NR2C2介導(dǎo)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00675靶向miR-665調(diào)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究

汪建初，李曙波，陸禮柏，陳益晨，馬嘉盛，羅宗將，路遠(yuǎn)，浦澗

【摘要】 目的 探討研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00675對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其分子機(jī)制。

方法 通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)LINC00675在肝癌組織以及細(xì)胞中表達(dá)量，并檢測(cè)LINC00675在肝癌細(xì)胞HepG3與Huh7細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中的表達(dá)分布。通過(guò)在HepG3與Huh7中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒過(guò)表達(dá)LINC00675建立細(xì)胞模型。通過(guò)CCK-8與流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)LINC00675對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡行為的影響，并通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞模型中葡萄糖攝取量以及乳酸產(chǎn)量變化監(jiān)測(cè)細(xì)胞Warburg效應(yīng)的變化，運(yùn)用帶有AGO2抗體的RNA免疫沉淀技術(shù)評(píng)估LINC00675與mRNA的潛在結(jié)合能力。使用LncBase Predicted v.2 DIANA工具預(yù)測(cè)LINC00675下游mRNA靶基因。運(yùn)用RNA pull-down技術(shù)檢測(cè)LINC00675與miR-665結(jié)合的可能性。運(yùn)用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00675與miR-665的靶向結(jié)合，共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-665介導(dǎo)了LINC00675對(duì)肝癌生物學(xué)行為的影響。通過(guò)使用JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LINC00675上游調(diào)控基因。通過(guò)構(gòu)建NR2C2過(guò)表達(dá)以及敲低細(xì)胞模型，并使用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞模型中的LINC00675表達(dá)量的變化。運(yùn)用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LINC00675啟動(dòng)子與NR2C2的靶向結(jié)合位點(diǎn)。

結(jié)果 LINC00675在肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。過(guò)表達(dá)LINC00675抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力與Warburg效應(yīng)，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。NR2C2介導(dǎo)的LINC00675在肝癌細(xì)胞中靶向結(jié)合miR-665，負(fù)向調(diào)控miR-665的表達(dá)，并通過(guò)結(jié)合miR-665來(lái)調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

結(jié)論 NR2C2介導(dǎo)的LINC00675通過(guò)靶向結(jié)合miR-665調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡的生物學(xué)行為。

【關(guān)鍵詞】 LINC00675;miR-665;NR2C2;肝癌;增殖;凋亡;Warburg效應(yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.02.007

A study on mechanism of NR2C2 mediated long non-coding RNA LINC00675 targeting of miR-665 in regulating the biological behavior of HCC cells

[HJ1][HJ]

WANG Jianchu1， LI Shubo2， LU Libai1， CHEN Yichen1， MA Jiasheng1， LUO Zongjiang1， LU Yuan1， PU Jian1

（1. Department of Hepatobiliary Surgery， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Department of Biochemistry of Basic College， Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the effect of long non-coding RNA LINC00675 on the biological behavior of HCC cells and its molecular mechanism.

Methods The expression of LINC00675 in HCC tissues and cells was detected by qRT-PCR， and the expression and distribution of LINC00675 in the cytoplasm and nucleus of HCC cells HepG3 and Huh7 were detected.The cell model was established by stably transfecting lentivirus overexpression of LINC00675 in HepG3 and Huh7. The effects of LINC00675 on the proliferation and apoptosis of HCC cells were detected by CCK-8 and flow cytometry， and the changes of Warburg effect were monitored by detecting the changes of glucose uptake and lactic acid production in the cell model， and RNA immunoprecipitation with AGO2 antibody was used to evaluate the potential binding ability of LINC00675 and mRNA. LINC00675 downstream mRNA target genes were predicted by LncBase Predicted v.2 DIANA tool. The possibility of LINC00675 binding to miR-665 was examined by RNA pull-down technology. Luciferase assay was used to verify the targeted binding of LINC00675 to miR-665， and the co-transfection assay was used to verify that miR-665 mediated the effect of LINC00675 on the biological behavior of HCC. The LINC00675 upstream regulatory genes were predicted by using JASPAR database. The NR2C2 overexpression and knockdown cell model were constructed， and the changes of LINC00675 expression in the cell model were detected by qRT-PCR. In addition， the targeted binding site of the LINC00675 promoter to NR2C2 was verified by luciferase assay.

