抑肝散提取物對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物神經(jīng)毒性的抑制作用

穆軼，朱彧

（1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300211；2.天津市海河醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300350）

雙酚A（bisphenol A，BPA）和鄰苯二甲酸二-（2-乙基）己酯（di-（2- ethylhcxyl）phthalate，DEHP）是廣泛存在于日用品的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（environmental endocrine disruptors，EEDs），主要存在于飲用水、食品容器、化妝品以及供水管等，主要暴露途徑包括吸入、攝入和皮膚接觸等[1]。BPA 和DEHP 能夠穿透血-腦屏障，影響神經(jīng)功能[2]。

抑肝散出自明代薛鎧所著《保嬰撮要》，可養(yǎng)血活血舒肝、抑制肝氣亢盛和郁結(jié)，已應(yīng)用于臨床多年，療效確切[3-4]。本研究考察了抑肝散對(duì)BPA+DEHP 暴露大鼠神經(jīng)功能的保護(hù)作用及機(jī)制，為抑肝散應(yīng)用于EEDs 神經(jīng)毒性防治提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 藥物和試劑 BPA 和DEHP 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Neuro-2a 細(xì)胞購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；抑肝散由鉤藤、柴胡、茯苓、白術(shù)、川芎、當(dāng)歸、甘草按3∶4∶2∶4∶1.5∶3∶3 比例組成，所有均購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，經(jīng)乙醇/氯仿提取后使用；caspase-3 活性、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量和線(xiàn)粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）試劑盒均購(gòu)自索萊寶公司；星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維狀酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白（nestin）、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR、β-actin 抗體和羊抗兔IgG-FITC 熒光二抗均購(gòu)自Santa Cruz 公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自美國(guó)abcam 公司；Annexin V-PE 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司，F(xiàn)ACSAria 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Neuro-2a細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為H-DMEM，添加10%胎牛血清。0.25%胰酶-EDTA 消化傳代，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將Neuro-2a 細(xì)胞（5 000 個(gè)/孔）培養(yǎng)于96 孔板中，經(jīng)BPA（0.1 mmol/L）+DEHP（0.1 mmol/L）與3 mg/mL（低劑量組）和6 mg/mL（高劑量組）抑肝散乙醇/氯仿提取物共培養(yǎng)72 h 后，更換新鮮完全培養(yǎng)基，加入10 μL/孔CKK-8 溶液，37℃孵育4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀在460 nm 吸收波長(zhǎng)處檢測(cè)OD 值。未處理組作為對(duì)照組，BPA+DEHP 處理組作為暴露組。

1.4 流式細(xì)胞術(shù) 將Neuro-2a 細(xì)胞（3×105個(gè)/孔）培養(yǎng)于6 孔板中，經(jīng)BPA（0.1 mmol/L）+DEHP（0.1 mmol/L）與3 mg/mL（低劑量組）和6 mg/mL（高劑量組）抑肝散乙醇/氯仿提取物共培養(yǎng)72 h 后，0.25%胰酶-EDTA 消化后轉(zhuǎn)移至PE 管中，加入5 μL Annexin V-PE 溶液，室溫避光孵育10 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。加入10 μL 熒光探針DCFH-DA，室溫避光孵育20 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞ROS 水平。未處理組作為對(duì)照組，BPA+DEHP 處理組作為暴露組。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 初斷乳雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～220 g），購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)溫度25 ℃，濕度60%，自由飲食。所有行為學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟均嚴(yán)格參照動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)指導(dǎo)原則進(jìn)行。

將25 μg/（kg·d）BPA+50 μg/（kg·d）DEHP（溶于玉米油）連續(xù)灌胃暴露90 d，同時(shí)隔天灌胃給予300 mg/kg（低劑量組）和600 mg/kg（高劑量組）抑肝散乙醇/氯仿提取物（重新溶于玉米油），玉米油作為對(duì)照組，構(gòu)建抑肝散治療大鼠模型，分為對(duì)照組、暴露組、低劑量組和高劑量組，12 只/組。

