硼中子俘獲治療的理論基礎及其在乳腺癌中的相關 研究*

何曉梁，瞿凡，賴芋州，劉嬙霖，田超

646000 四川 瀘州，西南醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院（何曉梁、瞿凡、田超）；611731 成都，電子科技大學 臨床醫(yī)學院（賴芋州）；601132 成都，成都中醫(yī)藥大學 臨床醫(yī)學院（劉嬙霖）

20世紀30年代，有研究者就提出了硼中子俘獲治療（boron neutron capture therapy，BNCT）來治療癌癥的觀點，它可以選擇性地破壞癌細胞，同時保留正常組織。作為一種潛在有用的癌癥治療工具，BNCT在多形性膠質母細胞瘤、腦膜瘤、復發(fā)性頭頸癌、皮膚黑色素瘤等治療中表現(xiàn)出極大優(yōu)勢?；诖耍醒芯空邔NCT用于乳腺癌的治療中。相較于單一放療，硼藥靶向癌細胞再通過放療極大降低了放療過程中的能量損失以及患者副反應，實現(xiàn)更加精準的治療。本文將圍繞BNCT在乳腺癌中的應用首次作重點闡述，以此來探討乳腺癌新的治療方向。

1 BNCT的原理及發(fā)展狀況

BNCT是一種結合中子輻照和靶向藥物的二元放射治療方式。中子源裝置是完成BNCT的重要組成部分。它的基本原理是利用熱中子與非放射性的10B發(fā)生中子俘獲反應，釋放出兩個高傳能線密度的粒子—α粒子（約150 keV/μm）和7Li粒子（175 keV/μm），這些粒子在組織中的射程與細胞直徑相似，約為5 ～ 9μm。在熱中子照射情況下，α和7Li粒子的殺傷作用僅限于攝取10B藥物的細胞及其緊鄰細胞，對周圍正常組織的輻射損傷較?。?］。BNCT目前在中樞神經系統(tǒng)腫瘤如腦膠質瘤［2-3］、頭頸部惡性腫瘤［4］以及惡性黑色素瘤［5-6］治療中都取得了令人欣喜的結果。早在1936年，有研究者就提出了在癌癥治療中使用中子俘獲反應的想法［7］，1940年Kruger首次報道了BNCT的體外腫瘤實驗，1951年美國麻省總醫(yī)院開展了第1例BNCT臨床實驗。1989年Mishima等［8］第一次將BNCT應用于人淺表組織的黑色素瘤治療。BNCT的基礎研究和臨床研究主要集中在日本和歐美。日本在2020年3月批準了BNCT用于治療不能手術切除的或者局部復發(fā)性頭頸癌，標志著BNCT正式成為臨床上治療腫瘤的手段之一［9］。當前，BNCT正處在高速發(fā)展的窗口期。我國在BNCT的研究上也投入了大量人力、物力并取得了顯著進步。2018年，中科院高能所在廣東東莞建成了我國首臺散裂中子源；2019年12月，BNCT實驗裝置首次打靶成功獲得中子束流；2020年國內首座BNCT治療中心在廣東東莞落成。廈門弘愛醫(yī)院也已落成全球單體最大的加速器型BNCT腫瘤治療中心。這將進一步推動BNCT成為腫瘤一線治療手段的步伐。

