蔗糖對(duì)擬南芥根系偏斜角度的影響

賈容容 楊亞婷 姬新宇 張凈然 田喜元

摘要：本文以野生型擬南芥Col-0及NRT1.1突變體nrt1.1-1和chl1-5為材料，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖，研究了蔗糖對(duì)擬南芥根系偏斜程度的影響。結(jié)果表明，0，3%蔗糖處理野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度有顯著性差異，突變體根系偏斜角度分別是野生型的1.34-1.80倍（nrt1.1-1）和1.71-2.05倍（chl1-5）。野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度均表現(xiàn)為隨蔗糖濃度的增加而增加，并在2%蔗糖處理達(dá)到最高。但3%蔗糖處理時(shí)，野生型Col-0根系偏斜角度有顯著性下降，而NRT1.1突變體沒有顯著性變化。該研究為深入研究氮代謝調(diào)控碳代謝提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蔗糖;擬南芥;根系偏斜;NRT1.1

根系是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可缺的器官，不僅起到固定、支持植物的作用，還能從土壤中吸收植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的水分和養(yǎng)分。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，根系能根據(jù)外界環(huán)境的變化不斷調(diào)整其生長(zhǎng)方向以保證其對(duì)水分和養(yǎng)分的最佳吸收狀態(tài)[1-2]。研究表明，擬南芥在瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，不同品種擬南芥根系的偏斜程度不同，Columbia 生長(zhǎng)有輕微的扭曲，而Landsberg和Wassilewskija有較大的偏斜[3]。此外，瓊脂的濃度也會(huì)影響擬南芥根系的傾斜幅度[4]?？梢姅M南芥根系的傾斜受品種、年齡以及外界環(huán)境影響。

前期研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂培養(yǎng)基上垂直生長(zhǎng)的擬南芥根系有嚴(yán)重偏離重力方向的傾向，且野生型的傾斜總是向左傾斜的，研究表明，這種生長(zhǎng)模式是根與培養(yǎng)基表面的機(jī)械接觸和重力共同的作用結(jié)果[1，5- 6]。其中，糖類是植物體內(nèi)重要的碳源和能源，它不僅參與能量代謝，還作為信號(hào)分子調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和生理過程[2]。糖作為植物生長(zhǎng)中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是否會(huì)對(duì)擬南芥的根系偏斜生長(zhǎng)造成影響;根的偏斜程度是否受糖濃度的影響尚不清楚。

另外，外源糖也可以參與對(duì)植物中氮同化酶以及離體葉片中硝酸還原酶的表達(dá)[7]。而NRT1.1是植物根系吸收硝酸鹽后第一個(gè)發(fā)揮作用的蛋白，除了參與植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)過程以外，還對(duì)植物吸收重金屬產(chǎn)生影響。Wang Wei的研究表明，AtNRT1.1可以通過磷酸化調(diào)控其硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活性來響應(yīng)環(huán)境中硝酸鹽的波動(dòng)。這一關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)表明，AtNRT1.1實(shí)際上是硝酸鹽傳感的轉(zhuǎn)環(huán)[8]。那么基于外源糖與植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)之間的關(guān)系，在擬南芥中，氮的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收在外源蔗糖供應(yīng)下擬南芥的根系偏斜生長(zhǎng)中是否存在一定的作用？基于此，本研究以野生型擬南芥Col-0及NRT1.1突變體chl1-5和nrt1.1-1為材料，通過在瓊脂培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖，研究了蔗糖對(duì)擬南芥根系偏斜程度的影響，并對(duì)擬南芥中NRT1.1基因在根系偏斜程度中的作用進(jìn)行了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：擬南芥野生型Col-0和擬南芥NRT1.1突變體nrt1.1-1、chl1-5。

供試營(yíng)養(yǎng)液：改良后MS營(yíng)養(yǎng)液（具體成分見表1，pH=5.8）。

1.2 植物培養(yǎng)

