伯氏瘧原蟲紅細胞膜相關(guān)蛋白1 缺失突變體的構(gòu)建和鑒定

魏超，史小雨，王倩

（天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院免疫學系，天津 300070）

瘧疾是一種由瘧原蟲（Plasmodium）感染引起的以按蚊為媒介傳播的感染性疾病，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。雖然我國在2019 年獲得消除瘧疾認證，但根據(jù)世界衛(wèi)生組織不完全統(tǒng)計，2019 年全球仍有大約2.29 億人感染瘧疾，其中40.9 萬人死于該疾病[2]。鑒于目前仍無有效的瘧疾疫苗，因此對瘧原蟲輸出到宿主細胞表面蛋白的研究就顯得尤為重要。

瘧原蟲入侵的成熟紅細胞是終末分化細胞，缺乏細胞器和主要的生物合成過程。當瘧原蟲侵染紅細胞后，會分泌輸出大量蛋白質(zhì)進入宿主紅細胞胞漿和胞膜，導致紅細胞重塑，變形能力降低，促進感染紅細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附，從而使瘧原蟲感染紅細胞逃避脾臟的免疫清除[3-5]。因此，研究瘧原蟲輸出蛋白可以更好地探究宿主紅細胞的免疫原性及免疫逃逸機制，為研制疫苗提供潛在的抗原靶點。紅細胞膜相關(guān)蛋白1（erythrocyte membrane associated protein -1，EMAP1）蛋白是目前在伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei，Pb）中發(fā)現(xiàn)的被運輸?shù)郊t細胞膜的蛋白質(zhì)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，敲除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白PbYop1（P.bergheiYop1），紅內(nèi)期伯氏瘧原蟲生長緩慢，且顯著抑制腦型瘧疾的發(fā)生[7]。對感染紅細胞膜表面蛋白進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，PbYop1 缺失瘧原蟲較野生型瘧原蟲感染紅細胞膜表面的PbEMAP1 表達量降低，推測PbEMAP1 可能與PbYop1 缺失所致的瘧原蟲致病力減低相關(guān)。為研究PbEMAP1對瘧原蟲致病性的影響及其潛在的分子機制，本研究利用瘧原蟲基因敲除常用載體pL0035，構(gòu)建pL0035-ΔPbEMAP1 重組質(zhì)粒，基于雙臂同源重組的原理，在伯氏瘧原蟲中敲除EMAP1，獲得PbEMAP1 缺失的單克隆蟲株，并獲得了特異性識別PbEMAP1的抗體，為后續(xù)研究瘧原蟲輸出蛋白提供必要的分子工具。

1 材料和方法

1.1 材料 伯氏瘧原蟲ANKA 株（clone 15Cy1）由羅格斯大學新澤西醫(yī)學院Purnima Bhanot 副教授提供；大腸桿菌質(zhì)粒載體pL0035 于本實驗室保存（見圖1）；限制性內(nèi)切酶SacⅡ、KpnⅠ、EcoRⅠ、Apa1 和NEBuilder?RHiFi DNA Assembly 試劑盒購于NEB 公司；細胞核轉(zhuǎn)染試劑盒購于Lonza 公司；感受態(tài)細胞Mach1-T1 購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；DIG High Prime DNA 標記及雜交檢測試劑盒Ⅱ購于Roche 公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購于全式金生物有限公司，基因組DNA 提取試劑盒購于QIAGEN 公司。