2 中子源

中子源裝置一直是阻礙BNCT發(fā)展的重要因素之一［10］。目前可用于BNCT治療腫瘤的中子源主要有反應堆中子源和基于加速器的中子源兩種。絕大多數基礎及臨床研究均選擇能夠提供足夠中子通量的核反應堆作為中子來源。截止到2019年底，全球仍然活躍的BNCT反應堆包括日本KURR、中國臺灣THOR、阿根廷RA-6、北京IHNI及波蘭MARIA反應堆 ，其中KURR與THOR均已到運行年限而停運。考慮到核反應堆造價高以及安全性等因素，反應堆BNCT設施將逐步退出舞臺。BNCT所用中子源需滿足兩個條件: 射束開口的中子通量必須大于109n·cm-2·s-1；中子必須有足夠高的能量以穿透腫瘤組織。近年來，加速器驅動中子源的發(fā)展開啟了BNCT技術蓬勃發(fā)展的新局面。用于BNCT治療的加速器主要有回旋加速器、電磁直線加速器、靜電直線加速器三種。這種中子源利用質子加速器出射的質子和低原子序數物質反應得到中子。其安裝簡便、運行維護成本低、占地面積小、安全穩(wěn)定，適合醫(yī)院應用。目前，日本、中國、芬蘭、美國、俄羅斯等國都在積極推進加速器硼中子治療（accelerated based BNCT， AB-BNCT） 裝置的研究與建設［11-12］。TAE生命科學（Foothill Ranch，CA，USA）正在開發(fā)他們自己的小型加速器，更方便BNCT的實施。俄羅斯計劃與布德科爾核物理研究所合作建造了一種新型的粒子加速器 —— 真空絕緣的串聯(lián)加速器。同時，在日本和芬蘭，基于AB-BNCT的臨床試驗也正在積極開展中［13-14］，如果臨床試驗成功，BNCT無疑將在臨床應用和發(fā)展方面展現(xiàn)出巨大前景。

3 硼遞送劑

硼遞送劑能否被腫瘤特異攝取直接決定了BNCT的治療效果。20世紀50年代，硼酸及其衍生物首次應用于臨床試驗，但這些是基本的化合物，不僅缺乏腫瘤靶向性，還有一定的生物毒性，導致人體產生急性放射副反應，最終以失敗告終。1968年，日本神經外科醫(yī)師畠中坦教授使用硫基十二硼烷二納鹽（sodium mercaptoundecahydro-closo-dodecaborate ，BSH）藥物進行了日本首例 BNCT臨床治療研究［15］。1987年，日本神戶大學的三島豊教授首次使用（L）-4-二羥基硼基苯丙氨酸（L-boronophenylalanine，BPA）進行皮膚黑色素瘤的BNCT臨床試驗［16］，開啟了BPA靶向藥品在 BNCT上的應用。目前被FDA批準用于臨床研究的 BNCT藥物僅有BSH和BPA，其中BPA于2020年3月在日本獲批上市，這是全球首個獲批上市的BNCT臨床藥物。硼遞送劑須滿足：（1）與腫瘤細胞結合特異性高；（2）每個腫瘤細胞內至少聚集109個10B原子或每克腫瘤組織中至少含20μg10B原子；（3）對正常組織無毒性，且在正常組織及血液中快速代謝而在腫瘤細胞滯留較長時間；（4）腫瘤組織與正常組織硼濃度比值 ＞ 3～4∶1。在腫瘤周圍的正常組織細胞中的氫和氮也可發(fā)生中子俘獲反應，只有當腫瘤組織硼濃度顯著高于正常組織，才能在最大限度殺死腫瘤細胞的同時，盡可能降低對周圍正常組織損傷。即使當前新型硼攜帶劑包括卟啉類、氨基酸類、核苷酸類、樹枝狀大分子硼攜帶劑、單克隆抗體類硼攜帶劑、脂質體、納米微粒等都不能完全符合上述條件。

為了更好地將10B送到腫瘤細胞中，還需研制更新的硼藥運載工具和保護措施，比如給含硼多肽鍍一層膜，利用脂質體把大量的10B包裹起來防止它在被吸收前發(fā)生水解；為了增加親腫瘤效果，給硼藥分子嫁接上靶向特定腫瘤受體的配體如上皮生長因子受體［17］和葉酸受體以及利用仙臺病毒的外殼來包裹硼-10等。在給藥方式上研究者們也在逐步摸索，Capuani等［18-19］研究在體外C6膠質瘤細胞或體內動物模型腫瘤中使用L-DOPA預處理后，可顯著提高腫瘤細胞中的硼含量，Barth等［20-21］研究設計經頸動脈灌注高滲性甘露醇溶液以暫時滲透性開放血-腦脊液屏障以提高神經系統(tǒng)腫瘤細胞中的硼含量。但這些研究尚未進入臨床階段，目前只有BPA和BSH可以在臨床中使用。研發(fā)將足量的硼遞送到腫瘤細胞并能長期滯留的新型硼藥仍是BNCT技術發(fā)展與療效提升的一個熱點問題。