培養(yǎng)基配制：培養(yǎng)基使用改良后MS配制，向配制好的改良后MS營(yíng)養(yǎng)液中添加1%瓊脂和1%蔗糖，配制完成后滅菌，再將培養(yǎng)基晾至50℃左右，在超凈臺(tái)中向方形培養(yǎng)皿（10cm×10cm）倒入50ml培養(yǎng)基，在超凈臺(tái)中晾至培養(yǎng)基凝固（約25min）。

種子滅菌：將種子放入1.5ml離心管中，加入70% 酒精，浸泡1min后加入20 %次氯酸鈉+0.5%吐溫20浸泡10min，使用滅菌水清洗5-6次后，待用。

植物培養(yǎng)：使用槍頭將滅菌后種子點(diǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上，20-25粒/排，3-4排/板。直至種子點(diǎn)完，使用封口膜將培養(yǎng)皿邊緣封住。將播種好種子的培養(yǎng)皿放入4℃冰箱中24h后將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱條件：光照/黑暗（16h/8h），溫度（21℃/ 20℃）。培養(yǎng)4天后進(jìn)行處理。轉(zhuǎn)移至不同濃度蔗糖的平板，轉(zhuǎn)移時(shí)將根豎直朝下放置，封口膜封口，然后豎立（根朝下）放置至培養(yǎng)箱。培養(yǎng)7天。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基使用改良后MS營(yíng)養(yǎng)液配制，向配制好的改良后MS營(yíng)養(yǎng)液中添加1%瓊脂和相應(yīng)濃度蔗糖，蔗糖含量分別為0，1%，2%，3%。配制完成后滅菌，滅菌將培養(yǎng)基晾至50℃左右后在超凈臺(tái)中倒入50ml至方形培養(yǎng)皿中，在超凈臺(tái)中晾至培養(yǎng)基凝固（約25min）。將培養(yǎng)4天后擬南芥轉(zhuǎn)移至不同濃度蔗糖的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移時(shí)將根豎直放置于培養(yǎng)基上，4株/培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，封口膜封口，然后將根豎直朝下放置至培養(yǎng)箱。培養(yǎng)7天后收獲。

1.4 測(cè)量指標(biāo)及方法

收獲培養(yǎng)7天后的擬南芥幼苗，使用全自動(dòng)根系掃描儀對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行掃描，用 ImageJ-Evan 測(cè)量幼苗根長(zhǎng)和傾斜程度;用剪刀剪下主根根尖部分，I2-KI溶液染色，制片后用顯微鏡（x100）觀察根尖中的淀粉粒，并用顯微鏡配置的數(shù)碼照相機(jī)拍攝根尖;每2株植株作為一個(gè)樣品，測(cè)量并記錄其生物量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010辦公軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用SPSS15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖對(duì)擬南芥根系偏斜方向的影響

擬南芥根系的傾斜是瓊脂表面的依賴行為，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以影響到根系的傾斜。研究表明，無論是野生型Col-0還是NRT1.1突變體，各濃度蔗糖培養(yǎng)基上的根系的根尖均存在向左傾斜的現(xiàn)象。由表2可見，無論是野生型還是突變體擬南芥，根系偏斜角度均表現(xiàn)為隨蔗糖濃度的增加先增加后降低，并在2%蔗糖處理達(dá)到最高，野生型Col-0，突變體chl1-5和nrt1.1-1擬南芥根系偏斜角度分別是不添加蔗糖的2.65倍，1.68倍，1.50倍。但是，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到3%時(shí)，野生型擬南芥Col-0根系傾斜角度顯著降低，而NRT1.1突變體chl1-5和nrt1.1-1根系傾斜角度與2%蔗糖處理差異不顯著。在0蔗糖處理時(shí)，野生型Col-0與NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度有顯著性差異，NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度分別是野生型Col-0擬南芥根系偏斜角度的1.34倍（chl1-5），1.71倍（nrt1.1-1）。在1%，2%蔗糖處理時(shí)，野生型擬南芥根系偏斜角度比NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度大，但差異不顯著。在3%蔗糖處理時(shí)，野生型Col-0與NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度存在顯著性差異，突變體ch11-5與突變體nrt1.1擬南芥根系偏斜角度分別是野生型Col-0擬南芥根系偏斜角度的1.80倍，2.05倍。這說明，NRT1.1突變體根系偏斜程度受蔗糖濃度影響程度小于野生型。

