膽囊收縮素對小腸I 細(xì)胞及胰腺細(xì)胞和小鼠胰腺消化酶儲備的影響

徐曉晴，邱帥，陳喜娟，胡立娟，李秋菊，張大鵬，王豐

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.天津市南開醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所，天津 300100）

食糜進(jìn)入十二指腸和近段空腸后，食糜中的脂肪和蛋白分解物會刺激腸黏膜中的I 型內(nèi)分泌細(xì)胞釋放膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）。循環(huán)中的CCK 可刺激胰腺腺泡細(xì)胞向胰液中分泌消化酶，也使胃排空暫停并使膽囊收縮和十二指腸壺腹舒張，使膽胰液進(jìn)入腸腔[1]。屆時，胰液中的蛋白酶會抑制I 細(xì)胞的CCK 分泌，使CCK 的上述效應(yīng)停止。而當(dāng)這些食糜離開上段小腸后，新一輪的胃排空和CCK分泌開始，CCK 介導(dǎo)的效益再度出現(xiàn)；如此循環(huán)往復(fù)直至胃內(nèi)容被全部排空[2]。除調(diào)節(jié)消化吸收外，CCK 還促進(jìn)胰腺的正常生長，也參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展[3-7]。飲食或手術(shù)可提高CCK 的基礎(chǔ)分泌水平和血濃度，持續(xù)高循環(huán)水平的CCK 經(jīng)受體（CCKR）介導(dǎo)使其靶細(xì)胞長期處于活躍狀態(tài)[8]，而CCK 的長期刺激能否改變胰腺中消化酶的構(gòu)成還不清楚。胰膽轉(zhuǎn)流術(shù)（pancreatobiliary diversion，PBD）因?qū)⒁饶懸阂鞯竭h(yuǎn)端小腸，移除了胰蛋白酶對近段小腸CCK 分泌的抑制，從而造成慢性高CCK 血癥。PBD 是CCK 研究的重要模型[3-7]，過去僅在大鼠和倉鼠體內(nèi)實現(xiàn)，近期，小鼠的PBD 模型成功建立[9]。本實驗溯源小鼠PBD 對十二指腸I 細(xì)胞的分泌狀態(tài)、胰腺細(xì)胞及消化酶含量影響。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處置 雄性Balb/C 裸鼠40 只購自北京華阜康生物科技，4 周齡，體重14~16 g。飼養(yǎng)于SPF 級動物房，12 h/12 h 晝夜循環(huán)光照，自由攝食、飲水。在適應(yīng)期結(jié)束后，隨機(jī)分為胰膽轉(zhuǎn)流術(shù)組（PBD 組，n=20）和假手術(shù)組（SO 組，n=20）。術(shù)前用三溴乙醇麻醉小鼠，PBD 組手術(shù)經(jīng)上腹部正中切口開腹暴露十二指腸，以膽總管（含主胰管）匯入十二指腸處為標(biāo)志，在其近口側(cè)4 mm 和遠(yuǎn)口側(cè)4 mm 兩處橫斷十二指腸，封閉游離腸段一端，另一端與末端回腸行斷側(cè)吻合，十二指腸剩余部游離端用端端吻合再建。SO 組則橫斷十二指腸和回腸的兩處，進(jìn)行再吻合[9]。PBD 組或SO 組術(shù)后20 d 麻醉下處死小鼠；PBD 組剩余小鼠15 只，而20 只SO 組鼠則全部存活。取內(nèi)眥血分離血漿后頸脫位處死小鼠，開腹取十二指腸，放入10%多聚甲醛中固定；取胰腺稱重，將一部分放入10%多聚甲醛固定，余部置-80℃保存。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法測定 用上海信帆公司的CCK 放免檢測盒。取凍存的胰腺組織放入PBS 液中，機(jī)械研磨制成勻漿，離心（5 000×g，10 min）取上清。用檢測試劑盒測定胰蛋白酶原、胰脂酶和胰淀粉酶。小鼠胰脂肪酶酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（E-ELM2448c）產(chǎn)自武漢伊萊瑞特生物科技公司，胰蛋白酶測試盒（A080-2）產(chǎn)自南京建成生物工程研究所，淀粉酶ELISA 檢測試劑盒（LP-M06531）產(chǎn)自上海嵐派生物科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測 石蠟包埋十二指腸和胰腺組織，制成4 μm 厚切片。免疫組化的工具和試劑包括ABC 免疫組織化學(xué)染色試劑盒（PK-6200，Vector laboratories，Burlingame，CA，USA）、DAB 辣根過氧化物酶顯色試劑盒（DA1015，solarbio，北京）、CCK抗體（DF8515，Affinity，USA）、CCK1R 抗體（orb156289，biorbyt，CA，USA）和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體（#AB92552，Abcam，北京）。以抗CCK 抗體的免疫組化來標(biāo)示I 細(xì)胞[10-11]，每張切片選取5個連續(xù)視野觀察，兩名研究人員在未知分組情況的條件下用Image J 調(diào)節(jié)照片的色彩閾值量化十二指腸中的I細(xì)胞陽性區(qū)域，計算腸道CCK 陽性區(qū)域在總視野面積中的占比；在胰腺組織中計數(shù)表達(dá)CCKR 或PCNA 的細(xì)胞數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示。兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本均數(shù)t 檢驗，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計資料的單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的計量資料，則采用相應(yīng)的非參數(shù)秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胰腺I 細(xì)胞增殖及血漿CCK 水平 如表1 所示，PBD 組胰腺重量明顯大于SO 組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；且PBD 組的CCK 血漿水平也高于SO 組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PBD 對小鼠的影響（±s）Tab 1 The effect of PBD on mice（±s）