4 BNCT在乳腺癌中的相關研究

根據世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構發(fā)布2020年全球最新癌癥負擔數據顯示，乳腺癌發(fā)病率已經超過肺癌，位居首位［22］。當前BNCT在乳腺癌中的研究仍主要集中在高效硼遞送劑的研發(fā)，圍繞BPA、BSH優(yōu)化給藥模式和給藥方式［23］。

4.1 納米材料作為硼遞送劑的研發(fā)

納米結構化合物因其光學，機械和化學特征以及操縱和調節(jié)復雜生物過程的可能性而脫穎而 出［24］。 Li等［25］驗證了氮化硼納米顆粒（boron nitride nanoparticles ，BNNPs）在三陰性乳腺癌治療中的有效性。BNNP 被一種相變溶菌酶（phase-transitioned lysozyme，PTL）包裹形成PTL@BNNP，可保護BNNP在血液循環(huán)過程中不被水解，富集在三陰性乳腺癌細胞胞質中，俘獲治療后可通過維生素C觸發(fā)降解，同時螯合放射性同位素離子用于PET成像。包被的BNNP在保持良好的腫瘤與非腫瘤比率的同時顯示出較高的腫瘤硼累積。經小鼠尾靜脈注射PTL@BNNPs后24小時腫瘤攝取量為6.18%±2.18% ID/g。含硼量在腫瘤與血液、腫瘤與肌肉和腫瘤與脂肪的比率分別高達2.71±0.96、8.32±1.07 和 5.96±0.37，這至少與BPA、BSH的比率相等，甚至更好。作為一種納米級含硼藥物，PTL@BNNPs 有效改善了小分子含硼藥物硼含量低、靶向性差的不足。同時，體內實驗表明，攜帶4T1細胞的小鼠注射PTL@BNNPs后24小時經中子照射后顯示，與空白組相比，腫瘤生長至少延遲10天，照射后第21天PTL@ BNNPs小鼠的腫瘤體積（325±71）mm3遠低于空白組 （1485±205）mm3，PTL@BNNPs+中子組小鼠存活時間比其它組（包括空白組、僅PTL@BNNPs組和僅中子照射組）延長。對小鼠解剖后的主要器官進行蘇木精-伊紅染色（H&E）也未顯示出明顯組織學異常。該策略不僅利用BNNP的高硼含量抑制殺死腫瘤細胞，還成功地對BNNP進行了按需降解，避免了納米顆粒長期累積造成的潛在毒性，有望成為BNCT治療的有效載體。

納米級共價有機聚合物也具有高效硼載荷能力。Shi等［26］制備了一種新型碳硼烷負載納米共價有機聚合物（carborane-loaded nanoscale covalent organic polymers，BCOPs）。通過改進得到BCOP-5T經1，2-二硬脂酰-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-［氨基（聚乙二醇）］（DSPE-PEG）功能化形成穩(wěn)定的水相納米顆粒。在加入中子輻照后，4T1乳腺癌荷瘤小鼠表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制作用。同時未觀察到明顯的物理組織損傷和異常行為，表明硼輸送是成功的，并且具有腫瘤選擇性。通過調整給藥頻率，可有效改善腫瘤細胞對硼的攝取，試驗得出三次單獨注射的腫瘤硼濃度為（84.93±2.68）ppm明顯高于單次注射（55.24±2.13）ppm，三次單獨注射的腫瘤與肌肉、腫瘤與血液的比率分別為25.20±3.41、7.46±0.66明顯優(yōu)于單次注射瘤肌比1.46±0.76和瘤血比0.81±0.44。經DSPE-BCOP-5T輸注和中子輻射后的腫瘤生長率低于其他組，存活時間顯著延長。經H&E染色分析試驗器官沒有明顯的病理損傷或變化。這表明DSPE-BCOP-5T可以作為一種有前途的疏水性藥物載體。Heide等［27］介紹了一種名為右手螺旋線圈納米管的非傳統(tǒng)藥物遞送裝置，可以有效攝取o-碳硼烷C2B10H12，并將其輸送到腫瘤細胞中用于BNCT。但目前尚未有在乳腺癌中的相關研究。

