不同人骨肉瘤細(xì)胞系特點(diǎn)及其在實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用潛力的研究進(jìn)展

李世文 陳建百 郝海靜 王曉巖 孔鵬羽 徐公平

人骨肉瘤細(xì)胞系在骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 的基礎(chǔ)研究中扮演著重要的角色，現(xiàn)已知的人骨肉瘤細(xì)胞系種類眾多，每種 OS 細(xì)胞系都有自己不同的生物學(xué)行為特性以及基因表達(dá)，因此同一種實(shí)驗(yàn)采用不同的人骨肉瘤細(xì)胞系可能產(chǎn)生迥然不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將橫向比較 6 種常用的人骨肉瘤細(xì)胞系 MG-63，Saos-2，U-2 OS，人成骨細(xì)胞 ( HOB )，KRIB 和 143B 的特點(diǎn)，并討論在實(shí)際研究中的應(yīng)用。

一、MG-63

MG-63 是目前 OS 實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的一種人骨肉瘤細(xì)胞系，其首先是由 Billiau 等從 1 例 14 歲的白人男童的OS 組織中提取并培養(yǎng)而來。MG-63 可用含 10% 優(yōu)質(zhì)熱滅活胎牛血清 ( fetal calf serum，F(xiàn)BS ) 的 DEME 培養(yǎng)基或含10% FBS 的 MEM 培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需同時(shí)添加 40 IU / ml 的青霉素 / 鏈霉素 ( P / S )，培養(yǎng)條件為：5% 的 CO濃度，37 ℃ 及 100% 濕度 ( 表 1 )。MG-63 具有很好的傳代穩(wěn)定性，傳代至 30 代 ( P30 ) 后依然能保持較高的細(xì)胞增殖率( ≥ 50% ) 以及較低的細(xì)胞凋亡率 ( 5% )，并且 MG-63 的細(xì)胞形態(tài)在傳代 P5-P30 范圍內(nèi)均非常相似。MG-63 的細(xì)胞形態(tài)不固定，與貼壁生長(zhǎng)的 HOB 比較，MG-63 細(xì)胞的大小約為 HOB 的 1 / 6。MG-63 細(xì)胞具有穩(wěn)定表達(dá)譜，第 P5-P30 代細(xì)胞系 MG-63 的黏附受體表達(dá)和活化信號(hào)分子的表達(dá)沒有明顯改變。

MG-63 細(xì)胞呈現(xiàn)成骨樣細(xì)胞表現(xiàn)，能夠檢測(cè)出成骨細(xì)胞標(biāo)志骨鈣素 ( osteocalcin，OC )，骨唾液蛋白( bone salivary protein，BSP ) 和核心蛋白聚糖 ( Decorin )的表達(dá)。在基礎(chǔ)條件下，MG-63 堿性磷酸酶 ( alkaline phosphatase，ALP ) 表達(dá)水平不及成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的表達(dá)水平的 1 / 10，但是應(yīng)用 1,25-二羥維生素 D3 處理后，其可誘導(dǎo) MG-63 細(xì)胞大量產(chǎn)生肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 ( hepatocyte growth factor，HGF ) 從而促使 MG-63 的 ALP 表達(dá)水平增加同時(shí)，MG-63 的 OC 表達(dá)也會(huì)增加，這是 MG-63 細(xì)胞系一項(xiàng)重要的特性。

MG-63 細(xì)胞系擁有眾多子系，MG-63.2 是其中之一，因其具有高度轉(zhuǎn)移傾向而經(jīng)常用于 OS 轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。MG-63.2 最初是通過將親代 MG-63 細(xì)胞注入裸鼠的脛骨內(nèi)，然后采集其中發(fā)生了肺轉(zhuǎn)移的裸鼠體內(nèi) OS 細(xì)胞，并在小鼠體內(nèi)重新傳代，直至建立出具有高度轉(zhuǎn)移傾向的亞系 —— MG-63.2。與親代 MG-63 細(xì)胞相比，MG-63.2 細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力和侵襲能力。MG-63.2 細(xì)胞發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的概率也要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 MG-63 ( 200 倍 )，這可能與 MG-63.2 的黏附能力低于 MG-63 有關(guān)。從免疫表型來看，MG-63.2 細(xì)胞中 Ezrin 蛋白、TIMP-2、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白 5 ( insulin-like growth factor binding protein，IGFBP5 ) 表達(dá)水平較 MG-63 相比呈上調(diào)，這些都提示 MG-63.2 具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，但有趣的是 MMP-2和 MMP-9 的表達(dá)水平下調(diào)。