Results LINC00675 was low expressed in hepatoma cell lines and mainly expressed in cytoplasm. Overexpression of LINC00675 inhibited the proliferation and Warburg effect of hepatoma cells， and promoted the apoptosis of hepatoma cells. NR2C2 mediated LINC00675 binded miR-665 in hepatoma cells， negatively regulated the expression of miR-665， and regulated the biological behavior of hepatoma cells by binding miR-665.

Conclusion NR2C2 mediated LINC00675 regulates the biological behavior of proliferation and apoptosis of hepatoma cells by targeting the binding to miR-665.

【Key words】 LINC00675; miR-665; NR2C2; HCC; proliferation; apoptosis; Warburg effect

肝細(xì)胞癌是一種全世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，在世界上癌癥致死的常見(jiàn)原因中位居第四[1]。 據(jù)2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌在我國(guó)的患病率以及病死率均位居所有惡性腫瘤的前列[2]。由于肝癌具有進(jìn)展快、轉(zhuǎn)移廣等特征，約有70%的病人在首次診斷時(shí)已失去手術(shù)治療的機(jī)會(huì)[3]。肝癌已嚴(yán)重威脅人民的生命健康，也為醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)。目前迫切需要尋找到肝癌新的診斷和治療靶點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA作為非編碼RNA的一種，在過(guò)去幾十年已經(jīng)被廣泛研究。功能上，長(zhǎng)鏈非編碼RNA參與調(diào)節(jié)了多種細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括增殖、遷移、侵襲、凋亡等[4～8]。機(jī)制上，長(zhǎng)鏈非編碼RNA可通過(guò)靶向結(jié)合下游信使RNA，并在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)。此外，長(zhǎng)鏈非編碼RNA還可通過(guò)與蛋白直接結(jié)合發(fā)揮作用[9～11]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。LINC00675已被發(fā)現(xiàn)參與了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括卵巢癌[12]、胰腺癌[13]、胃癌[14]等。然而，LINC00675是否參與了肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展尚不可知。本研究首先探究了LINC00675在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)，然后通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)LINC00675在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)量，檢測(cè)低表達(dá)LINC00675對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡能力的研究，并探究了其中的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中所使用的16例肝癌組織獲取于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科在2018至2019年所進(jìn)行肝癌部分切除術(shù)的病人。實(shí)驗(yàn)所使用肝癌細(xì)胞系293T工具細(xì)胞、人肝細(xì)胞LO2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)液采購(gòu)于美國(guó)HyClone公司;胎牛血清采購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;CCK-8與AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司;過(guò)表達(dá)慢病毒、小干擾RNA與miRNA質(zhì)粒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P公司; Lipofectamine 3000試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司;實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)所使用TRIzol試劑、PrimerScript RT Master以及SYBR?premix Ex Taq試劑盒購(gòu)于日本Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床組織樣本

肝癌組織和相鄰的癌旁組織樣本（距離腫瘤組織>3 cm）取自2018至2019年在本院進(jìn)行肝癌手術(shù)的16例病人。所有組織均經(jīng)過(guò)病理學(xué)鑒定，樣本研究獲得患者同意并簽署知情同意書(shū)。樣本組織切除后即刻保存于液氮中以備后續(xù)研究。本研究中所涉及肝癌組織樣本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。LINC00675在癌與癌旁組織中的表達(dá)量通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)完成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將肝癌細(xì)胞放置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培育、傳代。當(dāng)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行LV-LINC00675，以及miRNA轉(zhuǎn)染，并將NC空載體作為陰性對(duì)照。通過(guò)使用lipofectamine 3000試劑盒完成細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染2天后，提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。慢病毒質(zhì)粒、小干擾RNA以及miRNA質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建提供。

