顱內外動脈狹窄患者血清中6個miRNAs的差異表達及意義*

袁平 李其玲 周陽 李經綸 周翔宇

(1.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科，四川 瀘州 646000；2.隆昌市人民醫(yī)院神經內科，四川 隆昌 642150；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院甲狀腺血管外科，四川 瀘州 646000；4.德陽市人民醫(yī)院血管外科，四川 德陽 618000)

腦卒中是全球主要的致殘及死亡病因之一，缺血性卒中更是占到所有急性卒中的87%，顱內外動脈狹窄是其主要誘發(fā)因素[1]。miRNAs(小型非編碼RNA)逐漸成為中風發(fā)病機制中的關鍵因素，并參與關鍵代謝的調控、炎癥和血管生成[2]。研究顯示，miRNAs可以介導動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，從而致使顱內外動脈狹窄，其主要是通過調控脂質代謝，影響血管平滑肌細胞的增殖、遷徙以及細胞外基質的合成與降解等表型功能實現(xiàn)的[3]。但有關miRNAs在顱內外動脈狹窄患者中的作用仍有待進一步證實。因此，本研究旨在探討顱內外動脈狹窄患者血清中一系列miRNAs的表達水平并分析其臨床相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年9月～2018年12月西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科收治的99例急性缺血性腦卒中患者。其中，男性74例，女性25例，平均(60.19±9.96)歲。依據(jù)腦血管造影(Angiography,DSA)結果分為對照組(顱內外動脈無狹窄，NOCS組，n=33)和狹窄組(n=66)。狹窄組按狹窄部位分為ICAS組(單純顱內動脈狹窄，n=24)、ECAS組(單純顱外動脈狹窄，n=18)、COMS組(顱內外動脈均有狹窄，n=24)；按狹窄程度分為輕度、中度、重度狹窄組。納入標準：①診斷明確的缺血性腦卒中患者按照《2014年中國急性缺血性腦卒中診療指南》臨床診斷標準。②診斷明確的顱內外動脈狹窄患者按照《2015中國缺血性腦血管病血管介入診療指南》臨床診斷標準。③患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①血液病、動靜脈畸形、動脈炎、動脈剝離、惡性腫瘤等非動脈粥樣硬化因素引起的缺血性腦卒中。②由心源性栓塞或其他明確栓子引起腦栓塞的患者。③嚴重心、肝、腎功能不全患者。④任何原因導致不能或不愿配合檢查的患者。本研究通過西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 標本收集 采集腦卒中患者靜脈血約3 mL，放入含EDTA的試劑管中，并迅速以3000 r/min離心15 min。之后，無酶EP管中收集上清200 μL，轉移至-80℃冰箱中備用。

1.2.2 PCR引物 從四川愛奇生物科技有限公司購買人miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-125a-5p、miR-186-5p、miR-208b-3p等PCR引物，為確保序列的準確性，應用NCBI對每條相關引物進行特異性驗證、分析。

1.2.3 RNA的提取和定量 RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。測定所提取的RNA濃度和檢測其完整性(微量分光光度計法)后，根據(jù)實時熒光定量RT-qPCR儀的操作說明，實時定量聚合酶鏈反應(PCR)法檢測miRNA的表達情況，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)表達量情況。

1.3 觀察指標 ①各組患者的一般臨床資料特征比較，包括男性、吸煙、高血壓、糖尿病比例，中性粒細胞淋巴細胞比值(NLR)、尿酸(UA)、胱抑素C(Cys-c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A1(Apo A1)、載脂蛋白B(Apo B)、纖維蛋白原(Fib)等各指標。②對照組與狹窄組血清中miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p的表達水平比較。③對照組及不同狹窄程度組間miRNA的表達水平比較。④不同部位狹窄組間miRNAs表達水平比較。

2 結果

2.1 各組相關臨床指標的比較 本研究將納入的腦卒中患者根據(jù)發(fā)生狹窄的部位的不同分為四組：NOCS組、ICAS組、ECAS組、COMS組。與NOCS組相比，ICAS組、ECAS組及COMS組中男性、吸煙、高血壓比例、UA、Cys-c、TC、LDL-C、Apo A1、Apo B等指標均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而COMS組年齡明顯高于NOCS組(P<0.05)。各組糖尿病病例、HDL-C、NLR、TG、Fib等指標無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組相關臨床指標的比較