二、U-2 OS

1964年，有學(xué)者從 1 例 15 歲女童脛骨中等分化的肉瘤中分離建立了初代 U-2 OS。U-2 OS 應(yīng)用含 10%FBS 的 McCoy’s 5a Medium 培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余培養(yǎng)條件同MG-63。但與 MG-63 不同，U-2 OS 在培養(yǎng)基中呈上皮形態(tài)，以單層形式生長(zhǎng)，并且在軟瓊脂中不形成細(xì)胞集落( 表 1 )。該細(xì)胞系在體外具有廣泛的表征，可表達(dá)胰島素樣生長(zhǎng)因子 Ⅰ、Ⅱ 受體 ( IGF-ⅠR、IGF-ⅡR ) 和骨肉瘤衍生生長(zhǎng)因子 ( osteosarcoma-derived growth factors，ODGF )。U-2 OS 細(xì)胞在鏡下呈紡錘形至三角形不等。其具有在小鼠體內(nèi)成瘤并且轉(zhuǎn)移的能力，Wang 等通過將 U-2 OS 細(xì)胞分別注射在小鼠的皮下及尾緣靜脈，證明 U-2 OS 可以在皮下成瘤并發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移。U-2 OS 細(xì)胞并不表現(xiàn)出典型的成骨細(xì)胞特性，U-2 OS 中成骨細(xì)胞標(biāo)記 OC 和核心蛋白及其它所有成骨細(xì)胞標(biāo)記物幾乎均為陰性。

三、Saos-2 和 LM-7

1973年，F(xiàn)ogh 等從 1 例 11 歲的白人女童的原發(fā)性 OS 組織中分離出了 Saos-2，須特別指出的是，該患者曾經(jīng)采用多種藥物治療，包括放療，甲氨蝶呤 ( MTX )、阿霉素( ADM )、長(zhǎng)春新堿、環(huán)磷酰胺和 aramycin-C。Saos-2的培養(yǎng)方式與 MG-63 和 U-2 OS 類似 ( 表 1 )，鏡下觀察Saos-2 細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形。Saos-2 與 MG-63 相似，同樣具有成骨樣細(xì)胞特性。值得注意的是，Saos-2 細(xì)胞的基礎(chǔ) ALP 活性比其它已建立的人類 OS 細(xì)胞系高 100～1000倍，并且 Saos-2 對(duì) 1,25-二羥維生素 D3 和糖皮質(zhì)激素( glucocorticoid，GC ) 具有高反應(yīng)性。與 U-2 OS 相似，這種未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系是體外表征最充分的人骨肉瘤細(xì)胞系之一，Saos-2 細(xì)胞內(nèi)成骨細(xì)胞標(biāo)志物 OC，BSP，Decorin和一型膠原 Ⅰ 均為陽(yáng)性，證明 Saos-2 擁有良好的成骨特性。Saos-2 具有在裸鼠體內(nèi)成瘤和低轉(zhuǎn)移潛能。Saos-2 擁有眾多子系細(xì)胞亞型，Saos-LM 細(xì)胞系是緣于親代 Saos-2 細(xì)胞系轉(zhuǎn)化而來，Jia 最初將 Saos-2 通過靜脈注入裸鼠體內(nèi)，培養(yǎng)后篩選出發(fā)生腫瘤肺轉(zhuǎn)移的裸鼠，然后從肺轉(zhuǎn)移腫瘤組織內(nèi)的分離出腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)并建立出新的細(xì)胞系，命名為 LM-1，將此過程重復(fù) 6 次后，得到了 LM-7。與親代 Saos-2 相比，LM-7 擁有更高的肺轉(zhuǎn)移潛能，并且 LM-7 細(xì)胞擁有更快的體外生長(zhǎng)速度 ( 1.38 倍 )及體內(nèi)成瘤率 ( 1.75 倍 )，LM-7 細(xì)胞骨架與 Saos-2 明顯不同，LM-7 的細(xì)胞體積要小于 Saos-2 細(xì)胞，且在鏡下LM-7 的細(xì)胞核的異型性更高，LM-7 細(xì)胞的黏附力也要弱于 Saos-2，這些都與它的高轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，成骨表型方面，LM-7 在小鼠體內(nèi)呈成骨樣生長(zhǎng)，Muff 通過比較親代Saos-2 及 LM-7 的成骨細(xì)胞表型，發(fā)現(xiàn)兩者的 ALP 活性和礦化細(xì)胞外基質(zhì)的沉積基本保持一致，但 Yuan 等在他實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) Saos-LM-7 細(xì)胞的 ALP 活性水平高于親代細(xì)胞 ( 297±17 ) %。Saos-LM-7 中與成骨相關(guān)的核心結(jié)合因子 1 ( cbfa 1 ) 表達(dá)也呈升高趨勢(shì)，但 LM-7 細(xì)胞對(duì)于PTH 反應(yīng)性明顯降低。免疫表型方面，LM-7 中組織蛋白酶 B 和 H 的表達(dá)降低，而組織蛋白酶 D、K 和 L 的表達(dá)增加，與腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)的 Fas 基因表達(dá)相較于 SAOS-2降低。