表1 PBD 對小鼠的影響（±s）Tab 1 The effect of PBD on mice（±s）

注：SO 組：假手術(shù)組；PBD 組：胰膽轉(zhuǎn)流術(shù)組；CCK：膽囊收縮素；CCKR：膽囊收縮素受體；PCNA：增殖細(xì)胞核抗原

?指標(biāo) SO 組（n=20） PBD 組（n=15） t P胰腺重量（mg） 273.81±19.43 364.82±32.93 2.51 ＜0.05血漿CCK（pmol/L） 1.83±0.05 3.85±0.13 16.59 ＜0.01 I 細(xì)胞區(qū)域占比（%） 5.54±1.24 14.42±3.72 5.04 ＜0.01 CCKR 陽性細(xì)胞（‰） 24.41±3.16 49.68±3.90 5.08 ＜0.01 PCNA 陽性細(xì)胞（‰） 13.26±1.67 44.62±3.92 8.05 ＜0.01

2.2 兩組I 細(xì)胞區(qū)域比較 如圖1 所示，PBD 組I細(xì)胞區(qū)域占比明顯高于SO 組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖1 兩組I 細(xì)胞免疫組化結(jié)果（400×）Fig 1 Immunohistochemical of I cells in two groups（400×）

2.3 兩組CCKR 受體比較 如圖2 顯示，PBD 組CCKR 的表達(dá)明顯較SO 組增強(qiáng)（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖2 兩組CCKR 的表達(dá)（400×）Fig 2 The expression of CCKR in two groups（400×）

2.4 兩組PCNA 比較 如圖3 所示，PBD 組的PC－NA 陽性率明顯高于SO 組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖3 兩組PCNA 的表達(dá)（400×）Fig 3 The expression of PCNA in two groups（400×）

2.5 兩組消化酶含量比較 如表2 所示，與SO 組相比，PBD 組胰蛋白酶原和胰脂酶的濃度升高（均P＜0.05）；而淀粉酶的水平雖有所上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.56）。上述結(jié)果與胰腺重量進(jìn)行整合計算消化酶在胰腺中的總量時，發(fā)現(xiàn)與SO 組相比，PBD 組的結(jié)果均高于SO 組（均P＜0.05）。

表2 兩組胰腺消化酶比較（±s）Tab 2 The concentrations of pancreatic digestive enzyme in two groups（±s）

表2 兩組胰腺消化酶比較（±s）Tab 2 The concentrations of pancreatic digestive enzyme in two groups（±s）