1.2.3 PCR定量

使用TRIzol提取細(xì)胞中的RNA，使用PrimerScript RT Master（Takara）試劑完成RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA過(guò)程，使用SYBR?premix Ex Taq（TaKaRa）完成PCR擴(kuò)增，U6作為miRNA內(nèi)參，GAPDH作為L(zhǎng)INC00675內(nèi)參，使用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中所使用引物如下 （5’到3’），LINC00675：上游 GCCTACTGCTCTGGATCATCTGGTA，下游 TGGCGTACAGGTCTTTGCGG;miR-665：上游 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCG，下游 AGGTGCACTGGATACGACAGGGGC;NR2C2：上游 CCTCTGGCCCATTGAGTGTTT，下游 GTCCACTGCGGTGACTATCTG;U6：上游 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA，下游 GGTGCACTGGATACGACAAAATATGG;GAPDH：上游 GGACCTGACCTGCCGTCTAG，下游 GTAGCCCAGGATGCCCTTGA。

1.2.4 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）

生物素標(biāo)記的LINC00675探針由IDT（美國(guó)集成DNA技術(shù)公司）設(shè)計(jì)和合成。探針信號(hào)由Alexa FluorTM 594 Tyramide SuperBoostTM （Thermo Fisher Scientific）試劑盒依照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

待肝癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞接種于96孔板中 （每孔細(xì)胞量104，并設(shè)置三個(gè)副孔）。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，之后加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)，在450 nm波長(zhǎng)處，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，并計(jì)算細(xì)胞的增殖/抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG3與Huh7及其陰性對(duì)照組細(xì)胞分別接種于6孔板中（每孔約105個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)24小時(shí)，用胰蛋白酶消化后使用PBS清洗三次。將細(xì)胞懸液調(diào)整至100 μL后根據(jù)說(shuō)明書(shū)加入定量AnnexinⅤ-FITC和PI，室溫避光20分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Warburg 效應(yīng)檢測(cè)

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用葡萄糖分析試劑盒（ab65333，英國(guó)劍橋Abcam）和乳酸分析試劑盒（ab65330，英國(guó)劍橋Abcam）對(duì)葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生進(jìn)行分析。使用微孔板讀取器檢測(cè)570 nm處的吸光度。

1.2.8 RNA免疫共沉淀

RNA免疫共沉淀根據(jù)Magna RIP RNA-binding protein immunoprecipitation kit （Millipore， Germany）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中加入AGO2抗體以及IgG抗體，通過(guò)PCR檢測(cè)蛋白沉淀物中的目的RNA表達(dá)。

1.2.9 RNA pull-down實(shí)驗(yàn)

將全長(zhǎng)的LINC00675序列交予上海吉?jiǎng)P公司進(jìn)行Biotinylate標(biāo)簽化，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，取細(xì)胞裂解液與C-1磁珠 （Life Technologies， USA）共同孵育，形成磁珠-探針復(fù)合物，使用PCR技術(shù)探測(cè)復(fù)合物中目的RNA的表達(dá)量。

1.2.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

將野生型（WT）與突變型（Mut）LINC00675序列插入pGL4.74載體中，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒，并與miR-665 mimic質(zhì)?；騈R2C2過(guò)表達(dá)慢病毒共同分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，24小時(shí)后使用熒光素酶報(bào)道系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性，并記錄結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用student t-test對(duì)兩組結(jié)果之間的差異進(jìn)行顯著性分析，使用One-way ANOVA方法對(duì)多組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異進(jìn)行顯著性分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 LINC00675在肝癌組織以及細(xì)胞系中的低表達(dá)

