熒光免疫分析技術(shù)檢測食品中AFB1的研究進(jìn)展

蔡愛麗，魯 迨，石星波，趙 倩，鄧潔紅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，長沙 410128）

0 引言

黃曲霉毒素 B1（Aflatoxin B1，AFB1）主要是由黃曲霉和寄生曲霉在溫暖濕潤條件下產(chǎn)生的芳香代謝物。花生、玉米、大米等食物，極易被AFB1污染。AFB1具有高度致癌性和致畸性，能夠抑制遺傳物質(zhì)的合成，破壞人體內(nèi)的酶，導(dǎo)致生理損傷［1-2］。根據(jù) GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》規(guī)定，我國的小麥、大麥等谷物的AFB1檢測限量為5 μg/kg。而歐洲委員會更是規(guī)定了所有谷物和谷物衍生產(chǎn)品中AFB1最大污染水平不超過2 μg/kg，以保護(hù)消費(fèi)者健康和食品安全。

傳統(tǒng)AFB1檢測方法有高效液相色譜法、薄層色譜法和氣相色譜法等［3］。盡管這些方法已經(jīng)取得了許多進(jìn)展，但考慮到AFB1低許可水平和巨毒性，尋找新的方法來提高檢測技術(shù)的簡便性、選擇性和靈敏性仍然是一個挑戰(zhàn)。

免疫分析是利用抗體特異性識別抗原的特性對目標(biāo)物進(jìn)行定性或定量的分析方法。COONS將熒光信號與抗原抗體特異性反應(yīng)相結(jié)合提出了熒光免疫分析法。熒光法具有靈敏度高、操作簡便、快速等優(yōu)勢，在各種化合物的檢測中被廣泛應(yīng)用［4］。近些年來，兼容高靈敏熒光輸出信號和高特異性免疫分析的AFB1傳感檢測平臺，成為研究熱點(diǎn)。

擬聚焦于AFB1傳感檢測平臺的不同檢測原理，本文將熒光免疫分析法分為熒光免疫吸附法（Fluorescent-linked immunosorbent assay，F(xiàn)LISA）、基于熒光納米顆粒的側(cè)流免疫分析法（Lateral flow immunoassays，LFI）、免疫磁分離熒光檢測法（Immunomagnetic separation fluorescence assay）和適配體免疫熒光分析法（Aptamer immunofluorescence assay）4種，為研究新的AFB1檢測傳感器提供思路。

1 熒光免疫吸附法檢測AFB1

FLISA在傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)上，利用熒光材料作為信號標(biāo)記，避免有色樣品造成假陽性信號，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確［5］。

1.1 基于熒光基團(tuán)的FLISA

利用具有熒光淬滅作用的材料對熒光信號進(jìn)行淬滅可以構(gòu)建多種生物傳感器［6］。LU等［7］在磁納米顆粒（Magnetic nanoparticles，MNPs）上修飾了與適配體互補(bǔ)的帶有熒光染料的DNA鏈，基于MNPs的熒光淬滅效應(yīng)，Cy5的熒光被淬滅。加入AFB1后，DNA鏈掉落。通過測量回收DNA鏈上的熒光，構(gòu)建了超靈敏的熒光檢測傳感器檢測AFB1，LOD為0.54 fg/mL，遠(yuǎn)低于之前報道。

1.2 基于量子點(diǎn)的FLISA

高熒光信號輸出的量子點(diǎn)（Quantum dot，QDs）可以代替容易受到環(huán)境影響的生物酶進(jìn)行信號放大。ZHANG等［8］用產(chǎn)率高且穩(wěn)定的碲化鎘量子點(diǎn)（CdTe QDs）代替酶標(biāo)與AFB1的單克隆抗體偶聯(lián)，AFB1濃度與被檢測出的CdTe QDs熒光強(qiáng)度呈反比。該方法的檢測限為0.016 ng/mL。LI等［9］將紅色熒光的CdSe/ZnS QDs標(biāo)記在單克隆抗體上作為結(jié)合和檢測探針，不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的分析性能，而且節(jié)省大量時間。

2 基于熒光納米顆粒的測流免疫分析法檢測AFB1

常見的LFI通過在硝化纖維素膜上固定抗原和抗體，分別作為檢測線（T線）和控制線（C線），用T線與C線的熒光強(qiáng)度比值進(jìn)行測定分析［10］。熒光納米顆粒如QDs、染料摻雜的聚苯乙烯納米顆粒和上轉(zhuǎn)換納米粒子（Upconversion nanoparticles，UC NPs）都具有優(yōu)良的發(fā)光性能和光穩(wěn)定性，被用于開發(fā)高靈敏的LFI傳感器。

2.1 量子點(diǎn)

