尿液中miRNA-24-3p 聯(lián)合miRNA-222-3p 檢測在前列腺癌中的診斷及臨床意義

任超

（1.天津醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院臨床學(xué)院，天津 300121；2.天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院檢驗科，天津 300270）

前列腺癌是男性第二常見的惡性腫瘤，也是第五大致死癌癥。目前，血清前列腺特異性抗原（PSA）水平升高（≥10 ng/mL）和（或）可疑直腸指檢（DRE）進(jìn)行前列腺活檢和組織病理學(xué)評估，可對前列腺癌做出診斷[2]。但PSA 對前列腺癌的特異性較低，導(dǎo)致許多不必要的前列腺活檢和前列腺癌的過度治療[3]。因此，迫切需要一種新的無創(chuàng)性分子生物標(biāo)志物來準(zhǔn)確診斷前列腺癌并預(yù)測其預(yù)后，以提高臨床診斷水平及做出治療決定。MicroRNAs（miRNAs）是一類小的非編碼RNA[4]，已發(fā)現(xiàn)超過2 500 個成熟的miRNA[5]，每個miRNA 都有可能調(diào)控數(shù)百個基因[6]，miRNAs 因其檢測的穩(wěn)定性好，被認(rèn)為是很好的生物標(biāo)志物。研究表明，前列腺癌患者組織和血液（血清/血漿）樣本中的miRNAs 表達(dá)發(fā)生改變，可作為前列腺癌分期或診斷、預(yù)后的標(biāo)志分子[7-10]。miRNA-24 與miRNA-223、-375 表達(dá)差異的變化聯(lián)合可作為前列腺癌患者的診斷分子標(biāo)志物[11]。此外，miRNA-222-3p 可能通過負(fù)調(diào)控SNAP91 的表達(dá)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中發(fā)揮重要作用[12]，但其是否可作為前列腺癌診斷或預(yù)后的標(biāo)志分子尚無報道。本研究聯(lián)合檢測miRNAs 在不同前列腺癌分期患者尿液中的表達(dá)。通過進(jìn)一步分析差異表達(dá)的miRNAs，尋找穩(wěn)定、可靠的前列腺癌診斷標(biāo)志分子，同時通過比較不同Gleason 分級組間的表達(dá)差異，以期改善前列腺癌的危險分層，指導(dǎo)個性化的治療決策。

1 對象及方法

1.1 研究對象及分組 收集2016 年1 月—2021 年12 月在天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院檢驗科因排尿困難、尿失禁等臨床癥狀接受檢查且PSA（4～25 ng/mL）中度升高患者的尿液和血清，初步進(jìn)行miRNAs 芯片篩選組的樣本分為兩組：對照1 組（6 例良性前列腺增生患者）及PC1組（18 例，根據(jù)Gleason 評分進(jìn)一步分為3 組，即GS16 組、GS17 組、GS18 組，各6 例）。另外，miRNAs 表達(dá)驗證時樣本組分為4 組：對照2組（20 例良性前列腺增生患者），PC2組59 例，PC2組根據(jù)Gleason 評分進(jìn)一步分為3 組：GS26 組22例，GS27 組19 例及GS28 組18 例。PC 組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理切片證實；首次診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：他處具有原發(fā)性腫瘤；術(shù)前具有放化療治療；不配合試驗者。所有受試者在參加本研究之前均知情同意。

1.2 miRNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄 收集的血清和首次排尿樣本最初儲存在4℃，在6 h 內(nèi)將其等分并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲存。所有患者均行經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)活檢。用差速離心法從38.5 mL 的尿液獲得無細(xì)胞尿液，在4℃，13 000 ×g 離心10 min，去上清以去除碎屑和鹽。進(jìn)一步將上清液超速離心13 000×g，10 min，最終獲得的顆粒再用250 μL PBS 懸浮，然后儲存在-80℃供以后使用?；颊哐逶?0℃靜置10 min，去除剩余細(xì)胞和細(xì)胞碎片。在13 000×g，10 min 進(jìn)一步超速離心上清液后并用PBS 洗滌，重復(fù)兩次，最終獲得的顆粒100 μL PBS 再懸浮，然后儲存在-80℃供以后使用。用miRNeasy 小試劑盒（Qiagen，Venlo，Netherlands）和凈化試劑盒（Qiagen）分離miRNA 和mRNA，Nanodrop 紫外吸收測定法測定RNA 在波長260 nm 和280 nm 的吸收值，獲得RNA 的濃度并通過A260/280 及A260/230 的吸收比值判斷RNA 的純度。