2.2 顱內外動脈狹窄組和對照組血清中各miRNA的表達比較 RT-qPCR測定各組血清的miRNA表達水平結果顯示，與對照組相比，狹窄組患者血清中miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p的表達水平均明顯升高(P<0.01)，而miR-125a-5p在狹窄組患者血清中的表達水平明顯降低(P<0.01)，兩組患者血清miR-208b-3p表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 狹窄組和對照組血清miRNAs的相對表達水平比較

2.3 對照組及不同狹窄程度組間miRNA表達水平的比較 結合DSA，根據(jù)動脈狹窄程度將顱內外動脈狹窄患者又分為輕度狹窄組(n=13)、中度狹窄組(n=18)和重度狹窄組(n=35)。與對照組比較，各不同程度狹窄組miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p和miR-186-5p的表達情況均明顯升高(P<0.001)，miR-125a-5p的表達水平均明顯降低(P<0.001)。重度狹窄組miR-17-5p的表達水平明顯高于輕度狹窄組，miR-27b-3p表達水平高于輕、中度狹窄組，miR-125a-5p的表達水平卻明顯低于輕度狹窄組(均P<0.001)。輕、中度狹窄組miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-125a-5p和miR-186-5p表達水平比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在3組狹窄組血清中，miR-92a-3p的表達水平比較差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)，miR-186-5p的表達水平均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 對照組及不同狹窄程度組血清miRNAs的相對表達水平比較

2.4 不同部位狹窄組間miRNAs 表達水平的比較 根據(jù)動脈狹窄部位的不同分為ICAS組(包括輕度狹窄7例，中度狹窄8例，重度狹窄9例)、ECAS組(包括輕度狹窄3例，中度狹窄4例，重度狹窄11例)和COMS組(包括輕度狹窄3例，中度狹窄6例，重度狹窄15例)。在COMS組中，盡管miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p和miR-186-5p的表達水平均高于ICAS組和ECAS組，miR-125a-5p表達低于ICAS組和ECAS組，然而統(tǒng)計學分析顯示差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 在不同部位動脈狹窄組間miRNAs的表達水平比較

3 討論

腦卒中是一組由腦血管缺血或破裂出血而導致的疾病，其中缺血性腦卒中最為常見，發(fā)病率約占80%，其主要病理過程為動脈粥樣硬化性(Atherosiclerosis, AS)狹窄，往往顱內外動脈都受累[1]。本研究中，首先分析了顱內外動脈狹窄患者的相關臨床指標，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1、載脂蛋白B等有明顯差異，說明該疾病與動脈硬化的高危因素密切相關，這與文獻報道結果相似[4]。盡管篩查顱內外動脈狹窄的方法如頸動脈超聲、腦血管造影、TCD及CT/MRI血管成像等廣泛應用，并非所有人群都能從上述篩查手段中確診并獲益[5]。因此，進一步尋找與顱內外動脈狹窄相關的生物標記物，對于頸內外動脈狹窄的臨床診斷和預測仍具有一定的意義。

miRNA是一類通過作用于多個靶基因調控不同的生物學過程的短鏈微小RNA[2]。miR其在疾病的早期病理過程中便可發(fā)生顯著變化[6]，并且在血液中具有可靠的穩(wěn)定性。因此，檢測血液中的miRNA的表達水平并將其作為生物學標記物具有一定的臨床意義及可行性。本研究通過查閱文獻，選取了可能具有差異表達的6個miRNAs，檢測了其在顱內外動脈狹窄患者血清中的表達量。結果表明，在顱內外動脈狹窄患者血清中， miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p表達明顯升高，miR-125a-5p表達水平明顯降低，說明上述5個miRNAs參與顱內外動脈狹窄的發(fā)病過程。根據(jù)狹窄程度不同分組，輕度、中度、重度動脈狹窄組患者血清中，都存在不同miRNA表達差異，說明血清miRNAs的差異可以在一定程度上部分反映頸動脈狹窄程度，從而有利于臨床評估。就狹窄的不同部位而言，顱內外動脈均有狹窄組患者血清中，miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p水平顯著高于單純性顱內或顱外組。顱內外動脈同時發(fā)生狹窄的病情嚴重程度可能相較于單純性顱內或顱外動脈狹窄更重，這可能是miRNAs差異表達的原因。但也不能排除其差異表達與顱內外動脈狹窄發(fā)生部位的不同有關。因此，可以嘗試將其作為預測顱內外動脈同時發(fā)生狹窄的生物學標記物。