表1 MG-63、Saos-2、U-2 OS、HOS、KRIB 和 143B 的形態(tài)、培養(yǎng)方式、免疫表達(dá)特點(diǎn)Tab.1 Morphology, culture method and immune expression characteristics of MG-63, Saos-2, U-2 OS, HOS, KRIB and 143B

四、HOS、KRIB 和 143B

McAllister 等在 1970年培育了 HOS 細(xì)胞，初代細(xì)胞來自 1 例 13 歲白人女童的股骨遠(yuǎn)端。HOS 呈上皮樣細(xì)胞和成纖維樣細(xì)胞樣形態(tài)，表現(xiàn)為扁平狀。HOS 具有很強(qiáng)的成骨潛力，HOS 的 ALP 活性也高于基礎(chǔ)條件水平的MG-63 細(xì)胞。最初的 HOS 細(xì)胞系無致瘤性，經(jīng) N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍 ( MNNG ) 不同方式誘導(dǎo)后，HOS 會(huì)產(chǎn)生不同的形態(tài)學(xué)改變并獲得致瘤特性。當(dāng)以低濃度MNNC ( 0.01 pg / ml ) 和 Ki-MSV 對(duì) HOS 細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，轉(zhuǎn)化的 HOS / MNNC 細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)具有致瘤性，腫瘤表現(xiàn)為低分化肉瘤或成骨肉瘤，而用高濃度 MNNC ( 0.1 μg / ml )進(jìn)行處理的 HOS 卻沒有致瘤性。同時(shí)低濃度 MNNC 處理過的 HOS / MNNC 纖溶酶活性水平更高，細(xì)胞的侵襲性也更強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)中，學(xué)者們多選用可以在小鼠體內(nèi)致瘤的MNNG / HOS 作為研究對(duì)象。

學(xué)者們最初通過將癌基因 v-Ki-ras 轉(zhuǎn)染入 HOS 細(xì)胞得到了 KRIB 細(xì)胞，因此 KRIB 的許多特性和 HOS 相似。KRIB 本身具有在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力，并且 KRIB 在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出較大的肺轉(zhuǎn)移的傾向，Berlin 在小鼠脛骨內(nèi)接種 2×10個(gè)腫瘤細(xì)胞，接種后 4 周，小鼠發(fā)生了自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，這一特征與人類的 OS 肺轉(zhuǎn)移的特征十分相似，該模型是第一個(gè)成功形成自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的原位異種移植 OS 模型。之后，F(xiàn)ahim 又通過將 KRIB-1 植入裸鼠的L-3 椎體中，建立了脊柱中第一個(gè)原發(fā)性惡性骨腫瘤的原位鼠模型，是一種較為成功的脊柱原發(fā)腫瘤模型。

143B 細(xì)胞與 KRIB 類似，也是 HOS 通過 Ki-ras 癌基因轉(zhuǎn)染而來。143B 和 MNNG / HOS 均源自 HOS，但相比MNNG / HOS，143B 表現(xiàn)出更高致瘤性和自發(fā)轉(zhuǎn)移潛力，Luu 等將 143B 接種到小鼠脛骨內(nèi)接后發(fā)生了自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。Tome 將 MNNG / HOS 和 143B 分別移植到小鼠的脛骨中時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了 143B 的肺轉(zhuǎn)移傾向要比 MNNG / HOS 高約 84 倍。因此 143B 是用于研究 OS 轉(zhuǎn)移機(jī)制的理想細(xì)胞系。