1.3 人類miRNA 芯片檢測miRNA 表達(dá)水平 利用人類miRNA Microarray，Release 21.0（G4872A，Agilent）芯片檢測技術(shù)，制備熒光標(biāo)記探針，miRNA 3′端進(jìn)行Cy 熒光標(biāo)記，采用SurePrint 原位噴墨合成技術(shù)合成60-mer 用于與芯片雜交的熒光探針。芯片雜交，取約100 ng 量的質(zhì)檢達(dá)標(biāo)樣本，與miRNA 芯片進(jìn)行雜交，檢測miRNA 的表達(dá)。

1.4 qRT-PCR 驗證候選miRNA 標(biāo)志分子的表達(dá)水平 利用Arraystar SYBR? Green qPCR Master Mix（ROX-）（AS-MR-005-5，康成生物）進(jìn)一步驗證miRNA 的表達(dá)水平，反應(yīng)體系為：樣本200 ng（2 μL），上下游引物（10 μmol/L，1.5 μL），SYBR? Green（10 μL），DERC 水（6.5 μL）。反應(yīng)程序為：95℃20 s，隨之進(jìn)行40 個循環(huán)：95℃10 s，60℃20 s，70℃10 s，并在7900 real-time PCR 儀上進(jìn)行檢測。以穩(wěn)定表達(dá)的miRNA-200b-3p，miRNA-27b-3p 做內(nèi)參[13]。引物序列如下：miRNA-200b-3p：上游：5′-GCTGCTGAATTCCATCTAATTTCCAAAAG-′；下游：5′-TATTATGGATCCGCCCCCAGGGCAATGGG-3′；miRNA-27b-3p：上游：5′-AGCGTTCACAGTGGCTAAG-3′，下游：5′-TCCTCCTCTCCTCTCCTCTC-3′；miRNA-24-3p：上游：5′-ACAGCAGGCACAGAGAGGGG-3′，下 游：5′-CTGGCTCAGTTCAGCAGG AACAG-3′；miRNA-222-3p；上游：5′-GGGGAGCTACAT CTGGCT-3′，下游：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′。miRNAs 表達(dá)量計算公式為：差異倍數(shù)=2-（△△Ct），其中△Ct=Ct（miRNA）-Ct（miR-200b-3p，miR-27b-3p），△△Ct=△Ct（病例組）-△Ct（對照組）

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行Student t 檢驗用以組間差異統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量資料用±s 表示。計量資料采用n（%）表示，頻數(shù)小于5 的數(shù)據(jù)采用Fisher 精確概率法。繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），計算曲線下面積（AUC）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿液中miRNAs 差異表達(dá) 針對miRNAs 篩選組樣本進(jìn)行miRNA 芯片檢測（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照1 組相比，PC1組（包括GS16、GS17、GS18組）年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GS18 組PSA≥10 ng/mL 者的例數(shù)更多（P＝0.03）。與對照1 組相比，各miRNAs 均一化表達(dá)量（1±0.07），共有20 個miRNAs表達(dá)發(fā)生顯著差異性改變，其中11 種miRNAs 顯著性下調(diào)，9 種miRNAs 顯著性上調(diào)（表2），其中，表達(dá)差異最為顯著的兩個miRNAs：miRNA-24-3p（-2.58±0.022）及miRNA-222-3p（-2.89±0.029）表達(dá)比對照1 組顯著下調(diào)。

表1 臨床樣本信息表[±s，n（%）]Tab 1 Clinical sample information form[±s，n（%）]

表1 臨床樣本信息表[±s，n（%）]Tab 1 Clinical sample information form[±s，n（%）]