4.2 脂質體作為硼遞送劑的研發(fā)

脂質體作為硼運載工具通過增強滲透性和滯留效應在大多數腫瘤中被動累積。Kueffer等［28-29］使用富含硼的脂質體作為遞送系統(tǒng)，提供兩種硼簇化合物，K［nido-7-CH3（CH2）15-7，8-C2B9H11］（MAC）和 Na3［1-（2’-B10H9）-2-NH3B10H8］（TAC）。它們攜帶高硼有效載荷，還具有高水溶性和極低的毒性。在給患有EMT6乳腺腫瘤的小鼠單次注射200μL脂質體（注射劑量為342μg硼，每克體重17μg10B）化合物48小時后，腫瘤/血硼比率（2.76∶1）達到最高。雙次注射方案即200μL脂質體注射（每次注射371μg硼，每克體重18.6μg10B）間隔24小時，腫瘤中硼清除延遲導致腫瘤組織中的硼水平達到峰值時間在第一次注射54小時后，硼濃度為每克腫瘤 67.8μg10B。腫瘤/血液硼比為 1.88∶1。到達96小時時，比率達到最高為 5.66∶1。與單次注射相比，雙次注射方案在所有組織中獲得了更高的硼峰值濃度。研究者以雙注射方案為例，將54小時的時間點作為最合適輻射研究，通過改變中子照射持續(xù)時間進行研究。單次30分鐘照射時，BNCT組治療小鼠在第14天腫瘤體積僅增加了424%，純中子照射的小鼠腫瘤體積增加了737%，對照組（既不注射也不照射）小鼠的腫瘤體積增加了1 551%。間隔7天施行兩輪 BNCT照射后14天，腫瘤體積僅增加 186%；到了21天，增長也只有297%。圍繞TAC和MAC改進給藥方式以及改變中子輻照時間驗證了BNCT在乳腺癌小鼠模型治療中的可行性，為進一步實驗設計提供了新思路。

Khan等［30］也驗證了富硼脂質體制劑可提供高效載荷。實驗設計一組EMT-6荷瘤小鼠接受中子輻射，另一組不接受輻射，只接受脂質體進行生物分布，富硼脂質體全身給藥后54小時，腫瘤/血硼比為10∶1。BNCT顯著抑制了EMT-6小鼠的腫瘤生長，抑制的顯著點開始于第15天（P = 0.04），并持續(xù)增加，直到研究結束于22天（P = 0.001）。在給藥方式上直接注射富硼脂質體的腫瘤在caspase活性方面的初始輻射效應高于全身注射富硼脂質體的腫瘤，直接瘤內注射富硼脂質體的總體腫瘤抑制率低于接受全身給藥的小鼠。這可能是腫瘤內硼的輸送產生急性效應。全身注射富硼脂質體對腫瘤生長的長期影響更高，這可能是由于免疫系統(tǒng)調節(jié)產生長期效應。但BNCT誘導產生免疫調節(jié)反應有待進一步研究。

4.3 其他載體作為硼遞送劑的研發(fā)