雖然 KRIB 及 143B 都由 HOS 經(jīng)過相似的方法誘導(dǎo)而來，但在成瘤及轉(zhuǎn)移能力上還有區(qū)別，KRIB 進(jìn)行鼠尾靜脈注射，平均 2～4 周即可形成穩(wěn)定的肺部轉(zhuǎn)移瘤，而143B 平均需要 4～6 周，并且三種細(xì)胞系對(duì)于化療藥物敏感性也有明顯差異，Harris用硼替佐米分別對(duì) HOS、143B 及 KRIB 進(jìn)行處理，相比經(jīng)過誘導(dǎo)及傳代處理的 143B和 KRIB，傳代次數(shù)較少的親代 OS 細(xì)胞系 HOS 對(duì)于藥物更加敏感，并且硼替佐米只抑制 143B 的肺部轉(zhuǎn)移灶發(fā)展，對(duì) KRIB 無效。在免疫表型上 KRIB 及 143B 也存在區(qū)別，血小板衍生生長(zhǎng)因子 ( platelet-derived growth factor，PDGF )在 OS 細(xì)胞中是廣泛高表達(dá)的，但在 KRIB 細(xì)胞系中，研究發(fā)現(xiàn) PDGF 受體特異性拮抗劑對(duì)下游表達(dá)并無明顯影響，這與 Ki-RAS 基因的轉(zhuǎn)入導(dǎo)致 PDGF 受體下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路改變有關(guān)。需要注意的是 KRIB 及 143B 均是由親代 OS 細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化而來，導(dǎo)致三者無法準(zhǔn)確在體內(nèi)或體外還原人骨肉瘤原本基因的表達(dá)。

五、人骨肉瘤細(xì)胞系化療藥物敏感性及耐藥細(xì)胞系

目前治療 OS 的一線化療藥物主要有 ADM、順鉑( DDP )、MTX、異環(huán)磷酞胺 ( IFO )、依托泊苷 ( VP16 )。不同細(xì)胞系對(duì)于不同化療藥物的敏感性不同，Zheng 等通過 MTT 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 MG-63 對(duì) ADM、MTX、DDP、吉西他濱 ( GEM ) 多種化療藥物敏感，Wang 等在他的實(shí)驗(yàn)中，驗(yàn)證了Saos-2 細(xì)胞系對(duì) MTX、ADM、ADM、EPI ( 表阿霉素 ) 均敏感，但對(duì)于 IFO ( IC50 = 583.23±0.14 ng / ml )及 DDP ( IC50 = 127.67±0.21 ng / ml ) 卻不敏感。另外 1 篇對(duì)于藥物敏感性的研究中也證明，Saos-2 對(duì)于 DDP 并不敏感。Komiya 等利用 DDP 對(duì)八種人骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行處理，橫向觀察不同細(xì)胞系對(duì)于 DDP 的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述的幾種細(xì)胞系中 MG-63 對(duì)于 DDP 的敏感性最強(qiáng)( IC50 = 3.6±0.3 μg / ml )，而 U-2 OS 最不敏感 ( IC50 =5.1±0.6 μg / ml )，但 U-2 OS 對(duì)于 ADM 較為敏感 ( IC50 =10.322 μg / ml )。就目前而言，對(duì)于一線化療藥物的研究多聚焦于 MG-63、Saos-2、U-2 OS 和 HOS 細(xì)胞系，但對(duì)于 KRIB，143B，LM7 等一些衍生的人骨肉瘤細(xì)胞系的研究較少，可期以后能有更多方面的研究。