暴露和給藥結(jié)束時(shí)，通過(guò)Y 迷宮實(shí)驗(yàn)觀察BPA+DEHP 對(duì)大鼠短期記憶能力的影響，具體步驟如下：將大鼠放入Y 迷宮三臂交匯處，讓其自由探索8 min，記錄大鼠正確臂的次數(shù)和進(jìn)臂總次數(shù)，計(jì)算出自發(fā)交替正確率。自發(fā)交替正確率=進(jìn)入正確臂的次數(shù)/（進(jìn)臂總次數(shù)-2）×100%。

Y 迷宮實(shí)驗(yàn)后，將大鼠禁食過(guò)夜，并且在24 h后，大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（3 mg/kg）麻醉，并腹膜內(nèi)注射肝素（1 U/g 體重）以避免血液凝固。然后將海馬組織切除，生理鹽水沖洗后，稱(chēng)重，保存在4℃下4%液氮中。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 取大鼠海馬組織切片，75℃烘片1 h，脫蠟，檸檬酸鈉溶液120℃、2.5 min 抗原修復(fù)，5%BSA 溶液室溫封閉20 min，GFAP（1∶1 500）和nestin（1∶1 500）一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS 溶液清洗后在切片上滴加羊抗兔IgG-FITC 熒光二抗，37℃避光孵育1.5 h，封片后經(jīng)熒光顯微鏡觀察（100×）。

1.7 生化法檢測(cè) 取海馬組織液氮反復(fù)凍融3 次，4℃條件下800 r/min 離心（5 min）2 次，均取上清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，通過(guò)酶標(biāo)儀根據(jù)吸光度檢測(cè)海馬組織中丙二醛、還原型谷胱甘肽含量、總抗氧化能力和caspase-3 活性的變化，通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)葡萄糖含量的變化。

1.8 線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè) 取海馬組織勻漿后，4℃條件下800 r/min 離心（5 min）2 次，均取上清，4℃條件下10 000 r/min 離心10 min，取沉淀在離心管底部的線(xiàn)粒體，洗滌后4℃條件下12 000 r/min 離心10 min，棄上清取線(xiàn)粒體。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)海馬組織中線(xiàn)粒體膜電位的變化。

1.9 Western 印跡實(shí)驗(yàn) 將海馬組織剪碎、細(xì)胞裂解、收集蛋白，取等量蛋白質(zhì)以12% SDS-PAGE 分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉后以p-mTOR（1∶2 000）和mTOR（1∶2 000）抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白，以HRP 連接的二抗溫育，洗滌，顯示免疫反應(yīng)條帶，β-actin（1∶5 000）作為內(nèi)參。

1.10 realtime PCR 實(shí)驗(yàn) 海馬組織經(jīng)勻漿器研磨、Trizol 法提取總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)靶基因以及內(nèi)參基因GAPDH 進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)（95℃10 min 后，95℃10 s、60℃30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)），分別取得CT 值，采用2-△△CT法分析各個(gè)樣品的基因相對(duì)表達(dá)差異（表1）。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequence

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0 軟件，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s 表示，多組間比較采用單向方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Neuro-2a 細(xì)胞增殖、凋亡和氧化應(yīng)激 BPA+DEHP 處理可抑制Neuro-2a 細(xì)胞體外增殖，誘導(dǎo)凋亡和氧化應(yīng)激，抑肝散提取物可逆轉(zhuǎn)BPA+DEHP對(duì)Neuro-2a 細(xì)胞體外增殖、凋亡和ROS 的影響（表2～4）。

表2 Neuro-2a 細(xì)胞體外增殖的改變（OD 值，±s，n=10）Tab 2 The changes in Neuro- 2A cell proliferation in vitro（OD value，±s，n=10）

表2 Neuro-2a 細(xì)胞體外增殖的改變（OD 值，±s，n=10）Tab 2 The changes in Neuro- 2A cell proliferation in vitro（OD value，±s，n=10）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與暴露組相比，#P＜0.05；與低劑量組相比，ΔP＜0.05