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA） IX在乳腺癌及間皮瘤中高表達［31］，參與調節(jié)有利于腫瘤細胞生長和存活的細胞內pH值，同時促進腫瘤細胞侵襲［32］?；贑AIX抑制劑的新型抗腫瘤療法在臨床上受到了密切關注。Alberti等［33］設計一種磺胺基功能化碳硼烷（sulfonamido-functionalised-carborane，CA-SF）同時作為CAIX抑制劑和硼遞送劑。為了評估BNCT結合CAIX 酶抑制劑能力的治療效果，實驗分為未經處理的細胞和經CA-SF處理的細胞，均經熱中子輻照，結果表明經CA-SF處理的細胞在輻照處理后存活率顯著降低，協(xié)同CA-SF+BNCT 治療明顯優(yōu)于CA-SF單藥治療。協(xié)同毒性作用這一發(fā)現(xiàn)為BNCT與靶向細胞療法聯(lián)合治療癌癥提供了有力支撐。

據報道，已合成的姜黃素類似物五甲草酮-0（PGB-0）對乳腺癌細胞具有親和力［34-36］，擁有良好的攝取、微分布、低外排能力，可作為BNCT治療乳腺癌潛在的硼載體。然而這種化合物不溶于水，導致細胞攝取量低，適用性有限。Susidarti等［37-38］在此基礎上成功開發(fā)了兩種PGB-0-糖配方，即PGB-0-山梨醇（PGB-0-So）和 PGB-0-果糖（PGB-0-F），僅僅降低其溶解度，對細胞攝取沒有影響。在Andoh 等［39］研究中提到將果糖與BPA結合形成果糖復合物（BPA Fr）用于研究人乳腺癌荷瘤小鼠骨轉移的治療效果。試驗分BNCT組（BPA Fr給藥后中子照射）、冷對照組（BPA Fr給藥后無中子照射）、熱對照組（給予生理鹽水后中子照射）。給藥1小時后，腫瘤內的硼濃度達到最高（22.8±5.8） ppm。通過量化BNCT后植入區(qū)域內的生物發(fā)光信號來評估腫瘤生長的情況。植入13周后，BNCT組的生物發(fā)光信號與熱對照組有顯著差異（P ＜ 0.05）。在無病理性骨折BNCT組中生物發(fā)光信號隨著時間推移而減少，骨溶解隨著時間的推移而減少。植入后8周的無病理性骨折BNCT組的H&E染色未檢測到腫瘤細胞。腫瘤被選擇性地破壞，周圍的正常骨組織沒有受到損害。實驗表明BNCT不僅有助于減小腫瘤體積，而且有助于骨轉移部位的骨重建。原因尚不清楚，需要進一步研究。

Utomo等［40］將 PGB-0溶解在乙醇中合成五甲草酮-0-醇（PGB-0-ol），表現(xiàn)出比 PGB-0 更高的水溶特性。使得在殺死癌細胞方面比PGB-0更有效。盡管PGB-0及其衍生物表現(xiàn)出作為硼載體的潛在優(yōu)勢，但在細胞攝取、在腫瘤組織中的微觀分布以及細胞毒性方面未見大量研究數據，期待后續(xù)有更多相關報道。

5 總 結

國家發(fā)改委發(fā)布的2017年第1號公告已將BNCT系統(tǒng)及其靶向藥物列入我國“十三五”國家戰(zhàn)略性新興產業(yè)發(fā)展規(guī)劃。BNCT因其雙靶向精準定位、治療療程短、發(fā)展性高、生物效應殺傷力強、適應癥廣成為高效的腫瘤精準治療方式［41］。但在乳腺癌中的應用尚且處于細胞及動物實驗階段，臨床階段研究較少，發(fā)展緩慢。目前仍需進一步深入研究基于加速器型的BNCT系統(tǒng)、硼攜帶劑的藥代動力學、中子能譜的評價以及相關的專業(yè)人才培養(yǎng)等問題，改進硼攜帶劑，提升腫瘤/正常組織硼濃度比提升BNCT療效，以期為乳腺癌治療提供新的可能和希望。