OS 化療后多藥耐藥 ( multidrug resistance，MDR ) 的產(chǎn)生是影響 OS 患者化療療效和預(yù)后的主要因素之一，而建立多藥耐藥細(xì)胞株是體外研究腫瘤多藥耐藥性的基礎(chǔ)。目前對(duì)于耐藥株的建立主要依靠遞增藥物濃度沖擊誘導(dǎo)法，通過利用梯度的藥物濃度處理親代細(xì)胞系，最終培養(yǎng)成耐受該種藥物的細(xì)胞系，誘導(dǎo)的時(shí)間通常為4～12 周不等。Tao 等利用 0.45～0.75 μm 間十個(gè)遞增梯度濃度的 CDDP 對(duì) MG-63 和 HOS 細(xì)胞系進(jìn)行處理，最后獲得了 MG-63 / PDT 和 HOS / PDT 兩株耐藥細(xì)胞系，與兩個(gè)親本細(xì)胞相比，MG63 / PDT 和 HOS / PDT 對(duì) CDDP 的抗性分別是 1.67 倍和 1.61 倍。Wang 等在親代 Saos-2細(xì)胞系的培養(yǎng)基中逐漸增加 MTX 藥物濃度 ，培育出對(duì)MTX 具有選擇抗性的 Saos-2 / MTX4.4 OS 細(xì)胞系。在進(jìn)行耐藥株建立的時(shí)候，往往只是用一種化療藥物培育，但培育出的耐藥株有可能對(duì)多種化療藥物的敏感性均降低，例如 Zhao 等誘導(dǎo)出的 Saos-2 / ADM 細(xì)胞系與親代 Saos-2對(duì)照細(xì)胞相比，除了對(duì) ADM 耐藥性增加以外，對(duì) MTX( 1.74 倍 )、DDP ( 1.43 倍 ) 和 As(2)O(3) ( 1.21 倍 ) 的 IC50值均有所增加，MG-63 / DOX 細(xì)胞系對(duì) ADM 和 GEM 高度耐藥，同時(shí)對(duì) THP、MTX 和 DDP 耐藥。多藥耐藥人骨肉瘤細(xì)胞系是目前研究 MDR 的重要工具，目前對(duì)于多藥耐藥人骨肉瘤細(xì)胞系的研究多從耐藥相關(guān)蛋白分子，多藥耐藥基因表達(dá)及逆轉(zhuǎn)，化療藥物協(xié)同作用及放化療相結(jié)合方面進(jìn)行。雖然目前對(duì)于耐藥細(xì)胞系研究較多，但建立穩(wěn)定的細(xì)胞系系統(tǒng)仍需要進(jìn)一步研究。

六、細(xì)胞形態(tài)計(jì)量學(xué)差異

OS 細(xì)胞系和正常成骨細(xì)胞一個(gè)重要區(qū)別是缺乏依賴細(xì)胞密度的形態(tài)學(xué)改變，OS 細(xì)胞系在培育過程中，一般均為上皮樣或成纖維樣生長(zhǎng)，所有 OS 細(xì)胞系均貼壁生長(zhǎng)，不同 OS 細(xì)胞系鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)存在差異，鏡下觀察可見培養(yǎng)良好的 MG-63 細(xì)胞形狀從橢圓形到紡錘形以及三角形不等，并可以見到細(xì)胞具有延伸性。Saos-2 細(xì)胞呈多邊形的上皮樣形態(tài)，并且?guī)缀鯖]有小細(xì)胞突，U-2 OS則與 MG-63 類似，細(xì)胞呈紡錘形至三角形，但是表現(xiàn)出上皮樣細(xì)胞形態(tài)，HOS、KRIB 及 143B 則呈多角形的上皮樣細(xì)胞。成熟活躍的 HOB 為梭形、錐形或立方形，胞漿嗜堿性，其細(xì)胞核位于細(xì)胞的一端，核仁明顯，表面有短的突起與相鄰細(xì)胞連接。

與成骨細(xì)胞不同，OS 細(xì)胞系不會(huì)根據(jù)細(xì)胞密度改變其細(xì)胞大小，OS 細(xì)胞系的增殖不會(huì)受到接觸抑制的影響，與人正常成骨細(xì)胞相比，所有 OS 細(xì)胞系的平均倍增時(shí)間均為人正常成骨細(xì)胞 1 / 2～1 / 3，飽和密度高 15～20 倍。

七、成骨能力

大部分人骨肉瘤細(xì)胞系呈成骨細(xì)胞樣改變，在幾種OS 細(xì)胞系中 Saos-2 的成骨能力相對(duì)較強(qiáng)，成骨伴隨著鈣化的細(xì)胞外基質(zhì)及 ALP 升高，Saos-2 細(xì)胞的基礎(chǔ) ALP 活性比其它已建立的人類骨肉瘤細(xì)胞系高 100～1000 倍，ALP 經(jīng)常被用作成骨細(xì)胞譜系和成骨細(xì)胞活性細(xì)胞的標(biāo)志物。根據(jù) ALP 的 mRNA 表達(dá)量，成骨細(xì)胞系成骨能力的強(qiáng)弱如下：Saos-2 ＞ HOS ＞ MG-63。Saos-2 和 MG-63 受1,25-(OH)-VitD和 PTH 的調(diào)節(jié)，在使用 1,25-(OH)-VitD誘導(dǎo)后，OC 的含量也會(huì)有所提升。