注：SO：假手術(shù)組；PBD：胰膽轉(zhuǎn)流術(shù)組

指標(biāo) SO 組（n=20） PBD 組（n=15） t P胰蛋白酶原濃度（U/μg） 8.88±0.99 18.64±2.27 4.31 <0.01胰脂肪酶濃度（ng/g） 胰淀粉酶濃度（U/ng） 24.95±1.43 29.96±1.90 2.15 <0.05 1.19±0.14 1.32±0.16 0.60 0.56全胰蛋白酶含量（104 U/pancreas） 7.43±1.01 12.44±1.91 2.49 <0.05全胰脂肪酶含量（ng/pancreas） 7.19±0.73 9.61±0.98 2.02 <0.05全胰淀粉酶含量（103 U/pancreas） 0.74±0.53 1.28±0.74 2.53 <0.05

3 討論

大鼠和倉鼠的PBD 是CCK 研究的經(jīng)典模型[3-7]。近期，PBD 模型在小鼠體內(nèi)成功建立[9]。這一模型的建立，使PBD 可以和一些常見小鼠的模型（如轉(zhuǎn)基因鼠和裸鼠）結(jié)合，以深入研究CCK 在一些生理、病理狀態(tài)下的調(diào)節(jié)作用[12-13]。在眾多的PBD 研究中，“PBD 后I 細(xì)胞是否有反應(yīng)性增生”這一問題在此前一直未被涉及。本實驗結(jié)果中，PBD 術(shù)后20 d小鼠所表現(xiàn)出的高CCK 血癥及其在胰腺中引發(fā)的各種改變，其起因僅來自I 細(xì)胞的高分泌狀態(tài)，也來自I 細(xì)胞群落的代償性增生，說明代償?shù)目焖俸透咝А?/p>

研究顯示，由PBD 導(dǎo)致的高CCK 血癥對胰腺生長具有刺激作用，但在這些研究中，CCKR 的結(jié)果卻缺如[4-5]。此次PBD 對胰腺生長的刺激作用與其對胰腺CCKR 表達(dá)的刺激同時發(fā)生，說明該受體介導(dǎo)了PBD 對胰腺細(xì)胞增殖的刺激。

Axelson 等[4]報道，早期PBD 手術(shù)可使胰蛋白酶濃度升高，但不提高胰淀粉酶的分泌能力；Hara 等[14]同樣報告了PBD 可降低胰淀粉酶活性，F(xiàn)?lsch 等[1]的研究中，胰蛋白酶和胰淀粉酶水平可提高。本研究中發(fā)現(xiàn)高CCK 血癥能夠增加胰腺中胰蛋白酶原和脂肪酶的濃度，但不顯著影響淀粉酶。CCK 能選擇性地增加胰腺蛋白酶和脂肪酶的豐度但不顯著改變淀粉酶的豐度，這一結(jié)果提示胰腺中不同的消化酶是以一種分隔的方式儲備的[15]。這一分隔既可發(fā)生在細(xì)胞水平，也可發(fā)生在亞細(xì)胞水平。例如，不同的腺泡細(xì)胞可富含不同的消化酶，而富含胰蛋白酶和脂肪酶的細(xì)胞又較富含淀粉酶的細(xì)胞更容易對CCK 的刺激做出反應(yīng)。抑或，不同的消化酶可在同一細(xì)胞中富集于不同的分泌顆粒中，當(dāng)CCKR 被激活后，細(xì)胞優(yōu)先把富含胰蛋白酶和脂肪酶的分泌顆粒排放到細(xì)胞外。值得注意的是，CCK 對胰蛋白酶和脂肪酶的刺激與食糜中的蛋白和脂肪刺激I 細(xì)胞CCK 分泌是一致的，促使其在進(jìn)食后狀態(tài)完成CCK分泌的正反饋。

本研究利用小鼠PBD 造成的高CCK 血癥發(fā)現(xiàn)，CCK 能選擇性地增加胰腺中胰蛋白酶原和胰脂肪酶的儲備，并證實持續(xù)的CCK 高分泌伴隨著I 細(xì)胞群落的增大。在后續(xù)的研究中，鑒于內(nèi)源性CCK的異常表達(dá)與胰腺生長及消化酶分泌相關(guān)，將進(jìn)一步用以研究與飲食及肥胖相關(guān)的胰腺癌發(fā)展機(jī)制。