1種新型喹唑啉類抗癌試劑的合成及其抗癌活性研究

張 晗 李萬婷 石海龍 李 琰

(紹興文理學院 化學化工學院，浙江 紹興 312000)

0 引言

ROS包括一系列的氧自由基和非自由基型ROS.在正常的生理條件下，ROS在生物體系中可通過很多刺激因素生成，但在抗氧化酶的作用下，它又會被反應消耗掉從而保持著一個動態(tài)的平衡[1].作為信號分子的一種，ROS被證實可以參與很多細胞信號轉導的過程，對維持機體正常的生理功能至關重要[2].而另一方面，細胞內ROS的生成一旦超負荷，會導致DNA、蛋白質等很多細胞重要大分子的結構破壞、功能紊亂，觸發(fā)氧化還原敏感的細胞死亡信號通路，導致細胞生長抑制甚至死亡[3].研究表明，癌細胞具有線粒體功能缺陷、無限制增殖、新血管快速形成、向其他組織轉移等惡性特征.為了滿足其快速失控的生長所需要的能量供給，癌細胞內的氧化還原狀態(tài)相比正常細胞發(fā)生了明顯的變化，其ROS的水平明顯升高.因此破壞細胞抗氧化的能力或增加細胞內氧化應激的程度，對于癌細胞來說顯得更加致命[4].癌細胞與正常細胞氧化還原狀態(tài)的不同成為癌細胞的一大致命弱點，也成為通過促ROS生成的策略來實現(xiàn)癌癥治療的依據.這一新的抗癌策略受到越來越多研究者的關注和認同.即利用促氧化劑誘導ROS產生，破壞癌細胞正常生長增殖所依賴的氧化還原調控能力，使癌細胞先于正常細胞到達死亡線，而正常細胞由于其較低的ROS本底水平而免受其害[4].

據報道，很多導致細胞功能異常，細胞周期紊亂及凋亡從而殺死癌細胞的毒性試劑都是通過誘導ROS的產生來發(fā)揮作用的，包括常用的化療試劑如市售的抗癌藥5-氟尿嘧啶[5]和紫杉醇[6].更有意思的是，在基于ROS的抗癌藥物中，很多都含有Michael受體單元.Michael受體作為親電試劑可以靶向很多細胞防御體系的功能蛋白，包括負責機體防御反應、細胞凋亡及腫瘤生長抑制過程信息傳遞的NF-κB或負責維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的硫氧還蛋白還原酶等.Michael受體單元可與靶蛋白功能區(qū)域的巰基(-SH)殘基發(fā)生共價加成反應破壞其功能性，或通過蛋白半胱氨酸上-SH和其二硫鍵(-S-S-)的轉換實現(xiàn)對靶蛋白的氧化修飾，導致氧化還原體系的破壞，進而誘導細胞凋亡.因此含有Michael受體單元(a,b-不飽和酮)藥效團的親電小分子已成為近年來抗癌藥物研究的一大熱點[7].例如姜黃素[8]、二甲基富馬酸[9]、肉桂醛[10]、6-姜烯酚[11]、小白菊內酯[12]及蓽茇酰胺[13]等含有a,b-不飽和酮結構的天然來源的親電小分子都可通過促進ROS的生成而誘導癌細胞凋亡.尤其是小白菊內酯和蓽茇酰胺都具有非常優(yōu)越的癌細胞選擇性，不阻滯正常細胞的生長[12-13]，這也進一步證實了利用癌細胞的氧化還原缺陷來選擇性殺死癌細胞的策略具有合理性[4].

喹唑啉雜環(huán)是很多藥物結構中重要的核心骨架，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等非常廣譜的生理活性[14].在近年來基于喹唑啉骨架的藥物優(yōu)化設計工作中也發(fā)現(xiàn)了很多具有促氧化作用的喹唑啉類抗癌先導化合物[15].QNZ(圖1)也是一種喹唑啉類化合物，由于其優(yōu)異的NF-κB抑制活性而成為明星分子[16]，最近的研究發(fā)現(xiàn)它同時具有抗癌細胞增殖的活性[17].抗癌藥物阿法替尼也有著與QNZ相同的喹唑啉母環(huán)結構(如圖1)，并且在喹唑啉環(huán)的6位具有一個Michael受體單元，Michael受體單元的存在對其不可逆地抑制表皮生長因子受體(EGFR)起著重要的作用.這引起了我們對這一喹唑啉母環(huán)結構進一步修飾的極大興趣.

本文基于NF-κB抑制劑QNZ與EGFR抑制劑阿法替尼的結構共性，通過分子骨架雜合，設計合成一種新型親電分子QNZ-Afa(圖1).