八、免疫學(xué)標(biāo)記物

幾種人骨肉瘤細(xì)胞系的標(biāo)記物表達(dá)也是各不相同的，不同細(xì)胞系不僅表達(dá)的標(biāo)記物的種類會(huì)有所差異，并且表達(dá)相同標(biāo)記物的強(qiáng)度也會(huì)各不相同。在 MG-63 細(xì)胞中，成骨細(xì)胞標(biāo)記 OC，BSP 可以檢測(cè)到，MMP-9 在大多數(shù)MG-63 細(xì)胞中呈陽(yáng)性。Saos-2 細(xì)胞中成骨細(xì)胞標(biāo)志物OC，BSP，Decorin 和前膠原蛋白 Ⅰ 均為陽(yáng)性，Ⅲ 型膠原蛋白和破骨細(xì)胞抑制因子 ( OPG ) 只能在大約 15% 的細(xì)胞中檢測(cè)到，Saos-2 細(xì)胞表現(xiàn)出最成熟的成骨細(xì)胞表型。與前兩種細(xì)胞系之相反的是，U-2 OS 細(xì)胞中 OC 和 Decorin為陰性，不到 50% 的細(xì)胞 Ⅰ 型膠原蛋白呈陽(yáng)性。MG-63細(xì)胞的標(biāo)記圖譜顯示介于成熟和不成熟的成骨細(xì)胞特征，并且是所有 OS 細(xì)胞系中最異質(zhì)的。對(duì) OS 類骨質(zhì)有貢獻(xiàn)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)分析揭示了每種 OS 衍生細(xì)胞系的獨(dú)特標(biāo)記結(jié)果。值得一提的是 OS 細(xì)胞系的表達(dá)并不受到細(xì)胞密度的影響。

九、基因組學(xué)差異

影響人骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的主要基因包括原癌基因和抑癌基因，人骨肉瘤細(xì)胞系目前的基因組學(xué)的研究主要聚焦于功能組學(xué)方面，從基因?qū)用嫜芯坎煌?xì)胞系之間的表型差異、發(fā)生發(fā)展方式及對(duì)于藥物敏感性的影響。不同細(xì)胞系的起源不同，因此基因表達(dá)各有不同 ( 表 2 )，Luk 等通過基因本體分類、層次聚類、功能注釋分析和轉(zhuǎn)錄因子及其靶點(diǎn)檢測(cè) Saos-2 和 U-2 OS 細(xì)胞之間的差異，發(fā)現(xiàn) Saos-2 細(xì)胞中的基因表達(dá)類型更傾向于成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞這兩種骨形成細(xì)胞類型，而 U-2 OS 細(xì)胞中的基因表達(dá)則類似為脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。不同細(xì)胞系間的凋亡途徑也有所不同，有學(xué)者利用基因測(cè)序的方法檢測(cè)參與癌癥發(fā)展的多梳抑制復(fù)合物 2 ( PRC2 ) 在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在 U-2 OS 和 143B 細(xì)胞系中PRC2 功能完全喪失，相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，但在 MG-63、HOS、SAOS2 中卻出現(xiàn)高表達(dá)?；虻牟煌磉_(dá)也影響著細(xì)胞的耐藥，Kuijjer 等分析了 U-2 OS 和 HOS 的全基因組基因表達(dá)數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示其中基因組穩(wěn)定性的通路高度失調(diào)，且用 Akt 抑制劑處理細(xì)胞時(shí)，對(duì) ADM 感的U-2 OS 和 HOS 受到抑制，但不會(huì)影響對(duì) ADM 較不敏感的143B，對(duì)細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究提供了新的思路?；蚪M學(xué)的研究反過來也指導(dǎo)著治療，Wu 等通過構(gòu)建靶向激酶組的 RISPR-Cas9 文庫(kù)，篩選出 53 個(gè)潛在的激酶靶點(diǎn)，為治療 OS 提供了潛在的治療激酶靶點(diǎn)。

