蜂王漿中甾體激素類物質(zhì)檢測(cè)分析研究進(jìn)展

李 錚 楊 靜 焦麗麗 李 慧 吳 巍

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130000；2. 通化吉通藥業(yè)有限公司，吉林 通化 134000)

蜂王漿(Royal Jelly，RJ)，又名蜂皇漿、皇漿，是工蜂咽腺分泌的一種漿狀物質(zhì)[1]，具有抗衰老[2-3]、調(diào)節(jié)生育[4]、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)[5]等功效。在蜂王漿中除水分、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類(脂肪酸)等成分外[6]，還存在一類小分子化合物甾體激素，這類化合物對(duì)人體的功能調(diào)節(jié)具有十分重要的作用[7]。

甾體激素又稱類固醇激素，是一類四環(huán)脂肪烴化合物，其母核為環(huán)戊烷多氫菲。已有研究表明在RJ中存在多種甾體激素，如雌二醇[8-11]、雌三醇[8-9]、雌酮[8-9,12]、孕酮[10,12]、睪酮[10-11]、糖皮質(zhì)激素[13-15]等。這些甾體激素在膽固醇和脂肪酸的代謝[16-17]、抑制早期肝癌發(fā)展[18]、降低冠心病發(fā)病率[19]、降低子宮出血和子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險(xiǎn)[20-21]等過程中起到關(guān)鍵作用。但甾體激素是RJ中的痕量激素，提取難度大，因此鮮有關(guān)于RJ甾體激素檢測(cè)的研究報(bào)道。文章擬綜述國(guó)內(nèi)外關(guān)于RJ甾體激素檢測(cè)技術(shù)的研究現(xiàn)狀，以期為構(gòu)建一種簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確應(yīng)用于檢測(cè)RJ甾體激素的方法提供理論支撐。

1 RJ中甾體激素檢測(cè)前處理方法

目前有關(guān)RJ中甾體激素的前處理并沒有特殊方法，以常規(guī)激素類成分前處理方法為主。激素類成分常用的前處理方法為：液液萃取法[22-23]、固相萃取法[24]、QuEChERS[25-26]、微波輔助萃取法[27]、固相微萃取法[28]等，前3種方法在RJ甾體激素的提取中應(yīng)用較多。

1.1 液液萃取法

曹均等[10]將RJ用少量水進(jìn)行水解后，加入無水乙醇萃取，可得到雌二醇、睪酮、孕酮3種甾體激素。Sidor等[11]將RJ用適量蒸餾水溶解后，在組織勻漿器中(15 000 r/min)勻漿2 min, 4 ℃下以10 000 r/min離心20 min，上清液用0.45 μm尼龍注射器過濾，4 ℃保存。采用液液萃取法操作簡(jiǎn)便、處理樣品量大，但該法耗時(shí)較長(zhǎng)、有機(jī)溶劑消耗量大[29-30]。

1.2 固相萃取法

王強(qiáng)[9]在提取RJ中雌激素時(shí)，以乙酸鈉溶液作為緩沖液，乙腈、乙酸乙酯作為提取液，隨后用Oasis HLB小柱和Bond Elut-NH2小柱進(jìn)行連續(xù)凈化，二氯甲烷—甲醇為洗脫液，可得到雌二醇、雌三醇、雌酮等雌激素。Ma等[12]在研究中用固相萃取法對(duì)蜂蜜中的雌激素進(jìn)行提取，用試劑將樣品溶解后在HLB柱上上樣，以乙酸甲醇混合液淋洗，10%甲醇—乙酸乙酯、甲醇—氨水洗脫，洗脫液吹干后復(fù)溶，可得到雌酮、孕酮。劉素琴等[13]采用固相萃取法對(duì)蜂蜜中的雌激素進(jìn)行提取，將HLB柱活化上樣后，用10%甲醇水、10%甲醇氨水、20%四氫呋喃水進(jìn)行淋洗，洗脫液吹干復(fù)溶，可得到雌酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、己烷雌酚和雙酚A 6種雌激素。錢艷等[14]將RJ經(jīng)乙酸銨緩沖溶液、β-葡萄糖醛酸苷酶、甲醇等溶劑溶解處理后，HLB柱吸附，適當(dāng)比例甲醇、水淋洗后，甲醇洗脫，洗脫液過氨基柱，得到氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍等7種糖皮質(zhì)激素。固相萃取法的有機(jī)溶劑消耗少，既可做到富集又可除雜，但該法缺乏專屬性與專一性。

分子印跡技術(shù)(MIT)是固相萃取方法之一，以某一特定的所需分子為模板分子，制備具有高選擇性聚合物[31]。Dong等[32]將模板分子與功能單體甲基丙烯酸、交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸及引發(fā)劑偶氮二異丁腈混合后采用紫外光照法引發(fā)聚合，制得的分子印跡聚合物可用于污水中的雌激素的檢測(cè)。采用紫外光照法制備的分子印跡聚合物均能夠從污水、牛奶、肉制品中檢測(cè)出雌激素，且濃度范圍內(nèi)線性良好，可應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中[33-35]。區(qū)別于其他固相萃取法，MIT具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、專屬性、專一性，非常適合分離富集復(fù)雜樣品中痕量成分。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于中藥研究的部分領(lǐng)域，主要包括中藥中有效成分的提取分離、凈化富集、成分測(cè)定及活性成分篩選等方面[36-37]。綜上，該技術(shù)可應(yīng)用于RJ中甾體激素的檢測(cè)。

