基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討補腎健脾方治療卵巢早衰的機制

朱景茹，黃睿婷，林澤豪，王 洋

（福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)證基地，福建 福州 350122）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）好發(fā)于40 歲之前的育齡期女性，是以高卵泡刺激素和低雌激素水平為主要特征的卵巢功能衰退性婦科疾?。?］。據(jù)流行病學統(tǒng)計，POF 在一般人群中的發(fā)病率為1%～3%，在原發(fā)閉經(jīng)的患者中發(fā)病率高達10%～28%，在繼發(fā)閉經(jīng)的患者中發(fā)病率達4%～18%［2］，是導致女性不孕的重要原因之一。目前現(xiàn)代醫(yī)學以周期性激素療法為常用治法，但長時間激素治療容易誘發(fā)不良反應，增加POF 患者發(fā)生乳腺癌、子宮內膜癌的風險［3］。中醫(yī)學認為卵巢中蘊含生殖之“精”，依時排泄以供生殖之需，泄出真元后，卵巢表面形成黃體以維持子宮內膜生長，使之易于容受胚胎著床［4］。有研究認為補腎健脾類中藥對POF 患者各級卵泡的生長均有促進作用，能夠改善卵巢發(fā)育狀態(tài)，促進卵泡顆粒細胞的增殖［5-6］。中藥復方成分的藥效學及其作用機制的研究是中藥現(xiàn)代化的關鍵科學問題，網(wǎng)絡藥理學為中藥化合物作用機理的研究提供新的理論方法和研究思路［7］。本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討補腎健脾方與POF 作用靶點之間的網(wǎng)絡關系，為補腎健脾方治療POF 的作用機制提供一定依據(jù)。

1 方 法

1.1 補腎健脾方活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］檢索補腎健脾方中熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、茯苓、人參、白術、甘草的所有活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件進行藥物靶點過濾、獲取。

1.2 POF 治療靶點的獲取 以“premature ovarian failure”作為檢索詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/）［9］檢索相關疾病靶點，以相關性得分≥20 進行提取。通過Uniport 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org）進行標準化處理，通過InteractiVenn網(wǎng)站（http：//www.interactivenn.net/）獲得韋恩圖，將POF 治療靶點與補腎健脾方的作用靶點進行映射，獲取補腎健脾方治療POF 的共同靶點，繪制補腎健脾方活性成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.3 共同作用靶點互作網(wǎng)絡（PPI 網(wǎng)絡）構建與分析 將共同靶點輸至String 數(shù)據(jù)庫（http：//stringdb.org/）“multiple proteins”檢索框中，物種設置為“homo sapiens”，輸出初始PPI tsv 文件，再使用Cytoscape 3.8.0 軟件構建PPI 網(wǎng)絡，以最低交互分數(shù)≥0.90 為標準篩選出排名前20 名的核心靶點。

1.4 GO和KEGG富集分析 將共同靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/）進行分析，在R 語言中安裝“DOSE”“colorspace”“stringi”“pathview”“clusterProfiler”插件，以P＜0.05 為閾值進行GO 和KEGG富集分析，篩選出前20 名的生物學過程與信號通路。

1.5 分子對接 利用PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到補腎健脾方活性成分的結構信息，在PDB 數(shù)據(jù)庫中檢索核心靶點的結構，最后利用Vina1.1.2 軟件完成補腎健脾方活性成分與前5 位核心靶點的分子對接。

2 結 果

2.1 補腎健脾方活性成分信息 共篩選出補腎健脾方活性成分159 個，列出單味中藥OB 值排名前2位的活性成分信息，見表1。

表1 補腎健脾方活性成分信息

2.2 補腎健脾方活性成分-靶點網(wǎng)絡 共篩選出補腎健脾方作用靶點235 個，將其與347 個POF 治療靶點取交集得到62 個共同靶點，從而獲得補腎健脾方活性成分-靶點網(wǎng)絡。見圖1。

圖1 補腎健脾方活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡分析結果 PPI 網(wǎng)絡中共有62 個節(jié)點，435 條邊，見圖2。根據(jù)Degree 值對節(jié)點進行排序，結果中僅列出排名前20 名的核心靶點，分別為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細胞介素-6（IL-6）、表皮細胞生長因子（EGF）、表皮生長因子受體（EGFR）、基質金屬蛋白酶9（MMP9）、原癌基因（MYC）、信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、細胞周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、環(huán)加氧酶2（PTGS2）、低聚果糖（FOS）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、趨化因子2（CCL2）、白細胞介素-1β（IL-1β）、絲氨酸蛋白酶抑制劑1（SERPINE1）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（MTOR）。見圖3。

圖2 PPI 網(wǎng)絡圖

圖3 排名前20 的核心靶點圖

2.4 GO 和KEGG 富集分析 共獲取GO 條目87個，結果表明補腎健脾方治療POF 的前20 個生物學過程主要富集于DNA 結合轉錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結合、細胞因子受體結合、核受體活性、配體激活轉錄因子活性、類固醇激素受體、泛素蛋白連接酶結合、生長因子受體結合等，見圖4。KEGG 富集分析篩選到129 條信號通路（P＜0.05），前20 條信號通路主要涉及到癌癥中蛋白多糖相關通路、人類巨細胞病毒感染相關通路、HIF-1 信號通路、內分泌抵抗相關通路、AGERAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信 號 通 路等。見表2。