QDs的強(qiáng)發(fā)光、寬吸附和窄對稱光致發(fā)光光譜等特殊的光學(xué)特性使其在AFB1檢測中的應(yīng)用前景十分廣闊。例如，CdSe/ZnS QDs連接到抗AFB1抗體上作為LFI抗體探針，可以提供熒光信號［11］。此外，JIANG 等［12］基于 QDs和花狀金納米粒子（AuNFs）之間的內(nèi)濾效應(yīng)，開發(fā)了一種熒光淬滅型的LFI檢測大豆醬中的AFB1。

在復(fù)雜的生物環(huán)境中，QDs的化學(xué)穩(wěn)定性不強(qiáng)。研究人員設(shè)計了一種嵌有大量QDs的聚合物納米微珠（QBs），通過增加QDs的數(shù)量來放大發(fā)光信號，提高 QDs的穩(wěn)定性［13］。JIA等［14］利用QBs與AFB1抗體偶聯(lián)作為熒光探針，可用于現(xiàn)場檢測蓮子中的AFB1。同時，QBs和磁性納米球合成的磁性熒光珠在保留約45.4%的離子飽和磁化強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，其熒光發(fā)射強(qiáng)度比相應(yīng)的量子點(diǎn)強(qiáng)約226倍［15］。用于檢測醬油提取物和老抽中AFB1時，靈敏度分別為3 pg/mL和49 pg/mL。

2.2 染料摻雜聚苯乙烯納米顆粒

近年來，研究發(fā)現(xiàn)將不同種類的熒光染料摻入聚苯乙烯顆粒內(nèi)部，可以制備穩(wěn)定、熒光強(qiáng)的熒光微球（Fluorescent microsphere，F(xiàn)Ms），減弱光降解或光漂白現(xiàn)象［16］。WANG 等［17］優(yōu)化反應(yīng)條件使分析條帶具有更明亮的顏色，解決了條帶上的暗背景問題，消除樣品的顏色干擾，可以用肉眼分析玉米中的AFB1含量。鑭系化合物Eu（III）摻雜的聚苯乙烯納米顆粒作為另一種熒光微球（TRFMs），可以通過延遲時間從背景熒光信號中分辨出有用的熒光信號。ZHANG等［18］研制了一種基于TRFMs的色譜時間分辨熒光免疫分析法的便攜式免疫傳感器，用于食品和飼料樣品中AFB1的現(xiàn)場靈敏檢測。因此沒有激發(fā)光源引起的噪聲干擾，提供了放大的正信號和低信噪比。TRFMs還可以檢測醬油中的AFB1，做到現(xiàn)場即時檢測［19］。

2.3 上轉(zhuǎn)化納米粒子

UC NPs具有較長的發(fā)光壽命，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料和QDs相比優(yōu)勢顯著。斯托克斯位移大、發(fā)射峰尖銳、發(fā)光壽命長、無光漂白等獨(dú)特的光學(xué)特性使UC NPs具有低信噪比［20］。

由于AFB1的分子結(jié)構(gòu)小，抗原表位有限，ZHAO等［21］基于競爭免疫法構(gòu)建了AFB1的LFI傳感器。在檢測過程中，AFB1與AFB1/牛血清蛋白競爭。隨著樣品中AFB1量的增加，UC NPs/AFB1/抗體偶聯(lián)物在T中積累較少，導(dǎo)使T線上信號減少。該方法用于花生、水稻、玉米等的AFB1檢測時表現(xiàn)良好，對AFB1的檢測靈敏度為0.03 μg/L。此外，適配體功能化的多色上轉(zhuǎn)換納米顆粒還可以作為高靈敏和精確檢測多個目標(biāo)的熒光探針，可以在不發(fā)生交叉反應(yīng)的情況下，通過不同的顏色通道對不同的靶標(biāo)進(jìn)行快速、靈敏的分析［22］。

3 免疫磁分離熒光檢測法檢測AFB1

MNPs的生物相容性好，比表面積大，在免疫化學(xué)反應(yīng)后施加磁場，可以快速分離反應(yīng)物，在真菌毒素的檢測應(yīng)用中十分普遍。SHU等［23］將AFB1抗體固定在MNPs表面構(gòu)建無標(biāo)記免疫分析平臺，通過免疫磁分離（Immunomagnetic separation，IMS）技術(shù)選擇性地從樣本基質(zhì)中捕獲和富集AFB1。被抗體捕獲的AFB1在365 nm紫外燈照射下會產(chǎn)生具有強(qiáng)熒光的衍生物，熒光增強(qiáng)。