1.3 QuEChERS法

QuEChERS是一種以基質(zhì)固相分散為基礎(chǔ)的快速樣品處理技術(shù)，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，目前在農(nóng)殘檢測(cè)中較為常用[38-39]。張文文[8]將RJ溶于乙酸鋅溶液以沉淀蛋白，用適量乙腈、二氯甲烷萃取上清液，隨后加入鹽包Na2SO4，PSA作為凈化材料去除RJ中極性物質(zhì)，以丹磺酰氯—丙酮溶液作為衍生化試劑，得到雌二醇、雌三醇、雌酮。李璐等[15]采用QuEChERS技術(shù)對(duì)蜂蜜中的糖皮質(zhì)激素進(jìn)行提取。以乙腈作為提取溶劑，PSA、C18作為固相萃取劑，獲得甲基潑尼松龍等糖皮質(zhì)激素。該法回收率高、準(zhǔn)確度高、溶劑消耗少，但凈化效果較差且缺乏專一性。

1.4 其他方法

微波輔助萃取法具有溶劑消耗少、萃取時(shí)間短、有機(jī)物完全分解、樣品提取多等優(yōu)點(diǎn)[40]。Hibberd等[41]采用該法對(duì)河流沉積物中的雌激素進(jìn)行萃取，首先以甲醇為萃取劑并進(jìn)行微波加熱，隨后采用固相萃取法凈化樣品，最后進(jìn)行衍生化，成功得到雌酮、雌二醇、雌三醇。該法需要對(duì)樣品進(jìn)行加熱，但RJ受熱易分解，因此該法尚未應(yīng)用于RJ前處理。

固相微萃取法比固相萃取法所需樣品量更小，溶劑消耗量更少，并且可達(dá)到集分離、濃縮、進(jìn)樣于一體的效果[42]。姚鍵梅等[43]通過衍生瓜環(huán)固相微萃取攪拌棒法結(jié)合HPLC-UV可檢測(cè)出動(dòng)物源性食品中“痕量”雌激素。鄧鑫雨等[44]制備MIL-101(Cr)填充針頭式過濾器并結(jié)合HPLC-FLD對(duì)水中雌激素進(jìn)行分離富集，在試驗(yàn)范圍內(nèi)線性良好。目前微波輔助萃取法和固相微萃取法均未見應(yīng)用于RJ中甾體激素的檢測(cè)，因此可進(jìn)一步研究這兩種方法應(yīng)用于RJ甾體激素檢測(cè)的可能性。

綜上，在RJ前處理過程中，液液萃取法一般以乙酸鈉、乙酸銨為緩沖溶劑，乙腈為萃取劑，固相萃取法一般選用HLB小柱吸附，淋洗液多選用甲醇混合溶液，洗脫液多選用甲醇—乙酸乙酯。RJ經(jīng)過前處理，可獲得甾體激素，其中固相萃取法效果最佳，這是由于該法可以同時(shí)完成樣品的分離和富集，提高了檢測(cè)靈敏度，縮短預(yù)處理時(shí)間、節(jié)省溶劑且重現(xiàn)性好[45]。由此認(rèn)為固相萃取法可作為提取RJ中甾體激素的前處理的最優(yōu)方法。但普通的固相萃取法仍存在缺乏專一性、回收率不高、樣品損失等問題，由此認(rèn)為采用具有高專屬性、高選擇性的分子印跡技術(shù)作為前處理方法,能夠更好地提取富集目標(biāo)化合物，利于檢測(cè)。

2 RJ中甾體激素檢測(cè)分析方法

目前，甾體激素的分析檢測(cè)方法包括高效液相色譜—質(zhì)譜法(HPLC-MS)[46-48]、氣相色譜—質(zhì)譜法(GC-MS)[49-50]、放射免疫測(cè)定法[51]、酶聯(lián)免疫吸附法[52]等。