圖1 QNZ、阿法替尼及化合物QNZ-Afa的分子結構

1 實驗

1.1 材料及所用儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、噻唑藍(MTT)、2′,7′-二氯熒光黃(DCFH-DA)等購于美國Sigma-Aldrich有限公司；凋亡試劑盒購于美國BD公司；人宮頸癌細胞(Hela)、人肝癌細胞(HepG2)及人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購于中科院上海細胞庫；其他試劑均為分析純以上級別.Bruker AV 400核磁共振儀(瑞士布魯克拜厄斯賓)；SX-500高壓滅菌鍋(日本Tomy Digital)；5430R高速冷凍離心機(德國艾本德)；FACSCanto流式細胞儀(美國BD)；CryoCube F570h超低溫冰箱(德國艾本德)；SB-2000型旋轉蒸發(fā)儀(德國海道夫)；真空干燥箱(上海一恒)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒)；RCT磁力攪拌器(IKA公司，德國)；Infinite M200酶標儀(瑞士Tecan).

1.2 化合物QNZ-Afa的合成

化合物QNZ-Afa可根據圖2中所示的路線進行合成，具體步驟如下：

圖2 化合物QNZ-Afa的合成路線

叔丁基(4-羥基苯乙基)氨基甲酸酯(2)[18]

首先將4-(2-氨乙基)苯酚(1，0.15 mol)溶解于200 mL四氫呋喃中，并依次加入碳酸氫鈉(0.3 mol)和二碳酸二叔丁酯(0.165 mol)，于室溫下攪拌過夜.反應液過濾后得到淺棕色的粗產物2，不再分離純化，待用.

叔丁基(4-苯氧基苯乙基)氨基甲酸酯(3)[18]

將化合物2(0.15 mol)溶解于400 mL干燥的乙腈中，并在O2氛下于室溫中依次加入苯基硼酸(0.225 mol)、吡啶(1.5 mol)及無水醋酸銅(0.15 mol).反應液在35 ℃下攪拌過夜，旋轉蒸發(fā)除去溶劑.將得到的固體殘渣重新溶于500 mL乙酸乙酯，攪拌2 h后過濾，收集濾液，依次用氨水(33%，100 mL)、純水(200 mL)、鹽酸溶液(6 N，150 mL)和飽和食鹽水(50 mL)洗兩次，用無水NaSO4干燥，過濾后旋干.得到的固體粗產物再經過柱層析(石油醚/乙酸乙酯，100/1至10/1)分離純化得到白色固體氨基甲酸酯3(產率86.7%).

2-(4-苯氧基)苯乙胺(4)[18]

將化合物3(0.10 mol)溶于60 mL乙酸乙酯，并于室溫下逐滴加入60 mL三氟乙酸，然后回流12 h.旋轉蒸發(fā)除去溶劑后，加入500 mL二氯甲烷和200 mL水溶解反應殘渣，向此兩相體系中緩慢加入碳酸鈉直至無明顯的氣泡生成，此時pH≈10.水相用200 mL二氯甲烷進行萃取，合并所有有機相，洗滌(飽和食鹽水)，無水NaSO4干燥，過濾后旋干.得到的固體粗產物再經過柱層析(二氯甲烷/甲醇，50/1至30/1)分離純化得到淺黃色油狀產物4(產率91.3%).

6-硝基-4-(4-苯氧基苯乙氨基)喹唑啉(5)[18]

將化合物(0.09 mol)、4-氯-6-硝基喹唑啉(0.086 mol)及三乙胺(0.129 mol)溶解于異丙醇，并分別在室溫下攪拌4 h，在15 ℃下攪拌4 h.過濾得到反應沉淀物，依次用冷的異丙醇/水(5/1，100 mL)和異丙醇(50 mL)進行洗滌，真空干燥后得到黃色結晶狀固體硝基喹唑啉5(產率84.8%).

6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙氨基)喹唑啉(QNZ)[18]

將化合物5(0.073 mol)溶解于400 mL四氫呋喃中，并在氫氣氛下向溶液中添加催化量的Pd/C(5%).反應液在室溫下攪拌5 h，過濾除去Pd/C，收集濾液并濃縮，得到的固體殘余物在乙酸乙酯中進行重結晶，得到淺黃色粉末狀固體產物QNZ(產率89.3%).