十、試驗(yàn)研究的選擇

雖然以上常見的細(xì)胞系均來自人骨肉瘤，但現(xiàn)已知其具有不同的特點(diǎn)，選擇合適的細(xì)胞系可以更好地反應(yīng)研究的結(jié)果，筆者搜索并整理了 2019年 1 月至 2021年 3 月，有關(guān)以上 6 種人骨肉瘤細(xì)胞系的相關(guān)文獻(xiàn)，按照研究?jī)?nèi)容和年限，將文章進(jìn)行分類 ( 表 2 )，通過限制影響因子點(diǎn)數(shù)的方式，將篩選的文章數(shù)量控制，每年在 20 篇左右 ( 因?yàn)?2021年統(tǒng)計(jì)不完全，因此沒有設(shè)置篩選條件 )，剔除一些重復(fù)文章及綜述討論，共檢索出 150 篇獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)提示，除了 KRIB，其它 5 種細(xì)胞系都在近 3年都進(jìn)行過廣泛的研究，尤其以 MG-63 的文獻(xiàn)最多，從總體而言，當(dāng)前對(duì)于 OS 的研究多聚焦于 OS 化療藥物、免疫表型、非編碼 RNA 及基因組學(xué)的研究。對(duì)于 OS 的化療藥物方面的研究，學(xué)者們多聚焦于一些草本植物提取物如紫花苜蓿 ( Onosma brteata Wall )，橄欖苷 ( Oleu )、辣椒素( capsaicin )等，研究的角度也從藥物直接對(duì)于腫瘤的殺傷作用、藥物之間相互協(xié)同殺傷作用及調(diào)節(jié)化療藥物耐藥的角度出發(fā)。其中，研究對(duì)象多為穩(wěn)定且增殖率較高的MG-63、HOS、143B 細(xì)胞系。除了藥物本身，藥物載體的研究也開始向更微觀且兼顧抗癌效果的方面展開。

表2 MG 63、HOS、Saos-2、U2OS、143B 細(xì)胞系高表達(dá)基因 [63-68]Tab.2 Highly expressed genes in MG-63, HOS, Saos-2, U2 OS and 143B cell lines

對(duì)于 OS 細(xì)胞免疫表型的研究則多為能夠影響 OS 細(xì)胞凋亡或耐藥反應(yīng)的一些細(xì)胞因子、細(xì)胞受體的研究。在細(xì)胞受體方面，P2X7 受體，溶血磷脂酸 ( LPA ) 受體參與 OS 生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。此外，學(xué)者們還進(jìn)行了多種細(xì)胞周期及信號(hào)通路的研究，EGFR / PI3K / AKT 信號(hào)通路會(huì)促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞增殖，而 MUC 15 基因通過下調(diào) MMP2 / 9 的表達(dá)并沉默 Wnt / β-Catenin 信號(hào)通路來促進(jìn) OS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

近年來，非編碼 RNA 在腫瘤進(jìn)展中作用的研究愈來愈熱，四大熱點(diǎn)非編碼 RNA 研究對(duì)象包括 LncRNA，miRNA，CircRNA 及 piRNA，其中以 miRNA 研究數(shù)目最多，LncRNA 次之，circRNA 最少 ( 表 3 )。miRNA 在OS 中的研究已經(jīng)非常廣泛，研究對(duì)象以 MG-63 最多，Saos-2、U-2 OS 及 HOS 次之，KRIB，143B 最少 ( 表 3 )，多數(shù) miRNA 在不同 OS 細(xì)胞系中的作用大致相同，起到抑癌或促癌作用。如 miR-511 在 MG-63、Saos-2、U-2 OS細(xì)胞中均抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，并阻礙腫瘤的轉(zhuǎn)移，且 miR-511 對(duì) MG-63 的抑制作用最為強(qiáng)烈。有趣的是，有的 miRNA 會(huì)在不同的細(xì)胞系中產(chǎn)生巨大的表達(dá)差異，如 miRNA-122 和 miRNA-96 在 HOS，Saos-2 和 U-2 OS 細(xì)胞中會(huì)顯著上調(diào)，而在 MG-63 細(xì)胞中則下調(diào)。除了同種類非編碼 RNA 單獨(dú)的研究，不同種類非編碼 RNA協(xié)同及拮抗作用，外泌體與非編碼 RNA 之間聯(lián)系的研究也進(jìn)行的如火如荼。

表3 2019年至 2021年有關(guān) MG-63、Saos-2、U-2 OS、HOS、KRIB、143B 的研究文獻(xiàn)Tab.3 Research articles on MG-63, Saos-2, U-2 OS, HOS, KRIB and 143B from 2019 to 2021