XIE 等［24］將 AFB1的半抗原偶聯(lián) MNPs作為傳感探針，多孔C3N4納米薄片為熒光探針構(gòu)建AFB1檢測平臺。利用IMS技術(shù)分離通過免疫反應(yīng)結(jié)合的復(fù)合物，便于熒光強(qiáng)度的測定。但是該方法由許多組件和步驟組成，昂貴且費(fèi)時。為了解決這個問題，BECHEVA等［25］提出了另一種基于IMS的AFB1免疫熒光檢測方法，由MNPs，AFB1/牛血清白蛋白和異硫氰酸熒光素的熒光偶聯(lián)物2個部分組成。該方法樣品量小，靈敏度高，檢測時間短。利用IMS特性，不僅可以測定沉淀中與免疫磁珠結(jié)合的熒光偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度，還可以測定上清液中未結(jié)合的熒光偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度［26］。另外，半抗原修飾的MNPs作為免疫傳感探針，與AFB1在樣品溶液中形成免疫競爭，用于定量AFB1含量時高效且靈敏［27］。

4 適配體免疫熒光分析法檢測AFB1

與制備困難和高成本的抗體相比，通過配體指數(shù)富集系統(tǒng)篩選設(shè)計的適配體，在大多數(shù)環(huán)境條件下具有更強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，更長的保質(zhì)期，易于修飾，易于合成熒光型的生物傳感器，被認(rèn)為是應(yīng)用于檢測技術(shù)的理想候選體［28］。

4.1 適配體修飾熒光信號

CHEN等［29］將熒光基團(tuán)FAM修飾在AFB1適配體上，淬滅基團(tuán)TAMRA修飾在與適配體部分互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）。在AFB1缺失的情況下，適配體與cDNA結(jié)合，熒光團(tuán)和淬滅劑靠近，誘導(dǎo)熒光淬滅。加入AFB1后，觸發(fā)cDNA的釋放，熒光強(qiáng)度隨著AFB1濃度的增加而增加。同理，將FAM和TAMRA同時修飾在AFB1適配體上，操作更為簡單，并且靈敏度更高［30］。聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）染料也能用于標(biāo)記核酸探針，與傳統(tǒng)的DNA嵌入染料相比，AIE染料和末端標(biāo)記的熒光團(tuán)之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）過程，將在結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換過程中引起距離效應(yīng)，進(jìn)一步放大響應(yīng)信號，提高靈敏度［31］。

4.2 適配體修飾二氧化硅納米顆粒

二氧化硅納米顆粒（Silica nanoparticles，SNPs）因其在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性、分散性、生物相容性和低成本等特點(diǎn)，在傳感器中有著很大的作用。SNPs不僅可以作為載體，還能作為N-甲基中卟啉IX（NMM）的熒光增強(qiáng)劑，提高檢測靈敏度。在AFB1存在下，含有適配體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)被拆解，形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。NMM熒光團(tuán)的環(huán)境發(fā)生變化，其熒光強(qiáng)度被放大，LOD 為 8 pg/mL［32］。TAN 等［33］基 于 介 孔 SNPs（Mesoporous silica nanoparticles，MSNs），設(shè)計一種新穎、簡單且無標(biāo)記的適配體生物傳感器，用于檢測AFB1。適配體被用作分子識別探針和“門控分子”，固定在氨基化MSNs的表面，以防止顆粒內(nèi)部的熒光染料泄漏。存在AFB1時，“門”被打開釋放熒光信號。結(jié)果表明，熒光強(qiáng)度與AFB1的濃度呈正相關(guān)，檢出限低至0.13 ng/mL。

4.3 適配體修飾氧化石墨烯

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）具有巨大的表面積和強(qiáng)大的熒光淬滅能力［34］，基于GO對FAM的熒光淬滅效果，JOO等［35］將FAM修飾的適配體作為檢測探針，研究開發(fā)了AFB1檢測平臺。隨著AFB1濃度的增加，熒光強(qiáng)度呈線性下降。適配體修飾的GO生物傳感器與熒光偏振法相結(jié)合檢測AFB1時，具有抗光漂白、不敏感熒光波動等優(yōu)點(diǎn)［36］。JIA等［37］利用GO 在能量和電子轉(zhuǎn)移過程中能夠淬滅季銨化四苯乙烷鹽（TPE-Z）的熒光的特性，簡單混合TPE-Z、AFB1適配體、GO和AFB1樣品即可實(shí)現(xiàn)檢測牛奶中的AFB1，彌補(bǔ)了奶殺菌不徹底時造成的毒素污染［38］。

與GO相比，納米粒子功能化的GO可以增加分析物結(jié)合的有效表面積。LI等［39］將2個熒光團(tuán)標(biāo)記的發(fā)夾探針吸附在氧化石墨烯/金納米復(fù)合材料（GO/AuNCs）上，加入AFB1后，適配體與AFB1特異性識別，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被打開，發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，形成長鏈DNA雙鏈體并從GO/AuNCs的表面解吸，熒光信號恢復(fù)。在最佳條件下GO/AuNCs能夠淬滅94%的熒光，LOD低至0.03 pg/mL。