6-(4-溴巴豆酰氨基)-4-(4-苯氧基苯乙氨基)喹唑啉(6)

將4-溴巴豆酸(0.073 mol)溶解于20 mL干燥的二氯甲烷中，室溫下加入草酰氯(0.08 mol)，滴加2滴N,N-二甲基甲酰胺，繼續(xù)攪拌0.5 h，旋轉蒸發(fā)除去溶劑后，得到4-溴巴豆酰氯，待用.將化合物QNZ(0.56 mmol)和三乙胺(1.12 mmol)溶于5 mL干燥的四氫呋喃和1 mL N,N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，在0 ℃磁力攪拌下滴加現(xiàn)制的4-溴巴豆酰氯(0.73 mmol)，升高溫度至室溫，并繼續(xù)攪拌0.5 h，旋轉蒸發(fā)除去溶劑.得到的固體粗產物經過柱層析(二氯甲烷/甲醇，50/1至25/1)分離純化得到淺黃色粉末狀固體產物6(產率66.3%).

6-(4-二甲氨基巴豆酰氨基)-4-(4-苯氧基苯乙胺基)喹唑啉(QNZ-Afa)

將化合物6(0.33 mmol)和鹽酸二甲胺(0.39 mmol)溶解于4 mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入三乙胺(0.99 mmol)，室溫下攪拌3 h，旋轉蒸發(fā)除去溶劑后，得到的粗產物經過柱層析(二氯甲烷/甲醇，50/1至10/1)分離純化得到淺黃色粉末狀固體產物QNZ-Afa(產率56.4%).

QNZ-Afa：熔點131.4～132.0 ℃；1H NMR(400 MHz,DMSO-d6),δ2.21(s,6H),2.95-2.99(t,J=7.2 Hz,2H),3.10-3.12(d,J=5.6 Hz,2H),3.76-3.78(d,J=7.2 Hz,2H),6.35-6.39(d,J=15.6 Hz,1H),6.78-6.85(m,1H),6.95-6.99(t,J=7.6 Hz,4H),7.10-7.14(t,J=7.6 Hz,1H),7.29-7.30(d,J=8.8 Hz,2H),7.36-7.40(m,2H),7.66-7.68(d,J=9.2 Hz,1H),7.73-7.76(m,1H),8.30-8.32(t,J=5.2 Hz,1H),8.43(s,1H),8.59-8.60(d,J=1.2 Hz,1H),10.38(s,1H);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6),δ34.3(1C),42.7(1C),45.5(2C),60.1(1C),112.1(1C),115.5(1C),118.7(2C),119.3(2C),123.6(1C),126.3(1C),126.8(1C),128.5(1C),130.4(2C),130.7(2C),135.3(1C),136.6(1C),142.0(1C),146.3(1C),154.5(1C),155.2(1C),157.5(1C),159.4(1C),163.7(1C);MS(ESI)M/Z468[M+H]+.

1.3 化合物QNZ-Afa對癌細胞增殖抑制活性的測定

采用MTT比色法測定化合物QNZ-Afa對癌細胞的增殖抑制活性.將Hela或HepG2細胞以3×103個/孔，HUVEC細胞以5×103個/孔的密度分別種于96孔板中，37 ℃孵育過夜后加入一定濃度梯度(0、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、40 mM、50 mM)的QNZ-Afa，同時設定不加藥處理的對照孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 mL MTT，37 ℃下作用4 h.棄去MTT培養(yǎng)液，每孔加入100 mL色譜純的DMSO，混勻5 min，使生成的有色結晶溶于DMSO中.通過酶標儀在570 nm處進行吸光度值的檢測.抗氧化劑對QNZ-Afa細胞增殖抑制活性的影響也采用相同的MTT法測定，抗氧化劑處理組需提前1 h加入NAC(10 mM)或VE(500 mM)，再加入指定濃度的待測化合物孵育48 h.細胞存活率表示為相對于對照組的百分比，計算公式如下：細胞存活率(%)=加藥組吸光度值/對照組吸光度值×100%.每組實驗均獨立重復3次.

1.4 細胞凋亡的測定

本文采用Annexin V-PI雙染色法測定化合物誘導Hela細胞凋亡的能力.將Hela細胞以2×105個/孔的密度種至六孔板，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，加入化合物QNZ-Afa(5 mM、10 mM、15 mM)，孵育48 h，同時設定不加藥處理的對照孔.藥物處理后吸出培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化并分別收集各孔細胞于2 mL的離心管中，250 g轉速離心6 min除去培養(yǎng)基后，用4 ℃預冷的PBS緩沖液(1 mL/管)以相同轉速離心洗1～2次.對每管中的細胞進行計數(shù)，根據計數(shù)結果用稀釋至1×的Binding緩沖液調整細胞密度，每管中分別取兩份進行Annexin V與PI的單染.室溫下染色15 min，然后加入1×的Binding緩沖液稀釋，并于1 h內通過FACSCanto流式細胞儀進行檢測，每管采集細胞數(shù)104個，激發(fā)波488 nm，發(fā)射波長530 nm.通過FACSDiva軟件分析得到細胞不同狀態(tài)的比例.抗氧化劑對QNZ-Afa誘導細胞凋亡活性的影響也采用相同的方法測定，抗氧化劑處理組需要提前加入NAC(10 mM)預處理1 h，再加入15 mM的QNZ-Afa孵育48 h，同時設定抗氧化劑處理后不加藥的對照孔.每組實驗均獨立重復3次.

