慢性炎癥在X 射線誘發(fā)恒河猴卵巢組織持續(xù)損傷中的潛在作用

周瑩，杜湧瑞，Mary B.Zelinski，王建梅

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院計(jì)劃生育科，天津 300211；2.美國俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)生殖科學(xué)部，俄勒岡 97006）

放射治療作為癌癥治療的主要手段之一，其性腺毒性，特別是對(duì)年輕女性患者卵巢功能的損傷，嚴(yán)重影響該人群治療后生殖健康和生活質(zhì)量[1]。研發(fā)體內(nèi)卵巢保護(hù)劑以預(yù)防放射治療后早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）或卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前的實(shí)驗(yàn)研究中多為對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究，且主要關(guān)注輻射暴露對(duì)卵巢功能的早期影響[2-4]，而在非卵巢組織中的研究顯示，輻射暴露后會(huì)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，尤其是激活的巨噬細(xì)胞，可釋放促炎細(xì)胞因子和趨化因子，誘發(fā)級(jí)聯(lián)炎癥，持續(xù)性損傷組織細(xì)胞[5-6]，而卵巢輻射暴露后炎癥是否持續(xù)存在以及其對(duì)卵巢的影響目前尚不明確。本研究以經(jīng)X 射線直接照射的非人靈長類動(dòng)物恒河猴卵巢組織及其血液標(biāo)本為研究對(duì)象，觀察其免疫細(xì)胞標(biāo)志物及血清炎性因子表達(dá)情況，探討靈長類動(dòng)物卵巢X 射線暴露后是否存在慢性炎癥以及其對(duì)卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 14 只月經(jīng)周期規(guī)律的健康雌性SPF 級(jí)恒河猴，年齡8～14 歲，體重6.2～7.5 kg。清潔級(jí)飼養(yǎng)，室溫22℃，自由食水。恒河猴飼養(yǎng)嚴(yán)格按照NIH《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)過動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。隨機(jī)分為3 組：假照射（Sham）組（n=8）、卵巢照射（ovarian x-irradiation，OXI）組（n=3）和X 射線照射+FTY-720（免疫抑制劑）（FTY-720）組（n=3）。

1.1.2 主要試劑和儀器 賦形劑（以下簡寫為PET）：30% PEG-2000（CAS474922-26-4，美國Cayman Chemical 公 司）、60% 無 水 乙 醇（Ethanol）、10%Tween-20（CAS9005-64-5，美國圣克魯斯生物技術(shù)公司）。FTY-720（CAS162359-55-9，美國Cayman Chemical 公司）。4%多聚甲醛固定液-PBS，單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1 單克隆抗體（MA5-17040），MCP-1（88-7399-86）、白細(xì)胞介素（IL）-6（BMS213HS）ELISA 試劑盒均購自美國Invitrogen 公司。CD68 單克隆抗體（sc-20060）購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。CD-11b 單克隆抗體（ab133357）、辣根酶標(biāo)記抗鼠IgG（ab6728）、辣根酶標(biāo)記抗兔IgG（ab6721）、正常山羊血清（ab7481）均購自英國Abcam 公司。VECTASTAIN Elite ABC 試劑盒購自Vector Labs 公司。蘇木素染液（KGA223）、DAB 顯色液（KGP1045-20）均購自凱基生物科技有限公司。微滲透壓泵購自美國Durect 公司。Phillips 324kVp 直線加速器購自德國飛利浦公司。

1.2 方法

1.2.1 微滲透壓泵的植入 每只恒河猴的一側(cè)卵巢已被切取用以提供卵巢結(jié)構(gòu)及卵泡動(dòng)力學(xué)基線信息，另一側(cè)卵巢通過手術(shù)將一端帶有21 g 針頭的導(dǎo)管移入腹腔，并將針頭插入到卵巢中心，接口處進(jìn)行縫合并固定于卵巢韌帶，導(dǎo)管另一端與恒河猴胸腔皮下植入的微滲透壓泵相連，Sham 組和OXI 組泵的儲(chǔ)液器內(nèi)為溶劑PET，F(xiàn)TY-720 組中為PET+0.2 mmol/L FTY-720，均以10 μL/h 的速度持續(xù)泵注。