4.4 適配體修飾金納米材料

納米材料中，納米尺度（1～100 nm）的金納米材料因其高表體積比、優(yōu)異的生物相容性、表面易修飾以及獨(dú)特的光學(xué)和電子特性，已被應(yīng)用于傳感檢測器等領(lǐng)域［40］。

4.4.1 適配體修飾球狀金納米顆粒

球狀A(yù)uNPs（20～40 nm）的表面等離子體共振峰與熒光素的最大發(fā)射峰重疊，當(dāng)熒光團(tuán)靠近AuNPs時，熒光素與AuNPs之間的FRET會導(dǎo)致熒光淬滅，常被用于構(gòu)建基于AuNPs的AFB1檢測。WANG等［41］將AuNPs作為熒光淬滅劑，AFM標(biāo)記的適配體作為熒光探針。存在AFB1時，AFB1與適配體的互補(bǔ)鏈進(jìn)行競爭導(dǎo)致熒光恢復(fù)。然而，熒光素的小斯托克斯位移會產(chǎn)生高背景并導(dǎo)致低信噪比。LU等［42］發(fā)現(xiàn)用QDs代替熒光染料，與AuNPs之間進(jìn)行FRET檢測AFB1時，能夠提高信噪比，LOD為20 pg/mL。

此外，AuNPs還可以作為信號載體。WANG等［43］合成AuNPs/DNA復(fù)合材料，利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化DNA聚合，熒光探針作為熒光信號被組裝在AuNPs/DNA復(fù)合材料上進(jìn)行信號放大，該策略表現(xiàn)出高靈敏度。

4.4.2 適配體修飾其他金納米材料

與傳統(tǒng)染料相比，金納米簇（AuNCs）體積小、穩(wěn)定性高、生物相容性好、熒光發(fā)射穩(wěn)定。張瑩瑩等［44］基于Au3+與Hg2+之間的相互作用所導(dǎo)致的AuNCs熒光淬滅，以及Hg2+與AFB1之間的絡(luò)合作用所導(dǎo)致的熒光恢復(fù)，建立了一種LOD為0.1 ng/mL的AFB1檢測方法。KHAN等［45］首次使用雙色AuNCs作為能量供體，分別偶聯(lián)AFB1和ZEN適配體，WS2納米片作為熒光淬滅劑合成信號探針，快速、靈敏地同時識別AFB1和ZEN。金納米星（AuNSs）具有多尖銳分枝，更容易修飾和固定材料，同時還可以淬滅熒光。WEI等［46］利用AuNSs的特性，將FAM標(biāo)記的與適配體互補(bǔ)的發(fā)夾DNA作為信號探針，提出了一種基于AuNSs的AFB1熒光適配體檢測方法，在其他毒素存在下顯示出良好的選擇性。

5 結(jié)語

減少AFB1對食品的污染，快速、靈敏、特異的檢測方法成為近年來的研究重點(diǎn)。本文綜述以免疫熒光分析為基礎(chǔ)檢測食品中AFB1的方法及研究進(jìn)展，如表1所示，將已開發(fā)的基于熒光免疫分析的AFB1檢測平臺分成了熒光免疫吸附法、基于熒光納米顆粒的側(cè)流免疫分析法、免疫磁分離熒光檢測法、適配體免疫熒光分析法。一方面，熒光信號的出現(xiàn)克服了食品本身顏色對比色信號造成的影響，減少了假陽性信號的出現(xiàn)；另一方面，納米材料可以給抗體及其他修飾基團(tuán)提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，放大信號，進(jìn)一步提高檢測靈敏度。同時，基于熒光免疫的LFI平臺簡單方便，在現(xiàn)場檢測中具有很大的價值。

表1 AFB1熒光免疫分析技術(shù)的對比Tab.1 Comparison of AFB1 fluorescence immunoassay techniques

盡管熒光免疫分析技術(shù)被廣泛用于檢測食品中的AFB1，但是仍然存在許多缺陷。首先，抗體的昂貴需要開發(fā)新的技術(shù)和方法來減少抗體使用的數(shù)量；其次，納米材料的商業(yè)化使用還需要更多的探索；再次，過量的MNPs會抑制量子點(diǎn)或熒光染料的熒光，使檢測信號出現(xiàn)誤差。而且，熒光漂白等問題使研發(fā)更穩(wěn)定的熒光物質(zhì)成為一個重要的研究方向。最重要的是，不同的食品基質(zhì)需要不同的前處理方法，操作過程不夠簡潔；一些檢測方法需要專業(yè)人員和昂貴的設(shè)備，只能用于實(shí)驗(yàn)室檢測，等等。這些問題都需要更加深入的研究。