組別 0 h 24 h 48 h 72 h對(duì)照組 0.11±0.02 0.30±0.04 0.58±0.07 1.03±0.14暴露組 0.11±0.03 0.22±0.05* 0.34±0.05* 0.67±0.08*低劑量組 0.11±0.03 0.28±0.04# 0.47±0.05# 0.75±0.09高劑量組 0.11±0.02 0.29±0.03# 0.55±0.04#Δ 0.86±0.08#Δ F 1.000 7.828 40.002 23.993 P 0.404 0.000 0.000 0.000

表3 Neuro-2a 細(xì)胞凋亡率的改變（%，±s，n=3）Tab 3 The changes in apoptosis rate of neuro-2A cells（%，±s，n=3）

表3 Neuro-2a 細(xì)胞凋亡率的改變（%，±s，n=3）Tab 3 The changes in apoptosis rate of neuro-2A cells（%，±s，n=3）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與暴露組相比，#P＜0.05；與低劑量組相比，ΔP＜0.05

組別 活細(xì)胞 早期凋亡 晚期凋亡 死亡細(xì)胞對(duì)照組 91.87±1.50 1.77±0.45 1.93±0.38 4.43±0.97暴露組 64.80±3.85* 20.97±2.32* 7.67±1.46* 6.57±0.93低劑量組 71.53±6.28 17.47±7.52 6.00±1.31 5.00±0.72高劑量組 82.63±2.64#Δ 8.97±2.43# 3.77±0.51# 4.63±0.51#F 27.072 13.161 17.843 4.376 P 0.000 0.002 0.001 0.042

表4 Neuro-2a 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的改變（±s，n=3）Tab 4 The changes in oxidative stress levels of neuro-2A cells（±s，n=3）

表4 Neuro-2a 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的改變（±s，n=3）Tab 4 The changes in oxidative stress levels of neuro-2A cells（±s，n=3）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與暴露組相比，#P＜0.05；與低劑量組相比，ΔP＜0.05

組別 熒光相對(duì)強(qiáng)度對(duì)照組 露組 1.00±0.08暴2.52±0.72*低劑量組 1.99±0.35#高劑量組 1.38±0.20#Δ F 7.839 P 0.009

2.2 大鼠短期記憶能力分析 各組大鼠Y 迷宮的進(jìn)臂總次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），BPA+DEHP 暴露組大鼠自發(fā)交替正確率顯著降低，抑肝散組大鼠自發(fā)交替正確率有所提高，其中高劑量組正確率顯著提高（P＜0.05）（表5），表明BPA+DEHP 可造成大鼠短期記憶能力下降，而抑肝散提取物可抑制BPA+DEHP 對(duì)大鼠短期記憶能力的損害。

表5 大鼠短期記憶能力的改變(±s，n=12)Tab 5 The changes in rat short-term memory ability(±s，n=12)

表5 大鼠短期記憶能力的改變(±s，n=12)Tab 5 The changes in rat short-term memory ability(±s，n=12)

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與暴露組相比，#P＜0.05

?組別 進(jìn)臂總次數(shù) 自發(fā)交替正確率（%）對(duì)照組 12.00±3.05 63.88±24.06暴露組 11.42±2.94 46.51±14.97*低劑量組 11.17±3.13 54.87±15.60高劑量組 11.50±2.75 60.26±14.40#F 0.165 2.182 P 0.920 0.104

2.3 大鼠海馬組織神經(jīng)標(biāo)志物和線(xiàn)粒體膜電位分析 免疫熒光組化實(shí)驗(yàn)和realtime PCR 結(jié)果均顯示，BPA+DEHP 暴露組大鼠海馬組織中GFAP 表達(dá)上調(diào)，nestin 表達(dá)下調(diào)，海馬組織線(xiàn)粒體膜電位顯著降低，抑肝散組大鼠海馬組織GFAP 表達(dá)下調(diào)，nestin表達(dá)上調(diào)，線(xiàn)粒體膜電位顯著提高，且高劑量組高于低劑量組，表明BPA+DEHP 可損傷大鼠海馬組織神經(jīng)元和線(xiàn)粒體功能，而抑肝散提取物可抑制BPA+DEHP 的上述毒性作用（圖1，表6）。