圖1 pL0035 質(zhì)粒圖譜Fig 1 Plasmid map of pL0035

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1 的構(gòu)建 以野生型PbANKA 基因組DNA 為模板，PCR 合成EMAP1基因編碼區(qū)上、下游同源臂Up HR arm（719 bp）和Down HR arm（763 bp）并引入相應酶切位點（表1）。PCR 擴增條件為：98℃預變性5 min，以98℃30 s，55℃20 s，68℃23 s 為一個循環(huán)，循壞35 次，最后68℃延伸5 min，4℃終止反應。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化。將經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ酶切的pL0035 質(zhì)粒以及Down HR arm 在T4 連接酶的催化下進行連接，得到質(zhì)粒pL0035-Down HR arm。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Mach1-T1 感受態(tài)細胞，涂布到含氨芐的固體培基37℃培養(yǎng)16 h。次日挑取單個陽性菌落接種到含氨芐的液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min，12 h。從菌液中提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定后測序。測序正確的質(zhì)粒Sac2Ⅱ酶切，將Up HR arm 和pL0035-Down HR arm 通過DNA Assembly 方式連接，50℃，30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞后進行氨芐篩選培養(yǎng)，挑取陽性單個菌落擴增并提取DNA 酶切和測序鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1 大量制備后經(jīng)ApaⅠ和EcoRⅠ酶切線性化備用。

表1 PCR 擴增目的片段引物序列Tab 1 Primer sequences of PCR amplification target fragments

1.2.2 瘧原蟲轉(zhuǎn)染 經(jīng)尾靜脈注射凍存的野生型Pb ANKA 株瘧原蟲感染W(wǎng)istar 大鼠。每日取尾尖血制備薄血膜涂片，吉姆薩染色后油鏡下觀察并計數(shù)蟲血率。當蟲血率為3%～5%時，心臟取血進行體外同步化培養(yǎng)16～23 h。次日，制備薄血膜涂片觀察其同步化情況，當80%以上的瘧原蟲發(fā)育為成熟裂殖體時，用碘海醇密度梯度分離液分離裂殖體感染紅細胞備用。取30 μL 裂殖體感染紅細胞、10 μg 線性化的質(zhì)粒和100 μL 的電轉(zhuǎn)液混合后電擊，之后迅速加入100 μL 完全培養(yǎng)基，輕柔混勻后經(jīng)尾靜脈注射感染BALB/c 小鼠。

1.2.3 重組瘧原蟲篩選及單克隆篩選 感染小鼠次日尾尖取血涂片鏡檢，當觀察到有瘧原蟲時，對小鼠給予乙胺嘧啶飲水，進行藥物篩選，發(fā)生基因重組的瘧原蟲獲得耐藥性，可在乙胺嘧啶作用下繼續(xù)生長，從而獲得重組瘧原蟲。當蟲血率增至5%左右時，取血凍存并利用PCR 對瘧原蟲基因型進行初步鑒定。利用有限稀釋法，對鑒定為雜合的瘧原蟲進行單克隆篩選。

1.2.4 Southern 印跡鑒定重組瘧原蟲 PCR 擴增PbEMAP1 Down HR arm（757 bp）DNA 片段作為檢測探針的模板（PCR 擴增探針引物：F:CCCCACATAATGTTCTTTATCAC，R:GCGCTACCATATTGTATGT-CATC），按照Roche DIG High Prime DNA 標記及雜交檢測試劑盒Ⅱ說明書的方法制備地高辛標記的探針；WT 和ΔPbEMAP1 瘧原蟲基因組DNA 經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和HindⅢ消化過夜后，在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳分離；通過毛細管虹吸印跡法將凝膠中的DNA 片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜上；轉(zhuǎn)膜完成后將尼龍膜上的DNA 變性、中和；通過紫外交聯(lián)法將DNA 固定于膜上，預雜交4～6 h；將標記好的探針經(jīng)高溫變性為單鏈后加入雜交瓶中雜交過夜；次日，洗膜后于室溫封閉1 h；加入地高辛抗體（1：10 000）室溫孵育45 min，洗膜后加檢測液孵育5min，均勻滴加CSPD 顯色液后曝光。

1.2.5 多克隆抗體制備 對PbEMAP1 蛋白的序列和結(jié)構(gòu)進行預測分析[8]，避開有二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，挑選3 個肽段（圖2），混合后免疫家兔；然后分別用3個肽段對免疫血清進行親和純化，獲得抗PbEMAP1 蛋白的多克隆抗體。