2.1 HPLC-MS法

HPLC-MS技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)少等特點(diǎn)[53]。王強(qiáng)[9]采用高效液相色譜—四級(jí)桿時(shí)間飛行質(zhì)譜法(HPLC-Q-TOF MS)對(duì)RJ中的雌激素進(jìn)行檢測(cè)，選用C18色譜柱，以甲醇和水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，選用ESI-作為離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，該方法無衍生，最終結(jié)果顯示檢出限(LOD)為2.4～5.0 μg/kg，定量限(LOQ)為5.2～10.6 μg/kg，回收率為64.5%～86.3%。張文文[8]通過HPLC-MS/MS檢測(cè)RJ中的雌激素，選用C18色譜柱，以0.1%甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，選用ESI+、ESI-作為離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，最終結(jié)果顯示LOD為0.015～0.020 ng/kg，LOQ為0.1 ng/kg，回收率為80.7%～113.0%。在實(shí)際237批次RJ樣品中檢測(cè)出了雌三醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇以及雌酮4種雌激素，其中17β-雌二醇檢出率最高。Ma等[12]采用超高效液相色譜—質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中甾體激素進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱選用C18，以氨水及乙腈甲醇混合液為流動(dòng)相，選用ESI-為離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明該方法的LOD為0.01～0.33 μg/kg，加樣回收率為71.2%～99.7%。劉素琴等[13]采用超高效液相色譜—質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中甾體激素進(jìn)行檢測(cè)， 選用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18作為色譜柱，以氨水及乙腈甲醇混合液為流動(dòng)相，選用ESI-作為離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明LOD和LOQ分別為0.04～0.19 μg/kg和0.15～0.62 μg/kg,6種雌激素加標(biāo)回收率為78.5%～112.9%。李璐等[15]采用超高效液相色譜—質(zhì)譜法對(duì)蜂蜜中甾體激素進(jìn)行檢測(cè)，選用C18色譜柱，以乙酸水(含0.1%)作為流動(dòng)相，選用ESI+作為離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明41種糖皮質(zhì)激素LOQ為0.55～3.90 μg/kg，加樣回收率為83.9%～111.2%。錢艷等[14]采用液相色譜—質(zhì)譜法對(duì)RJ進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱選用C8，流動(dòng)相為乙腈和水，選用ESI+作為離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明LOD均為10 μg/kg，加樣回收率為84.7%～100.0%。

2.2 GC-MS法

GC-MS具有檢測(cè)識(shí)別特異性，但需要對(duì)所檢測(cè)的樣品進(jìn)行衍生化，在此過程中待測(cè)樣品可能出現(xiàn)一定量的損失[54]。王強(qiáng)[9]利用GC-MS分析RJ中雌激素，選用HP-5 MS石英毛細(xì)管色譜柱，載氣為高純He，恒流脫氣，選用EI作為離子源，以離子監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜掃描，除上述操作外，試驗(yàn)前需使用吡啶和衍生化試劑對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行衍生化，結(jié)果表明LOD為1.8～3.3 μg/kg，LOQ為5.3～7.4 μg/kg，回收率為63.5%～75.5%。

2.3 其他方法

放射免疫法(RIA)指利用同位素標(biāo)記的抗原和未標(biāo)記的抗原與抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)，從而檢測(cè)生物體內(nèi)各種物質(zhì)的方法。曹均等[10]采用放射免疫法對(duì)RJ中3種雌激素(雌二醇、睪酮和孕酮)進(jìn)行分析檢測(cè)，操作如下：取經(jīng)過前處理包含待測(cè)物的上清液加入閃爍液一并放入閃爍儀中進(jìn)行測(cè)定，三者平均含量分別為4.167，1.082，1.167 μg/kg。

酶聯(lián)免疫是基于抗原與抗體的特異性非放射性反應(yīng)的方法[55]。Sidor等[11]嚴(yán)格使用酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測(cè)試劑盒證明了該法可測(cè)試蜂制品中睪酮和雌二醇的活性，研究表明蜂王漿中睪酮平均含量為1.961 μg/kg，雌二醇平均含量為289.98 μg/kg。此外，Swart等[56]、Manickum等[57]均采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)出污水中含有雌酮、雌二醇、雌三醇等雌激素，且檢測(cè)限均到達(dá)0.2～5.0 ng/L，因此，酶聯(lián)免疫法是一種有效檢測(cè)雌激素的分析方法。

在采用放射免疫法時(shí)，由于不同廠家所提供的RIA試劑盒準(zhǔn)確性會(huì)出現(xiàn)差異，且該技術(shù)操作復(fù)雜，因此該法不利于檢測(cè)[58]。酶聯(lián)免疫吸附法容易出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致定量檢測(cè)準(zhǔn)確度降低。HPLC-MS、GC-MS等分析方法近年來較為常用，具有高靈敏度、低檢測(cè)限等優(yōu)點(diǎn)，但甾體激素本身具有難以揮發(fā)的特性，使用GC-MS法時(shí)在進(jìn)樣前需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還會(huì)在一定程度上造成樣品損失，因此HPLC-MS是最適合檢測(cè)RJ甾體激素的方法。

3 總結(jié)與展望

目前關(guān)于蜂王漿的研究較多，而甾體激素作為峰王漿中一種“痕量”成分卻鮮有人開發(fā)利用。分子印跡技術(shù)作為前處理方法能夠有效提高目標(biāo)化合物富集率，高效液相色譜—質(zhì)譜作為檢測(cè)手段能夠更快捷、更靈敏地檢測(cè)出目標(biāo)化合物。因此，以分子印跡技術(shù)與高效液相色譜—質(zhì)譜為基礎(chǔ)，建立出一套擁有良好方法學(xué)考察結(jié)果的分析方法或?qū)⒊蔀榻酉聛淼难芯恐攸c(diǎn)。