2.2 不同濃度蔗糖對(duì)擬南芥主根長(zhǎng)的影響

由表3可知，無論是野生型還是NRT1.1突變體擬南芥，添加蔗糖均會(huì)顯著提高主根長(zhǎng)度。添加3%蔗糖處理，野生型Col-0，突變體chl1-5和nrt1.1-1擬南芥主根長(zhǎng)分別是不添加蔗糖的1.52倍，1.58倍和1.50倍。另外，對(duì)不同濃度下各擬南芥根長(zhǎng)與根傾斜角度進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，野生型和NRT1.1突變體的根長(zhǎng)和根系傾斜角度不存在顯著相關(guān)關(guān)系（P>0.05）。

2.3 不同濃度蔗糖對(duì)擬南芥生物量的影響

由表4可知，無論野生型還是NRT1.1突變體擬南芥，添加蔗糖均會(huì)顯著提高擬南芥的生物量。添加3%蔗糖處理，野生型Col-0，突變體chl1-5和nrt1.1-1擬南芥生物量分別是不添加蔗糖的2.54倍，2.10倍和2.40倍。NRT1.1突變體生物量受蔗糖濃度影響程度小于野生型。另外，對(duì)不同濃度下各擬南芥生物量與根傾斜角度進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，野生型和NRT1.1突變體的生物量與根系傾斜角度均不存在顯著相關(guān)關(guān)系。（P>0.05）。

2.4 I2-KI溶液染色結(jié)果

目前，對(duì)于植物感受重力刺激機(jī)制多為淀粉-平衡石假說，該假說認(rèn)為植物當(dāng)重力方向發(fā)生改變時(shí)，平衡石細(xì)胞內(nèi)的淀粉能夠沿重力方向沉降感受重力刺激[11]。因此，根尖的淀粉粒含量直接影響植物根系對(duì)重力信號(hào)的感受。

由圖1可以看出，NRT1.1突變體與野生型Col-0擬南芥根尖的淀粉粒在0%蔗糖濃度時(shí)淀粉含量最少。隨著蔗糖濃度含量的增加淀粉粒的顆粒由小逐漸變大，根尖淀粉粒逐漸增多，但野生型與突變體并沒有明顯差異。

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，在添加蔗糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)擬南芥時(shí)，其根系會(huì)出現(xiàn)明顯向左偏斜的行為。那么擬南芥根系的偏斜行為是否受蔗糖濃度的影響？氮的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)是否參與蔗糖對(duì)根系偏斜的影響過程？本研究結(jié)果顯示，蔗糖會(huì)影響根系生長(zhǎng)的偏斜程度，無論是野生型還是突變體擬南芥，根系偏斜角度均表現(xiàn)為隨蔗糖濃度的增加而增加，并在2%蔗糖處理達(dá)到最高，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到3%時(shí)，野生型擬南芥Col-0根系傾斜角度顯著降低，與不加蔗糖時(shí)根系傾斜角度差異不顯著，而NRT1.1突變體chl1-5和nrt1.1-1根系傾斜角度無顯著降低（見表2）。

在0%蔗糖處理時(shí)，野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度有顯著性差異，突變體擬南芥根系的偏斜程度比野生型大。氮代謝與碳代謝緊密相連，光合碳代謝為氮代謝提供能量和碳架，氮代謝同碳代謝競(jìng)爭(zhēng)光反應(yīng)生成的同化力和中間代謝產(chǎn)物[9]。在低氮情況下進(jìn)行光合作用的器官氮素降低，氮同化作用減弱，對(duì)光合作用的產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)減弱[10]。研究中，NRT1.1突變體因降低了擬南芥根系對(duì)氮吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，因此，與野生型擬南芥相比NRT1.1突變體擬南芥對(duì)氮素同化作用減弱，對(duì)擬南芥光合作用產(chǎn)生的蔗糖消耗更少。1%-2%蔗糖處理時(shí)，野生型擬南芥根系偏斜角度比NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度大，野生型與突變體擬南芥根系偏斜角度沒有顯著性差異。3%蔗糖處理，野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度有顯著性差異，突變體擬南芥根系的偏斜程度比野生型大。綜上所述，NRT1.1突變體根系偏斜程度受蔗糖濃度影響程度小于野生型，外源蔗糖可通過氮的吸收轉(zhuǎn)化調(diào)控?cái)M南芥根系的偏斜。