在骨組織工程及材料研究中，人骨肉瘤細(xì)胞系主要用來評(píng)估支架抗癌抑癌的作用。Diwu 在含有乳酸 ( LA )-聚乙二醇 ( PEG )-天冬氨酸 ( AS ) 復(fù)合材料的羥基磷灰石支架加入長(zhǎng)春新堿 ( VCR )，發(fā)現(xiàn)可以明顯降低 MG-63 及SAO-2 細(xì)胞活性，并且有良好的骨再生能力。在材料方面，OS 細(xì)胞系還能夠檢驗(yàn)化療藥物載體對(duì)于化療藥物治療 OS 的效果，Li K 設(shè)計(jì)的碳酸鈣 ( CaCO ) 核交聯(lián)的甲氧基聚 ( 乙二醇 )-聚 ( 1-谷氨酸 ) 納米顆粒，在 143B 細(xì)胞有著輸送 ADM ( DOX ) 的優(yōu)越性能。人骨肉瘤細(xì)胞系豐富了骨組織工程及材料學(xué)中細(xì)胞的選擇，在骨組織工程應(yīng)用治療 OS 中扮演著重要角色。

以上 6 種常見的人骨肉瘤細(xì)胞系雖然都來自于 OS 組織或由其它細(xì)胞系轉(zhuǎn)化而來，但每種細(xì)胞系都有各自不同的特點(diǎn)，在實(shí)際研究中，選取合適的 OS 細(xì)胞系可能會(huì)獲得更理想的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。MG-63 細(xì)胞系具有很多優(yōu)勢(shì)，例如其穩(wěn)定的細(xì)胞增殖率可以保證細(xì)胞傳代的穩(wěn)定性，其幾乎可以無限次傳代細(xì)胞的特點(diǎn)允許 MG-63 細(xì)胞在國(guó)際上輕易獲取，因此，在全球范圍內(nèi)學(xué)者們可以在同一基準(zhǔn)面對(duì)其進(jìn)行比較研究，使其逐漸成為基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究中優(yōu)秀的研究對(duì)象。而 Saos-2 細(xì)胞因其成骨細(xì)胞的特點(diǎn)，可以用作成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的研究和成骨過程相關(guān)分子的研究。U-2 OS 也是一種應(yīng)用非常廣泛的人骨肉瘤細(xì)胞系，U-2 OS 可以反映動(dòng)物還原接種所形成腫瘤的能力。HOS 細(xì)胞作為一種表征得到充分印證的人骨肉瘤細(xì)胞系，適用于檢測(cè)可能的致病性病毒制劑，但須注意的是 HOS通過不同的誘導(dǎo)方式會(huì)得到不同致瘤能力的亞細(xì)胞群，因此研究 OS 致瘤能力時(shí)，須注意選擇合適的細(xì)胞系。KRIB作為第一個(gè)可以形成原位異種移植 OS 模型并同時(shí)自發(fā)肺轉(zhuǎn)移的 OS 細(xì)胞，適合用來研究 OS 在體內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)展過程及相關(guān)機(jī)制，但 KRIB 主要局限性在于它本質(zhì)上是轉(zhuǎn)化的 OS 細(xì)胞系，因此不能真正代表人體內(nèi)的狀況。此外，143B 因其高轉(zhuǎn)移潛能可用于研究促人類骨肉瘤擴(kuò)散的因素，它在原發(fā)部位和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位表現(xiàn)出不同程度的腫瘤生長(zhǎng)。然而，和 KRIB 細(xì)胞類似，它仍然是轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞系，缺乏一定的代表性。在進(jìn)行 OS 耐藥機(jī)制相關(guān)研究時(shí)，耐藥細(xì)胞株的獲得尤為重要，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中通常以藥物濃度遞增法誘導(dǎo)親代細(xì)胞制作為耐藥細(xì)胞系，目前在選擇親代細(xì)胞時(shí)常選擇 MG-63、Saos-2、HOS 等親代細(xì)胞系進(jìn)行，日后可通過建立 KRIB、143B、LM-7 等細(xì)胞系的耐藥株，進(jìn)一步研究 OS 耐藥的機(jī)制。

在實(shí)驗(yàn)的過程中，可不局限于單一的細(xì)胞系研究，廣泛嘗試多種細(xì)胞后才能更好地選取實(shí)驗(yàn)所需要的細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)對(duì)象的選取同時(shí)要參考前人已經(jīng)使用過的細(xì)胞系，避免無效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生。