圖2 預測的PbEMAP1 蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig 2 The predicted three-dimensional structure of the PbEMAP1 protein

1.2.6 蛋白提取和免疫印跡實驗 取20 μL 感染紅細胞，加入200 μL 蛋白裂解液，充分裂解后離心，4℃，10 000 r/min，10 min。取上清至新的EP 管中即瘧原蟲感染紅細胞蛋白樣品。用BCA 法對蛋白樣品進行定量。調(diào)節(jié)蛋白上樣量后與上樣緩沖液混合，65℃，15 min；進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；孵育抗PbEMAP1 抗體（1:500 稀釋），4℃過夜；次日PBST 洗膜3 次，10 min/次；室溫孵第二抗體（1:3 000），1 h；PBST 洗膜3 次，10 min/次；加化學發(fā)光顯色液后曝光。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建PbEMAP1 缺失瘧原蟲的策略 首先在pL0035 質(zhì)粒耐藥標簽hDHFR-yFCU 兩端分別插入PbEMAP1 基因編碼區(qū)上、下游Up HR arm 和Down HR arm 非編碼區(qū)片段，得到重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1?；谕粗亟M的原理，瘧原蟲基因組中EMAP1 被質(zhì)粒上的耐藥標簽替換，即可通過藥物篩選獲得PbEMAP1 敲除的瘧原蟲（圖3）。

圖3 伯氏瘧原蟲PbEMAP1 敲除策略Fig 3 Strategy of PbEMAP1 knockout in Plasmodium berghei

2.2 重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1 的構(gòu)建和鑒定 重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1 的構(gòu)建分為兩步（圖4A）。第一步，以WT 瘧原蟲基因組DNA 為模板，PCR 擴增Down HR arm，同時引入KpnⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點，PCR 產(chǎn)物膠回收（圖4B 左），經(jīng)雙酶切后純化，與KpnⅠ和EcoRⅠ酶切處理的pL0035質(zhì)粒在T4 連接酶的作用下連接、轉(zhuǎn)化，從而將Down HR arm 插入pL0035，得到質(zhì)粒pL0035-Down HR arm，酶切鑒定顯示克?、诤廷蕹晒Σ迦肽康钠危▓D4B 右），測序正確。第二步，以WT 瘧原蟲基因組DNA 為模板擴增Up HR arm，并按照無縫克隆的要求在兩段引入overlap 序列（圖4C 左）；將經(jīng)SacⅡ酶切的pL0035-Down HR arm 通過HiFi DNA Assembly 試劑盒插入Up HR arm 片段，轉(zhuǎn)化后得到重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1，經(jīng)SacⅡ酶切鑒定插入片段大小正確（圖4C 右），測序無誤。

圖4 重組質(zhì)粒pL0035-ΔPbEMAP1 的構(gòu)建和鑒定Fig 4 Construction and identification of recombinant plasmid pL0035-ΔPbEMAP1

2.3 伯氏瘧原蟲轉(zhuǎn)染子基因型鑒定 對轉(zhuǎn)染后的瘧原蟲進行乙胺嘧啶篩選，獲得重組瘧原蟲雜合子，進一步經(jīng)單克隆篩選，最終獲得突變蟲株C4。提取C4 瘧原蟲基因組DNA 進行PCR 初步鑒定（表2），結(jié)果顯示C4 僅有重組子條帶而無野生型條帶（圖5A）。Southern 印跡對C4 瘧原蟲的基因型進行確證，WT 和ΔPbEMAP1 瘧原蟲基因組DNA 經(jīng)EcoRⅤ和HindⅢ酶切后，探針所檢測片段大小分別為3 262 bp和5 975 bp（圖3）。結(jié)果顯示C4 為PbEMAP1 缺失的單克隆蟲株，僅檢測到6 kb 的條帶，而無3 kb 條帶（圖5B）。