1.2.2 卵巢體外X 射線直接照射 卵巢內(nèi)泵注1 周后，靜脈麻醉恒河猴，仰臥位固定，逐層打開腹腔，取出微滲透壓泵、導(dǎo)管后，止血鉗鉗夾卵巢韌帶并保留卵巢血管蒂，將卵巢移出腹腔，置于腹側(cè)外表面并用溫?zé)釤o菌生理鹽水紗布覆蓋，然后對(duì)OXI 組和FYT-720 組卵巢進(jìn)行13 min 的X 射線照射，總劑量為15 Gy，身體其余部位用鉛板覆蓋，Sham 組卵巢不照射，僅于體外暴露相同時(shí)間，操作結(jié)束后將卵巢復(fù)位并縫合。

1.2.3 取材 照射結(jié)束第3 個(gè)月和第9 個(gè)月，采集每只恒河猴外周血，血清分離后于-80℃凍存；照射結(jié)束后第（316±7）天，于Sham 組恒河猴卵巢早卵泡期（月經(jīng)周期第2～4 天）取材卵巢組織，并立即置于4%多聚甲醛-PBS 溶液中，4℃固定，常規(guī)脫水透明制作蠟塊后，進(jìn)行5 μm 厚度連續(xù)切片。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)卵巢組織MCP-1、CD11b 和CD68 的表達(dá) 選取切好的卵巢組織切片，65℃烤片2 h 后，常規(guī)脫蠟脫水，微波爐修復(fù)抗原，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉；滴加稀釋一抗（MCP-1 抗體：1/5 000；CD68 抗體：1/200；CD11b抗體：1/4 000），陰性對(duì)照為PBS 溶液，4℃過夜，按照二抗說明書滴加二抗，PBS 洗凈后行DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。使用Olympus BX40 倒置顯微鏡和Olympus DP72 成像系統(tǒng)在相同光照條件下進(jìn)行拍攝并觀察染色結(jié)果。CD11b、CD68 陽性細(xì)胞的胞漿或胞膜呈棕黃色或棕褐色顆粒狀。在盲法分析中，由2 位研究者在每個(gè)標(biāo)本的隨機(jī)5 個(gè)視野內(nèi)評(píng)估卵巢切片CD11b、CD68 陽性細(xì)胞的數(shù)量，最后取均值用于統(tǒng)計(jì)。

1.2.5 ELISA 法檢測(cè)恒河猴血清中MCP-1、IL-6 表達(dá)水平 預(yù)先將ELISA 試劑盒置于室溫30 min，取出凍存于-80℃的血清樣本冰上融化后，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書測(cè)定恒河猴血清MCP-1 和IL-6 細(xì)胞因子的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。本研究數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，采用±s表示，方差齊性檢驗(yàn)和正態(tài)性檢驗(yàn)后，符合方差齊的多組數(shù)據(jù)比較采用one-way ANOVA，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey′s 檢驗(yàn)；方差不齊多組比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，若差異顯著，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunn′s 檢驗(yàn)；兩樣本比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 恒河猴卵巢MCP-1 的表達(dá) 與Sham 組相比，OXI 組MCP-1 陽性染色明顯，而FTY-720 組MCP-1陽性染色明顯弱于OXI 組，其與Sham 組染色相似（圖1）。

圖1 MCP-1 在恒河猴卵巢中的表達(dá)（免疫組化，200×）Fig 1 Expression of MCP-1 protein in ovary of rhesus monkeys（immunohistochemistry staining，200×）

2.2 恒河猴卵巢CD11b、CD68 的表達(dá) One-way ANOVA 結(jié)果顯示，Sham 組、OXI 組和FTY-720 組CD11b 陽性細(xì)胞數(shù)量[（147.3±73.29）、（469.9±327.5）、（165.1±89.54）cells/mm2]差異顯著（F=4.896，P=0.030 1），進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果示，OXI 組高于Sham組和FTY-720 組（均P＜0.05），而FTY-720 組與Sham 組差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可能由于恒河猴生物個(gè)體間差異較大，OXI 組CD68 陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（1 412.0、423.6、393.5 cells/mm2）不符合正態(tài)分布，采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，3 組間CD68 陽性細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=4.419，P=0.113 0），但OXI 組中的3 只恒河猴的卵巢組織CD68 陽性細(xì)胞數(shù)量均高于Sham 組平均值[（280.1±142.6）cells/mm2]和 FTY -720 組（259.3、328.7、270.8 cells/mm2），而FTY-720 組CD68 陽性細(xì)胞數(shù)量接近Sham 組水平（圖2）。