首先我們探究了LINC00675在肝癌組織以及細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比較，LINC00675在癌組織中表達(dá)降低 （P<0.05），見(jiàn)圖1A。與正常肝細(xì)胞LO2相比較，LINC00675在肝癌細(xì)胞中普遍低表達(dá)，且在肝癌細(xì)胞HepG3和Huh7中表達(dá)最低（P<0.01），見(jiàn)圖1B。之后我們檢測(cè)了LINC00675在肝癌細(xì)胞HepG3和Huh7的細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞核中的表達(dá)量，結(jié)果顯示LINC00675在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)， 但在細(xì)胞核中低表達(dá)（P<0.001），見(jiàn)圖1C與D。為進(jìn)一步研究LINC00675在肝癌細(xì)胞中的功能，我們通過(guò)將LV-LINC00675及其陰性對(duì)照組（LV-NC）轉(zhuǎn)染至HepG3和Huh7細(xì)胞中，結(jié)果顯示LV-LINC00675明顯提升了LINC00675在HepG3和Huh7中的表達(dá)（P<0.01），見(jiàn)圖1E。

2.2 LINC00675過(guò)表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖與Warburg效應(yīng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

我們通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)的LINC00675細(xì)胞HepG3和Huh7進(jìn)行功能學(xué)研究，CCK-8結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組（LV-NC）相比較，細(xì)胞HepG3和Huh7在過(guò)表達(dá)LINC00675后的細(xì)胞增殖能力明顯降低（P< 0.05），見(jiàn)圖2A和B。而與陰性對(duì)照組（LV-NC）相比較，HepG3和Huh7細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象在LINC00675過(guò)表達(dá)之后顯著增高（P<0.05），見(jiàn)圖2C和D。此外，過(guò)表達(dá)LINC00675顯著抑制了肝癌細(xì)胞葡萄糖的攝取量以及乳酸的產(chǎn)量（P<0.01），見(jiàn)圖2E和F。

2.3 LINC00675靶向結(jié)合miR-665

為探究LINC00675調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和凋亡現(xiàn)象背后的分子機(jī)制，我們對(duì)LINC00675下游分子進(jìn)行了探究。AGO2-免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組IgG抗體對(duì)比，LINC00675與AGO2抗體大量結(jié)合，表明LINC00675可能與miRNA結(jié)合（P<0.001），見(jiàn)圖3A。通過(guò)使用生物信息網(wǎng)站LncBase Predicted v.2 DIANA工具，我們發(fā)現(xiàn)mircoRNA miR-655是LINC00675的潛在靶基因，結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3B。之后我們進(jìn)行了RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示相比于陰性對(duì)照組（Bio-NC探針），miR-655大量聚集于Bio-LINC00675探針（P<0.001），見(jiàn)圖3C。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示在293T工具細(xì)胞以及肝癌HepG3細(xì)胞中，WT組LINC00675能夠與miR-665結(jié)合（P<0.01），見(jiàn)圖3D和E。我們對(duì)LINC00675是否影響miR-665的表達(dá)進(jìn)行了探究，在HepG3和Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)LINC00675（OE-LINC）顯著降低了miR-665的表達(dá)（P<0.001），見(jiàn)圖3F。

2.4 LINC00675通過(guò)靶向miR-665調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為

為了探究miR-665是否參與了LINC00675調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的過(guò)程，我們進(jìn)行了共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，并對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了檢測(cè)，見(jiàn)圖4A。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-665減輕了LINC00675過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG3和Huh7增殖能力的抑制作用（P<0.05），見(jiàn)圖4B和C;過(guò)表達(dá)miR-665后， LINC00675過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞HepG3和Huh7的凋亡現(xiàn)象也發(fā)生了減弱（P<0.05），見(jiàn)圖4D和E。此外，miR-665過(guò)表達(dá)反轉(zhuǎn)了LINC00675過(guò)表達(dá)對(duì)于肝癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)的抑制作用（P<0.01），見(jiàn)圖4F和G。