注：GS：Gleason 評分；PC：前列腺癌；PSA：血清前列腺特異性抗原

組別 年齡（歲） PSA（＜10 ng/mL）PSA（≥10 ng/mL） GS對照1 組（n=6） 65.5±1.5 6（100） 0（0）PC1 組GS16（n=6） 66.4±1.2 5（83） 1（17） 3+3 GS17（n=6） 74.0±2.3 3（50） 3（50） 3+4 GS18（n=6） 78.2±2.5 1（17） 5（83）a 4+4 χ2/F 10.61 10.27 21.56 P 0.09 0.07 0.03

2.2 RT-PCR 驗證差異miRNA 的表達(dá)水平 利用RT-PCR 在驗證樣本組（表3）中進(jìn)一步驗證這些差異miRNAs 基因的表達(dá)水平，結(jié)果提示，與對照2 組相比，GS27 組miRNA-24-3p 顯著下調(diào)，與GS27 組相比，GS28 組miRNA-24-3p 顯著下調(diào)。與對照2組相比，PC2 組中miR-222-3p 都顯著下調(diào)。與GS26 組、GS27 組相比組，GS28 組顯著下調(diào)（圖1）。

圖1 RT-PCR 驗證各組尿液樣本中miRNAs 表達(dá)水平Fig 1 Validation of miRNAs expression levels in urine samples by RT-PCR

表3 驗證miRNAs 表達(dá)的樣本信息[±s，n（%）]Tab 3 Samples clinical characteristics for miRNAs expression validation[±s，n（%）]

表3 驗證miRNAs 表達(dá)的樣本信息[±s，n（%）]Tab 3 Samples clinical characteristics for miRNAs expression validation[±s，n（%）]

注：GS：Gleason 評分；PC：前列腺癌；PSA：血清前列腺特異性抗原

組別 年齡（歲）PSA（＜10 ng/mL）PSA（≥10 ng/mL） GS對照2 組（n=20） 62.5±0.5 20（100） 0（0）PC2 組GS26（n=22） 65.5±1.5 18（82） 4（18） 3+3 GS27（n=19） 68.6±2.2 6（33） 13（67） 3+4 GS28（n=18） 80.5±3.4 1（5） 17（95） 4+4 χ2/F 6.43 11.45 19.01 P 0.04 0.07 0.04

在血清樣本中，利用RT-PCR 進(jìn)一步檢測差異miRNAs 基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對照2 組相比，GS28 組miRNA-24-3p 及miR-222-3p 顯著下調(diào)（圖2）。根據(jù)miRNA-24-3p 及miRNA-222-3p 作為聯(lián)合診斷指標(biāo)繪制ROC 曲線。如圖3 所示，AUC值為0.93（OR=1.37，95% CI：0.92~1.76，P＝0.02），提示miRNA-24-3p 及miRNA-222-3p 表達(dá)量改變聯(lián)合診斷前列腺癌的應(yīng)用價值較高。

圖2 RT-PCR 驗證各組血清樣本中miRNAs 表達(dá)水平Fig 2 Validation of miRNAs expression levels in serum samples by RT-PCR

圖3 miRNA-24-3p 及miRNA-222-3p 聯(lián)合診斷前列腺癌的受試者工作特征曲線Fig 3 Receiver operating characteristic curve of the combination of miRNA-24-3p and miRNA-222-3p model as diagnostic subjects for prostate cancer

3 討論

本研究在篩選階段，篩選到20 個差異表達(dá)的miRNAs 后，進(jìn)行了第二階段的驗證，最終鑒定出2種穩(wěn)定下調(diào)的尿液、血清miRNAs（miR-24a-3p、miR-222-3p），同時比較不同GS 其表達(dá)差異，證明其在前列腺癌診斷及GS 危險分層中具有較高的準(zhǔn)確性，可能成為未來前列腺癌診斷的分子特征。