表2 KEGG 富集分析信號通路

2.5 分子對接結果 為了進一步驗證補腎健脾方活性成分-靶點網(wǎng)絡的預測結果，將2.3 中排名前5 位的核心靶點AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF與其對應的活性成分進行分子對接，獲得活性成分與核心靶點分子對接自由能，見表3。自由能＜0 kcal/mol 說明配體與受體可以自發(fā)結合，一般認為兩者結合自由能越低，發(fā)生作用的可能性越大。補腎健脾方活性成分與核心靶點結合自由能均＜-5 kcal/mol，提示篩選出的核心靶點與其對應的活性成分具有良好的親和力。其中，薯蕷皂苷元與AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF 結合自由能最低，親和力最高，分子對接模式見圖5。

圖5 薯蕷皂苷元分子對接模式圖

表3 活性成分與核心靶點分子對接自由能

3 討 論

卵巢早衰歸屬中醫(yī)學中“經(jīng)水早斷”“不孕”等范疇，中醫(yī)認為腎精盈滿，天癸成熟，寓示著女性生殖活動的開始。若腎精衰減，天癸耗竭，月經(jīng)遲閉，則意味著卵巢生殖功能的終結［10］。腎中先天之精與脾胃后天之精皆為卵巢卵泡發(fā)育過程中關鍵的物質基礎，是女性生殖與發(fā)育的根本。若脾腎虧虛，沖任失調，天癸耗竭，則卵巢卵泡無以為養(yǎng)，經(jīng)水漸斷。補腎健脾方是左歸飲（《景岳全書》）與四君子湯（《太平惠民和劑局方》）的合方，由熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、人參、茯苓、白術、甘草8 味藥組成，具有補腎健脾、益氣滋陰的功效。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學分析補腎健脾方活性成分的復雜性和人體潛在調控靶點的多樣性，結果顯示：補腎健脾方的主要活性成分有薯蕷皂甙元、β-谷甾醇、槲皮素、柚皮素、山柰酚等。張永忠等［11］研究表明：薯蕷皂苷元能抑制A547 細胞的生長，誘導細胞凋亡，還有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用；β-谷甾醇具有廣泛的藥理活性，如免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、抑制腫瘤等［12］；槲皮素是黃酮類化合物，可以發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗菌等作用，有效促進顆粒細胞增殖和各級卵泡發(fā)育，增加雌激素分泌，從而改善POF 大鼠的卵巢功能［13-14］；柚皮素是從蕓香科植物柚中提取的一種單體成分，屬于黃酮類化合物，具有較強的清除自由基、抗氧化、抗炎作用［15］；山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、心臟保護、神經(jīng)保護、抗糖尿病、抗骨質疏松、抗雌激素、抗焦慮、鎮(zhèn)痛和抗過敏等活性［16］。

選取前5 個核心靶點AKT1、VEGFA、CASP3、IL6、EGF 與活性成分山柰酚、柚皮素、槲皮素、薯蕷皂苷元和β-谷甾醇進行分子對接驗證，結果顯示核心靶點與活性成分結合活性良好，以薯蕷皂苷元與各蛋白的分子對接結果最好。本研究GO 富集分析結果顯示：補腎健脾方作用于POF 的機制涉及多個生物過程與分子功能，其中相關性最高的生物學過程涉及DNA 結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結合、細胞因子受體結合、核受體活性等。KEGG 富集分析結果顯示：補腎健脾方治療POF 的作用機制與癌癥中蛋白多糖相關通路、人類巨細胞病毒感染相關通路、HIF-1 信號通路、內分泌抵抗相關通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 等密切相關?？梢钥闯觯琍OF 的發(fā)生可能與腫瘤的發(fā)生有關，與巨細胞病毒感染、缺氧炎癥反應也可能密切相關。缺氧是能量代謝、細胞增殖和死亡過程中發(fā)生的一種生理應激，在卵泡發(fā)育過程中，由于基底屏障阻隔了血管向卵泡內部的滲透，卵泡內形成局部低氧環(huán)境［17］，HIF-1 信號通路是生物處于低氧狀態(tài)下的應激信號通路，可通過調節(jié)HIF-1α 功能來保護卵巢功能。TNF-α 與POF 發(fā)生有關，炎癥和相關的氧化應激反應還能通過過早激活原始卵泡使之耗竭，影響正常生殖年齡女性的生育能力［18］。IL-17 水平升高可直接或間接誘導多種細胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白識別介導自身免疫和慢性炎癥反應［19］，炎癥反應增強可促進卵巢功能衰竭，從而參與POF 的發(fā)生。

綜上所述，我們采用網(wǎng)絡藥理學方法初步預測了補腎健脾方治療POF 的作用機制，其可能是通過槲皮素、β-谷甾醇等主要活性成分起到抗炎、抗氧化、免疫調節(jié)的作用，降低炎性因子IL-17 水平來減輕POF 卵巢細胞的缺氧狀態(tài)，調節(jié)HIF-1α 等細胞轉錄因子和蛋白的表達，或通過調控TNF 等信號通路，從而改善卵泡的發(fā)育狀態(tài)，起到治療POF的作用，具有一定的研究價值。為進一步驗證網(wǎng)絡藥理學結果的可靠性，后期有必要開展相應的基礎實驗進一步闡釋補腎健脾方治療POF 的作用機制。