圖5 單克隆瘧原蟲ΔPbEMAP1 基因型鑒定Fig 5 Genotype identification of single clone of ΔPbEMAP1 Plasmodium

表2 鑒定重組瘧原蟲基因型引物序列Tab 2 Primers of genotype identification of recombinant Plasmodium

2.4 免疫印跡法驗證PbEMAP1 的敲除 提取WT和ΔPbEMAP1 瘧原蟲蛋白，利用制備的抗PbEMAP1 抗體檢測瘧原蟲EMAP1 蛋白表達水平。結(jié)果顯示野生型蛋白樣品可檢測到38 kD 目的條帶，與EMAP1 蛋白預期分子量相符；ΔPbEMAP1 蛋白樣品在38 kD 處未檢測到信號（圖6），提示制備的抗PbEMAP1 抗體可用于Western 印跡檢測，PbEMAP1缺失瘧原蟲構(gòu)建成功。

圖6 免疫印跡法鑒定ΔPbEMAP1 瘧原蟲Fig 6 Identification of ΔPbEMAP1 Plasmodium by Western blotting

3 討論

在感染人的惡性瘧原蟲中，紅細胞膜蛋白-1（erythrocyte membrane protein 1，EMP1），以依賴瘧原蟲輸出基團（Plasmodium export element，PEXEL）的方式運輸?shù)郊t細胞膜，促進感染紅細胞與內(nèi)皮細胞表面各種受體結(jié)合，如CD36、細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate A，CSA）等，從而避免脾臟的清除，導致多器官功能障礙[9-12]，是瘧原蟲致病的主要因素。

伯氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲（Plasmodiumfalciparum，Pf）類似，采用高度相似的轉(zhuǎn)運機制將自身蛋白輸送到宿主紅細胞[13]。因此，Pb 可以作為研究瘧原蟲蛋白質(zhì)輸出機制以及相關(guān)表型的模型。然而，在Pb 中尚未發(fā)現(xiàn)PfEMP1 的同源蛋白或具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白[14]。PfEMP1 如何運輸?shù)郊t細胞膜上的具體機制尚未完全清楚。PbEMAP1 和PfEMP1 一樣，被運輸?shù)郊t細胞膜上[6]。由于Pb 和Pf 具有相似的蛋白運輸機制，因此研究PbEMAP1 蛋白運輸機制可能為研究PfEMP1 如何運輸?shù)郊t細胞膜上提供新的思路；PbEMAP1 作為分泌到紅細胞膜上的主要蛋白，推測其可能同PfEMP1 一樣，與瘧原蟲致病性相關(guān)；另外還可以將PfEMP1 和內(nèi)皮細胞結(jié)合的肽段嵌合到PbEMAP1基因上，即可在體內(nèi)研究PfEMP1 的具體功能，從而為研發(fā)針對PfEMP1 靶點的藥物提供幫助[15]。

此外，目前構(gòu)建的PbEMAP1 缺失瘧原蟲含有耐藥標簽DHFR-yFCU，該耐藥標簽兩端分別具有一段相同的序列3′pbdhfr/ts，對該瘧原蟲給予5-氟胞嘧啶可進行第二次藥物篩選，即發(fā)生第二次同源重組。再次重組的PbEMAP1 缺失瘧原蟲可因刪除耐藥標簽而存活。在此基礎(chǔ)上可在瘧原蟲常用基因組改造位點230p（PbANKA_0306000）插入PbEMAP1，用于后續(xù)的回補實驗。

綜上所述，本研究基于同源重組的原理獲得PbEMAP1 缺失的伯氏瘧原蟲，從DNA 和蛋白水平對篩選的單克隆重組瘧原蟲進行驗證，并獲得抗PbEMAP1 多克隆抗體，為今后研究PbEMAP1 對瘧原蟲生長發(fā)育及致病力的影響、挖掘潛在的抗瘧藥物靶點提供了必要的分子工具。