迄今為止，越來越多miRNAs 被認(rèn)為可作為前列腺癌診斷、分級、預(yù)后的標(biāo)志分子。2017 年，丹麥奧胡斯大學(xué)醫(yī)院研究團(tuán)隊針對第一組樣本：20 例良性前列腺增生（BPH）及188 例前列腺癌患者的無細(xì)胞尿液，應(yīng)用qRT-PCR 檢測92 種miRNAs 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相比BPH 組，前列腺癌組14 種miRNAs 表達(dá)水平顯著升高，30 種miRNAs 表達(dá)水平顯著下降。進(jìn)一步在第二組樣本：20 例BPH 及197 例前列腺癌患者中，檢測該92 種miRNAs 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組中，有6 種miRNAs 表達(dá)水平顯著升高，22 種miRNAs 表達(dá)水平顯著下降。合并分析兩組樣本中存在表達(dá)差異的miRNAs，篩選到miRNA-222-3p、miRNA-24-3p 及miRNA-30c-5p 這一差異表達(dá)的miRNAs 組合，在第一組中鑒別診斷前列腺癌的準(zhǔn)確率達(dá)95%，在第二組中診斷前列腺癌準(zhǔn)確率為89%。且在PSA＜15 ng/mL 的患者中，對第一組及第二組樣本隊列中前列腺癌組的確診率也可高達(dá)97%與89%，提示該miRNAs 組合可作為前列腺癌患者早期診斷的標(biāo)志物[10]。在該組合中，miRNA-222-3p、miRNA-24-3p 在前列腺癌組中顯著下調(diào)，而miRNA-30c-5p 則顯著上調(diào)。該研究團(tuán)隊于2019 年，利用類似的方法分析得到包含miRNA-151a-5p、miRNA-204-5p、miRNA-222-3p、miRNA-23b-3p 和miRNA-331-3p 的組合多標(biāo)志物模型，該模型與前列腺癌根治性手術(shù)后是否生化復(fù)發(fā)，及前列腺癌患者的危險分級顯著相關(guān)[14]。日本大阪大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院研究團(tuán)隊于2021 年針對PSA 水平升高的直腸指檢陽性患者及陰性患者尿液細(xì)胞外小泡，進(jìn)行芯片檢測分析miRNAs 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-30b-3p 和miRNA-126-3p 在前列腺癌患者中顯著高表達(dá)，其預(yù)測前列腺癌發(fā)生的敏感性和特異性分別為46.4%和88.0%、60.7%和80.0%，優(yōu)于血清PSA（分別為53.5%和64.0%），可作為預(yù)測前列腺癌的分子標(biāo)志物[7]。同年，韓國一項研究對149例前列腺癌患者尿液外體miRNA 表達(dá)譜進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miRNA-16、miRNA-142-3p、miRNA-451 在前列腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，而miRNA-636 顯著下調(diào)。當(dāng)綜合評估臨床因素時，miRNA-21、miRNA-451、miRNA-636，及術(shù)前PSA 水平在多因素分析中仍有顯著性差異。在此基礎(chǔ)上，該研究團(tuán)隊建立了前列腺癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險評分（PCa-MRS）模型。PCa-MRS 顯示出優(yōu)于術(shù)前PSA 或臨床GS 的分層能力（AUC=0.925）。得分高的患者生化無復(fù)發(fā)生存率明顯低于得分低的患者[8]。此外，揚(yáng)州大學(xué)研究團(tuán)隊檢測前列腺癌患者及正常對照組外周血血清中168 種miRNAs，發(fā)現(xiàn)miRNA-146a-5p、miRNA-24-3p 及miRNA-93-5p 水平顯著升高，可作為前列腺癌患者無創(chuàng)性診斷標(biāo)志物[15]。

本研究提出miRNA-24-3p 可作為前列腺癌患者鑒定標(biāo)志分子，其機(jī)制被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子通路，進(jìn)而影響前列腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-24-3p 可通過調(diào)控fascin1（FSCN1），影響前列腺癌的耐藥性[17]。在高危的前列腺癌患者中，miRNA-222-3p 可靶向調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子受體2/KDR 蛋白[18]。但這兩種miRNAs具體的機(jī)制及是否存在協(xié)同靶向作用需進(jìn)一步明確。

綜上所述，本課題組確定了一個用于前列腺癌診斷、分層的miRNA 組，今后將進(jìn)一步在更大的樣本中驗證及統(tǒng)計，以期在未來的臨床中準(zhǔn)確應(yīng)用。