圖1 大鼠海馬組織中神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)Fig 1 The expression of neural markers in rat hippocampus

表6 大鼠海馬組織神經(jīng)標(biāo)志物mRNA 和線(xiàn)粒體膜電位的改變（±s，n=12）Tab 6 The changes of neuronal marker mRNA and mitochondrial membrane potential in rat hippocampus（±s，n=12）

表6 大鼠海馬組織神經(jīng)標(biāo)志物mRNA 和線(xiàn)粒體膜電位的改變（±s，n=12）Tab 6 The changes of neuronal marker mRNA and mitochondrial membrane potential in rat hippocampus（±s，n=12）

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與暴露組相比，#P＜0.05；與低劑量組相比，ΔP＜0.05

組別 GFAP對(duì)照組 1.00±0.07暴露組 1.35±0.23*低劑量組 1.23±0.09*高劑量組 1.12±0.05*#Δ F 15.742 P 0.000 nestin 1.00±0.07 0.76±0.07*0.80±0.05*0.90±0.07*#Δ 32.283 0.000 MMP 1.00±0.10 0.55±0.12*0.76±0.11*#0.90±0.09*#Δ 40.922 0.000

2.4 大鼠海馬組織氧化和葡萄糖消耗分析 BPA+DEHP 暴露組大鼠海馬組織中Glu、T-AOC 以及還原性物質(zhì)MDA 和GSH 水平顯著降低，抑肝散組大鼠Glu、T-AOC、MDA 和GSH 水平顯著提高（P＜0.05）（表7），表明BPA+DEHP 可增強(qiáng)大鼠海馬組織氧化反應(yīng)，而抑肝散提取物可增強(qiáng)大鼠海馬組織中的抗氧化能力，可能與降低大鼠腦組織葡萄糖消耗有關(guān)。

表7 大鼠海馬組織氧化和葡萄糖水平的改變（±s，n=12）Tab 7 The changes of oxidation and glucose in rat hippocampus（±s，n=12）

表7 大鼠海馬組織氧化和葡萄糖水平的改變（±s，n=12）Tab 7 The changes of oxidation and glucose in rat hippocampus（±s，n=12）

注:與對(duì)照組相比，*P＜0.05;與暴露組相比，#P＜0.05

GSH（μmol）對(duì)照組 4.28±0.67 3.16±0.38 3.54±0.83 5.15±0.73暴露組 2.44±0.58* 2.81±0.56 2.49±0.50* 2.49±0.62*低劑量組 3.92±0.73# 3.00±0.51 2.98±0.65 3.98±0.74*#高劑量組 4.07±0.79# 3.17±0.28 3.28±0.54# 4.02±0.94*#F 17.363 1.722 5.899 24.331 P 0.000 0.176 0.002 0.000組別 T-AOC（mmol/mg prot）Glu（mmol/L）MDA（nmol/mg prot）

2.5 海馬組織凋亡和信號(hào)通路活性 BPA+DEHP暴露組大鼠海馬組織capase-3 活性顯著上調(diào)[暴露組（1.35±0.11）vs.對(duì)照組（1.00±0.08）]（P＜0.05）；高劑量抑肝散組capase-3 活性顯著下調(diào) [低劑量組（1.29±0.07）vs.暴露組（1.35±0.11）]（P＜0.05）[高劑量組（1.19±0.10）vs.暴露組（1.35±0.11）]（P＜0.05），且高劑量組顯著低于低劑量組（P＜0.05），表明BPA+DEHP 的神經(jīng)毒性可能與誘導(dǎo)大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡有關(guān)，而抑肝散提取物可緩解神經(jīng)元凋亡。

BPA+DEHP 暴露組大鼠海馬組織mTOR 磷酸化水平下調(diào)，抑肝散組mTOR 磷酸化上調(diào)，且高劑量組磷酸化低于低劑量組，表明BPA+DEHP 的神經(jīng)毒性可能與誘導(dǎo)mTOR 磷酸化有關(guān)，而抑肝散提取物可抑制mTOR 磷酸化（圖2）。

