9 與CA724 結(jié)合時，敏感度提高到63.6%，特異度為91.1%，研究還證實治療前mSEPT9 水平是長期生存率的良好預(yù)測因子。

綜上所述，SEPT9 基因通過甲基化改變表達水平，在胃癌發(fā)生、發(fā)展中扮演復(fù)雜角色。通過對外周血SEPT9 基因甲基化檢測可發(fā)現(xiàn)胃癌。與傳統(tǒng)腫瘤標志物相比，SEPT9 基因甲基化檢測有更高的靈敏度。通過將mSEPT9 測定其他標志物結(jié)合，檢測的敏感性顯著增強，更有助于臨床實踐。

Septin9 甲基化檢測在胃癌早期診斷中的價值已凸顯，但是具體作用的信號通路及機制需要深入研究。由于Septin9 復(fù)雜的異構(gòu)體的存在，目前仍然無法清楚地闡明mSETP9 和Septin9 表達之間的關(guān)系，對于SEPT9 基因是否是癌基因的問題仍存在爭議，因此未來應(yīng)細化Septin9 各亞型，研究其在癌癥中的作用。此外，SEPT9_v2 啟動子高甲基化是結(jié)直腸癌形成過程的特有表現(xiàn)，其成功用于外周血檢測篩查結(jié)直腸癌，提示我們未來胃癌甲基化生物標志物研究應(yīng)考慮到特異性剪接變異體的作用。再者，可通過優(yōu)化外周血SEPT9 基因甲基化檢測技術(shù)，提高檢測準確性，開展大樣本隨機對照實驗，進一步研究定量DNA 甲基化與胃癌病程進展的關(guān)系，在早期篩查、診斷、靶向治療、療效評價、預(yù)后和復(fù)發(fā)監(jiān)測中發(fā)揮新的作用。