圖2 CD11b、CD68 在恒河猴卵巢中的表達(dá)及其陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較（免疫組化，200×）Fig 2 Expression and positive cells counts of CD11b，CD68 protein in ovary of rhesus macaques（immunohistochemistry staining，200×）

2.3 ELISA 法檢測(cè)各組血清MCP-1 和IL-6 水平 照射后3 個(gè)月，Sham 組、OXI 組及FTY-720 組恒河猴血清MCP-1 濃度分別為（396±122）、（299±47）和（256±21）pg/mL，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.640，P=0.150 5）；照射后9 個(gè)月，3 組間血清MCP-1 濃度差異顯著（F=9.328，P=0.014 4）。進(jìn)一步Tukey′s 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，OXI 組血清MCP-1 濃度[（502±105）pg/mL]明顯高于Sham 組[（296±43）pg/mL]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.031 4）；FTY-720 組血清MCP-1 濃度[（265±56）pg/mL]明顯低于OXI 組（P=0.017 2），其與Sham 組血清MCP-1 濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。僅OXI 組血清MCP-1 濃度照射前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.056，P=0.018 9）。IL-6 僅在OXI組中被檢測(cè)到，3 個(gè)月時(shí)為（4±1）pg/mL，9 個(gè)月時(shí)為（9±6）pg/mL，兩個(gè)檢測(cè)點(diǎn)的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.424，P＜0.05），見圖3。

圖3 恒河猴血清MCP-1 和IL-6 的水平Fig 3 The serum level of MCP-1 and IL-6 in rhesus monkey

3 討論

放射治療是惡性腫瘤的治療主要手段之一，但是放射治療會(huì)加速卵泡丟失，從而導(dǎo)致卵巢激素分泌減少，卵泡閉鎖，最終耗竭卵泡儲(chǔ)備池，導(dǎo)致絕經(jīng)提前及不孕[7]。一項(xiàng)兒童期癌癥幸存者治療后健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究表明，盆腹腔放射治療是女性卵巢功能衰竭和過早絕經(jīng)的重要危險(xiǎn)因素之一[8]。同樣，接受放射治療的青少年和年輕成人癌癥幸存者發(fā)生POF 的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加[9]，這一性腺毒性作用成為癌癥治療的常見晚期效應(yīng)，對(duì)幸存者的生活質(zhì)量有著嚴(yán)重影響。

放射性損傷研究發(fā)現(xiàn)，放射線暴露可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，活化的巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子，且該現(xiàn)象會(huì)持續(xù)存在。Christersdotti 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在放射治療結(jié)束156 周后，受照射的人動(dòng)脈組織中趨化因子2（CCL2/MCP-1）和CCL5 的表達(dá)量和巨噬細(xì)胞（CD68+）數(shù)量均明顯高于未受照射的動(dòng)脈組織，研究人員利用嚙齒動(dòng)物模型也重現(xiàn)了這一病理現(xiàn)象。最新研究還發(fā)現(xiàn)，單次輻射暴露2 個(gè)月后，雄性哥廷根小型豬循環(huán)系統(tǒng)功能受損，肝臟、腎臟組織出現(xiàn)纖維化等慢性炎性損傷改變[6]，以上研究均提示放射治療誘發(fā)的慢性炎癥可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)性損傷。而目前大多數(shù)研究主要集中于放射治療對(duì)卵巢的早期影響，在嚙齒動(dòng)物模型研究中發(fā)現(xiàn)放射治療可導(dǎo)致卵巢急性炎性損傷，且在放射治療前給與白藜蘆醇、N-乙酰半胱氨酸、香芹酚或百里香酚等抗炎抗氧化物質(zhì)干預(yù)后，可抑制放射治療誘發(fā)的急性炎癥并減輕卵巢損傷[2-4]，但是可能由于嚙齒動(dòng)物卵巢和人類卵巢對(duì)放射線敏感性不同，在臨床治療過程中，接受放射治療的年輕女性卵巢功能衰竭并非立即發(fā)生，而是一個(gè)逐漸加速的過程[10]。綜上所述，筆者認(rèn)為，放射治療誘發(fā)的卵巢炎性反應(yīng)可持續(xù)作用于卵巢組織，是卵巢輻射暴露后卵泡持續(xù)丟失的主要原因之一。