圖2 大鼠海馬組織中p-mTOR 和mTOR 的表達(dá)Fig 2 The expression of p-mTOR and mTOR in rat hippocampus

3 討論

EEDs 是一種廣泛存在的危險(xiǎn)化學(xué)物質(zhì)，可對(duì)人體內(nèi)分泌、神經(jīng)、免疫和生殖系統(tǒng)功能產(chǎn)生廣泛的危害[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苯并[a]芘暴露可以抑制人胚胎干細(xì)胞來(lái)源擬胚體的體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制間充質(zhì)轉(zhuǎn)變和Akt/GSK-3β 信號(hào)通路活性，提示EEDs 具有顯著的神經(jīng)毒性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，將BPA+DEHP 與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Neuro-2a細(xì)胞共培養(yǎng)，也可以抑制細(xì)胞體外增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生氧化損傷。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，大鼠經(jīng)BPA+DEHP灌胃暴露90 d 后，其短期記憶能力下降，證實(shí)了BPA+DEHP 可損傷神經(jīng)功能的假設(shè)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是退行性病變及中樞神經(jīng)損傷引發(fā)神經(jīng)組織變化的主要表現(xiàn)[8-9]。GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物，與微管和微絲構(gòu)成神經(jīng)元細(xì)胞的骨架，維護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，參與神經(jīng)遞質(zhì)循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)支持、突觸功能調(diào)節(jié)等多種神經(jīng)功能[10-11]。Nestin 是特異性的表達(dá)于神經(jīng)上皮干細(xì)胞上的一種中間絲類(lèi)型的蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)志物[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，BPA+DEHP 暴露可導(dǎo)致大鼠海馬組織中GFAP 表達(dá)上調(diào)，nestin 表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡早期標(biāo)志線(xiàn)粒體膜電位下降、caspase-3 活性升高和mTOR 磷酸化下調(diào)，證實(shí)了BPA+DEHP 可損傷神經(jīng)細(xì)胞增殖能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并提示BPA+DEHP 的神經(jīng)毒性可能與抑制mTOR 信號(hào)通路活性有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，BPA+DEHP 增強(qiáng)海馬組織氧化反應(yīng)可能與提高大鼠腦組織葡萄糖消耗有關(guān)。結(jié)合前期研究，筆者認(rèn)為EEDs 首先通過(guò)抑制生長(zhǎng)和凋亡造成神經(jīng)元損傷[7]，機(jī)體通過(guò)增強(qiáng)能量和營(yíng)養(yǎng)供給修復(fù)神經(jīng)元的損傷，但是由于過(guò)度氧化應(yīng)激激活凋亡途徑，進(jìn)一步的加重了神經(jīng)元損傷，最終造成神經(jīng)失能。

中醫(yī)理論認(rèn)為“肝腦相維”，肝主疏泄，又主藏血，氣機(jī)調(diào)暢，氣血和調(diào)，則腦清神聰，疏泄失常，則情志失調(diào)。抑肝散中包括鉤藤、柴胡、茯苓、白術(shù)、川芎、當(dāng)歸、甘草，其中鉤藤鉤有平肝鎮(zhèn)靜的作用，與柴胡、甘草合用可緩解肝氣亢盛，鎮(zhèn)靜神經(jīng)興奮。當(dāng)歸和川芎滋潤(rùn)肝血，促進(jìn)肝臟血液循環(huán)，疏通肝血，緩解肝氣亢盛，茯苓和白術(shù)可以調(diào)節(jié)肝氣，緩解交感神經(jīng)緊張。本研究通過(guò)乙醇/氯仿提取抑肝散中黃酮等活性成分，并證實(shí)可抑制BPA+DEHP 的神經(jīng)毒性，其機(jī)制可能與增強(qiáng)大鼠海馬組織中的抗氧化能力并調(diào)節(jié)糖代謝紊亂，進(jìn)而緩解由于氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)損傷有關(guān)，并為傳統(tǒng)方劑抑肝散的新劑型開(kāi)發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。