作為miR-17-19族的成員， miR-17-5p已被證實在惡性腫瘤的增殖和遷徙[7]、炎癥反應的發(fā)生及AS的形成[8]等病理過程中都有重要的作用。其影響AS發(fā)生、發(fā)展進程可能與miR-17-5p誘導血管平滑肌細胞異常增殖相關[9]。多項研究顯示miR-17-5p可以作為預測冠狀動脈血管狹窄[5]及其狹窄嚴重程度[10]的重要標志物，但未涉及到頸動脈及顱內動脈狹窄的情況。有研究認為miR-17-5p的升高與腦卒中患者的預后相關，但并未評估血清中miR-17-5p水平與顱內外動脈狹窄程度相關性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在顱內外動脈狹窄患者血清中miR-17-5p表達明顯升高，并與狹窄程度顯著相關，提示miR-17-5p可能是預測顱內外動脈狹窄發(fā)生和嚴重程度的生物標志物。

血清中miR-27b-3p水平與胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)及IGF-1水平呈負相關，而缺血性腦卒中的發(fā)生率又與IGF-1水平呈正相關，提示miR-27b-3p可能參與缺血性腦卒中的病理生理過程[14]。同時，在無癥狀頸動脈狹窄患者血清中miR-27b-3p升高，結合本研究結果，miR-27b-3p的變化與顱內外動脈狹窄的程度呈正相關，進一步說明miR-27b-3p不僅有預測頸動脈狹窄的作用，在一定程度上有利于判斷顱內外動脈狹窄的情況。

多項對冠狀動脈硬化的研究顯示，miR-92a-3p的升高可能與動脈痙攣直接或間接導致AS的形成相關[13-14]，且與粥樣斑塊形成面積呈正相關[15]。本研究發(fā)現(xiàn)在顱內外動脈狹窄患者血清中miR-92a-3p的表達顯著升高，提示其可能是缺血性腦卒中發(fā)生和發(fā)展中一個重要的環(huán)節(jié)。

最新研究認為血清miR-186-5p在無癥狀頸動脈狹窄早期診斷中的潛在作用，并明確其過表達與無癥狀頸動脈狹窄患者腦卒中發(fā)生率密切相關，其研究結果表明miR-186-5p可以作為無癥狀頸動脈狹窄患者的潛在診斷生物標志物，并能夠作為未來腦卒中事件的預測因子[16]。本研究也證實，在有癥狀顱內外動脈狹窄者中，miR-186-5p不僅能作為腦卒中事件的預測因子，也可能預測顱內外動脈不同狹窄程度。

miR-125a-5p可以作為風濕性關節(jié)炎患者冠狀動脈粥樣硬化的預測標記物[17]，其參與到AS過程可能與其能誘導血管內皮細胞發(fā)生異常凋亡有關[18]。然而，對于miR-125a-5p對顱內外動脈狹窄及狹窄程度的預測作用，國內外研究均鮮有報道。而我們的研究結果支持miR-125a-5p可能作為顱內外動脈狹窄及狹窄程度的潛在預測因子。

既往研究顯示，心肌缺血再灌注損傷病理過程的加重與miR-208b-3p的高表達相關。同時，在有癥狀的頸內動脈狹窄和無癥狀頸內動脈狹窄中，miR-208b-3p的表達水平存在顯著差異[19]。然而本研究中，miR-208b-3p的表達無統(tǒng)計學差異。可能的原因，一方面可能與納入的病例數(shù)相對較少相關，另一方面雖然miRNAs在循環(huán)中具有穩(wěn)定表達，但其在組織、血清、血漿中的表達可能存在差異[20]。因此，未來在血漿、組織中的大樣本數(shù)據(jù)驗證仍然是有必要的。

4 結論

本研究通過檢測6個miRNAs在顱內外動脈狹窄組患者血清中的表達水平并分析其相關性，發(fā)現(xiàn)miR-17-5p、miR-27b-3p、miR-92a-3p、miR-186-5p、miR-125a-5p的表達改變與缺血性腦卒中患者顱內外動脈狹窄聯(lián)系緊密，且表達水平從某種程度反映顱內外動脈狹窄程度，可能對未來預測顱內外動脈狹窄程度提供新的生物標志物。