本研究結(jié)果顯示，恒河猴卵巢組織在接受直接照射9 個(gè)月后，OXI 組卵巢組織MCP-1 表達(dá)強(qiáng)于Sham 組和炎性抑制組（FTY-720 組），提示卵巢組織處于炎性狀態(tài)，可能已啟動(dòng)單核細(xì)胞的聚集和浸潤。同時(shí)筆者對(duì)卵巢組織進(jìn)行了CD11b、CD68 陽性巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，OXI 組卵巢組織CD11b、CD68 陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量均高于Sham 組和FTY-720 組，可能由于靈長類動(dòng)物的個(gè)體差異以及樣本量有限的原因，組間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究還對(duì)恒河猴機(jī)體炎性狀態(tài)進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)X 射線照射9 個(gè)月后，OXI 組恒河猴血清趨化因子MCP-1 及促炎細(xì)胞因子IL-6 顯著高于Sham 組，且照射結(jié)束后，血清MCP-1 及IL-6 水平呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，均提示放射線激活免疫系統(tǒng)后可導(dǎo)致機(jī)體處于長期慢性炎癥狀態(tài)，而FTY-720 組恒河猴血清MCP-1 及IL-6 水平均與Sham 組相似，證實(shí)了放射治療結(jié)束后卵泡持續(xù)丟失可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。

本研究選擇的炎性指標(biāo)MCP-1，是單核細(xì)胞趨化的關(guān)鍵因子，可將循環(huán)中的單核細(xì)胞趨化募集到組織分化為單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞，并將巨噬細(xì)胞活化為可產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和趨化因子的M1 型巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)炎性介質(zhì)的分泌和釋放，最終影響卵巢細(xì)胞增殖、激素分泌和排卵，導(dǎo)致卵巢功能下降或喪失，目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了其與卵巢功能障礙的相關(guān)性[11]。CD68 是成熟巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物，主要表達(dá)于卵巢血管結(jié)締組織，少量表達(dá)于黃體顆粒細(xì)胞膜層區(qū)域。CD11b 是M1 型巨噬細(xì)胞的一種標(biāo)志物，在炎癥中表達(dá)增加，發(fā)揮促炎作用[12]，主要在卵巢排卵后的卵泡膜層、間質(zhì)及黃體中表達(dá)[13]。本研究選擇在恒河猴卵巢早卵泡期取材，避免了卵巢生理性原因引起的巨噬細(xì)胞數(shù)量及表型的改變。IL-6 是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的重要成員，在炎癥中處于中心地位，可由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[14]，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在免疫應(yīng)答和炎癥中發(fā)揮重要作用，其分泌增加可導(dǎo)致卵巢性腺激素分泌紊亂、黃體功能障礙、影響胚胎著床及其發(fā)育，已成為POF 相關(guān)研究觀察指標(biāo)之一[15-16]。

綜上所述，X 射線照射卵巢后所引起的持續(xù)性炎癥，可能是卵巢功能損傷的又一原因。而X 射線照射前卵巢內(nèi)注入FTY-720 可保護(hù)卵巢功能，其機(jī)制可能與抑制卵巢單核細(xì)胞募集，減少M(fèi)1 型巨噬細(xì)胞及促炎因子IL-6，趨化因子MCP-1 分泌有關(guān)。本研究使用的動(dòng)物模型為靈長類動(dòng)物恒河猴，其卵巢結(jié)構(gòu)、卵泡募集、發(fā)育機(jī)制與人類最為接近，有利于研究成果的臨床轉(zhuǎn)化。FTY-720 有望成為一種安全、高效的體內(nèi)卵巢保護(hù)劑，可以改善女性腫瘤患者放射治療后的生活質(zhì)量。但是由于經(jīng)費(fèi)和時(shí)間的原因，本研究未能在信號(hào)通路上深入探討FTY-720卵巢保護(hù)的具體機(jī)制，以及其對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響，需要后期做進(jìn)一步的深入研究。

致謝：感謝美國OHSU 大學(xué)（Oregon Health&Science University）Mary B.Zelinski 教授對(duì)本研究的指導(dǎo)和無私幫助。