2.5 NR2C2介導(dǎo)LINC00675在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們探究了LINC00675在肝癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及其下游的分子機(jī)制。然而LINC00675的上游分子機(jī)制仍不清楚，我們通過(guò)使用JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LINC00675的上游轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)核受體亞家族2 C組成員2（Nuclear Receptor Subfamily 2 Group C Member 2，NR2C2）蛋白可能調(diào)控LINC00675啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。我們構(gòu)建了NR2C2的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)以及敲低細(xì)胞模型，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LINC00675在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)被NR2C2正向調(diào)控（P<0.01），見(jiàn)圖5A和B。NR2C2在LINC00675啟動(dòng)子上的靶基序列以及可能靶向的LINC00675啟動(dòng)子序列在JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)上獲得，見(jiàn)圖5C和D。此外，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示數(shù)據(jù)庫(kù)所預(yù)測(cè)的LINC00675啟動(dòng)子上的三個(gè)靶標(biāo)（P1、P2和P3）都可以與NR2C2結(jié)合（P<0.01），見(jiàn)圖E和F。

3 討 論

本研究首先發(fā)現(xiàn)了LINC00675在肝癌組織以及多種肝癌細(xì)胞系中的低表達(dá)，且發(fā)現(xiàn)LINC00675主要表達(dá)于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這些結(jié)果表明，LINC00675可能參與調(diào)控了肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為。之后，我們通過(guò)使用肝癌細(xì)胞HepG3和Huh7構(gòu)建LINC00675穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，并進(jìn)行了功能學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HepG3和Huh7細(xì)胞在過(guò)表達(dá)LINC00675之后，其細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞中的Warburg效應(yīng)明顯減弱，而細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯增強(qiáng)。LINC00675在多種惡性腫瘤中也被發(fā)現(xiàn)表達(dá)失調(diào)，并參與調(diào)控了細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，以及腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程，且其在腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)量與病人預(yù)后密切相關(guān)[15～18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LINC00675參與調(diào)控了肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，并首次發(fā)現(xiàn)LINC00675參與調(diào)控了肝癌細(xì)胞Warburg效應(yīng)。

miR-665已被報(bào)道通過(guò)靶向PTPRB后降低Hippo信號(hào)通路的蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。外泌體miR-665在肝癌病人體內(nèi)的表達(dá)水平被證實(shí)可以作為獨(dú)立的診斷和預(yù)后因素[20]。此外，miR-665作為環(huán)狀RNA circABCC2的下游靶分子，調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡[21]。以上研究顯示，miR-665分別通過(guò)自身表達(dá)量改變，外泌體形態(tài)，以及作為環(huán)狀RNA的靶基因參與了肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控，表明miR-665在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要作用。本研究首先通過(guò)AGO2 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)評(píng)估了LINC00675與miRNA的結(jié)合能力，之后運(yùn)用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)LINC00675的miRNA靶基因，在RNA pull-down以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)LINC00675靶向結(jié)合miR-665。通過(guò)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本研究發(fā)現(xiàn)LINC00675通過(guò)靶向結(jié)合miR-665，并負(fù)向調(diào)控miR-665的表達(dá)，調(diào)控了肝癌細(xì)胞的增殖和凋亡。此外，本研究結(jié)果表明LINC00675在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)可被NR2C2轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

本研究部分闡述了LINC00675在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能以及上游及下游的直接分子機(jī)制。然而，LINC00675的臨床意義以及表達(dá)特征仍需足夠數(shù)量的肝癌樣本進(jìn)行深入分析。此外下游的蛋白機(jī)制及分子通路仍待進(jìn)一步探索研究，進(jìn)而更加明確地闡述在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中LINC00675發(fā)揮生物學(xué)功能背后的具體分子機(jī)制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LINC00675在肝癌細(xì)胞中普遍低表達(dá)，NR2C2誘導(dǎo)的LINC00675通過(guò)靶向結(jié)合miR-665調(diào)控了肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)LINC00675可能作為肝癌診斷以及治療研究的新靶點(diǎn)，并為肝癌的分子治療研究提供新的策略。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-08-27 修回日期：2021-11-03）

（編輯：潘明志）