根系存在的向左偏斜行為可能是因?yàn)橥ㄟ^培養(yǎng)基中增加蔗糖濃度促進(jìn)其根系生長(zhǎng)，導(dǎo)致該現(xiàn)象擴(kuò)大。但研究中同時(shí)對(duì)擬南芥生物量、主根長(zhǎng)度進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，與根系傾斜角度并未出現(xiàn)顯著的相關(guān)關(guān)系。這也可能是因?yàn)楦獾矸哿Ｄ苡绊懼参锔祵?duì)重力的感受[11]，培養(yǎng)基中不同濃度蔗糖影響了根尖細(xì)胞淀粉粒的合成或分解，從而使根系偏斜角度增大。對(duì)根尖部位的淀粉粒進(jìn)行染色觀察可以發(fā)現(xiàn)，隨著蔗糖濃度的增加，擬南芥根尖中淀粉粒是增加的。淀粉-平衡石假說中認(rèn)為平衡石細(xì)胞中的淀粉體能夠沿著重力方向沉降感受重力刺激，引起植物體內(nèi)一系列信號(hào)分子的改變，使根的生長(zhǎng)方向發(fā)生改變。當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)根尖淀粉粒會(huì)被分解[11]，降低根尖對(duì)重力的感知從而使根系生長(zhǎng)方向發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中增加蔗糖濃度會(huì)使根尖細(xì)胞中淀粉粒增加，但野生型與突變體并沒有明顯差異。這表明，外源蔗糖不是完全依靠改變根尖淀粉粒含量來感知重力，除根尖淀粉外，植物體內(nèi)可能存在多種重力感受機(jī)制。

另外，已有研究表明，在根系生長(zhǎng)發(fā)育過程中，葡萄糖可以通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)途徑影響根系的定向響應(yīng)。培養(yǎng)基中葡萄糖（Glc）的存在也廣泛地調(diào)節(jié)了幼苗根系的生長(zhǎng)方向[12]。葡萄糖誘導(dǎo)根的傾斜顯著增強(qiáng)。葡萄糖作為糖信號(hào)與生長(zhǎng)素、乙烯、油菜內(nèi)酯素等植物激素共同相互作用控制葡萄糖誘導(dǎo)根傾斜[1，13- 14]。故在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖引起擬南芥根系傾斜變化，這可能不僅僅因?yàn)檎崽怯绊懥藬M南芥根系中淀粉粒的形成，還可能是通過糖的滲透效應(yīng)以及糖代謝引起的[10]。蔗糖被根系主動(dòng)吸收后被降解為葡萄糖和果糖單體，通過葡萄糖含量的增加去調(diào)控根系的偏斜程度，但這一猜測(cè)還需進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

1）野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度均表現(xiàn)為隨蔗糖濃度的增加而增加，并在2%蔗糖處理達(dá)到最高。

2）NRT1.1突變體根系偏斜程度受蔗糖濃度影響程度小于野生型，外源蔗糖可通過N的吸收轉(zhuǎn)化調(diào)控?cái)M南芥根系的偏斜。

3）不同濃度蔗糖處理下，無論野生型還是NRT1.1突變體擬南芥根系傾斜程度與生物量、根長(zhǎng)均無顯著正相關(guān)關(guān)系。

4）隨著蔗糖濃度含量的增加，擬南芥根尖中淀粉粒逐漸增多。但野生型Col-0與NRT1.1突變體的分布和含量沒有明顯區(qū)別，外源蔗糖不是完全依靠改變根尖淀粉粒含量來感知重力。除根尖淀粉外，植物體內(nèi)可能存在多種重力感受機(jī)制。

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