1.5 細胞內ROS水平的測定

熒光探針DCFH-DA具有細胞膜滲透性，它進入細胞后可在細胞酯酶的作用下水解得到不可透膜的DCFH，水解產物被胞內ROS氧化生成DCF.DCF是熒光物質，其熒光強度的大小就可反映細胞內ROS的濃度.將Hela細胞以3×105個/孔的密度種至六孔板中，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后換液，加入化合物QNZ-Afa(5 mM、10 mM、15 mM)，藥物作用3 h、6 h或9 h后吸出培養(yǎng)基，加入胰蛋白酶消化并分別收集各孔細胞于2 mL離心管中，250 g離心6 min除去培養(yǎng)基后用PBS緩沖液(1 mL/管)以相同轉速離心洗1～2次，然后加入DCFH-DA染料(終濃度為3 mM)，置于37 ℃溫箱中避光染色0.5 h.用PBS緩沖液洗去殘余染料后通過流式細胞儀進行檢測.所測熒光的激發(fā)波為488 nm，發(fā)射波長為525 nm.抗氧化劑對QNZ-Afa誘導細胞內ROS生成的影響也采用相同的方法測定，抗氧化劑處理組需要提前加入NAC(10 mM)或VE(500 mM)預處理1 h，再加入15 mM的QNZ-Afa孵育9 h，同時設定抗氧化劑處理后不加藥的對照孔.結果相對于對照組進行歸一化處理.每組實驗均獨立重復3次.

2 結果與討論

2.1 化合物的合成

基于喹唑啉類抗癌藥物QNZ與阿法替尼的結構共性，通過分子骨架雜合，設計合成了一種新型親電分子QNZ-Afa(圖1)，以4-(2-氨乙基)苯酚為原料通過圖2所示的合成路線首先合成化合物QNZ，再與4-溴巴豆酰氯反應得到a,b-不飽和酰胺結構，最后引入二甲氨基，得到目標化合物QNZ-Afa.

2.2 QNZ-Afa通過ROS依賴的方式選擇性地抑制癌細胞增殖

通過MTT法測定了化合物QNZ-Afa對Hela、HepG2及HUVEC的細胞增殖抑制活性，如圖3A所示，化合物作用48 h后，細胞存活率都表現(xiàn)出濃度依賴的降低.QNZ-Afa對Hela、HepG2及HUVEC三種細胞增殖抑制的IC50值分別為10.8 mM、16.7 mM和23.2 mM，從結果可知，QNZ-Afa在正常細胞HUVEC中表現(xiàn)出最小的細胞毒性，說明癌細胞相比于正常細胞更容易受到QNZ-Afa的毒性影響而被殺死，尤其Hela細胞對QNZ-Afa的耐受性最弱(圖3A).

基于QNZ-Afa對Hela細胞明顯的選擇性，采用Hela細胞作為模型進一步對其細胞毒性機制進行了研究.ROS是導致癌細胞生長阻滯并死亡的重要誘因之一.通過使用兩種ROS清除劑，N-乙酰半胱氨酸(NAC)和a-生育酚(VE)來闡明ROS在QNZ-Afa的毒性機制中是否發(fā)揮作用.如圖3B所示，NAC預處理1 h導致QNZ-Afa對Hela細胞增殖的抑制作用被完全逆轉.NAC是含有巰基的抗氧化劑，它們既可利用抗氧化活性清除ROS，也可以作為親核試劑與QNZ-Afa發(fā)生反應從而消除其Michael加成活性位點.相比之下，非親核性的VE只能作為抗氧化劑發(fā)揮作用，而VE預處理1 h后對QNZ-Afa抗癌細胞增殖的活性也表現(xiàn)出顯著的抑制效果.上述結果清晰地表明：ROS的產生對QNZ-Afa的細胞毒性起著至關重要的作用，而另一方面，Michael受體單元在這一過程中也作出了一定貢獻.

2.3 QNZ-Afa通過ROS依賴的方式誘導HepG2細胞凋亡

抑制細胞增殖導致細胞死亡的機制有很多種，通過PI染色及Annexin-V-FITC/PI雙染的方法探究了QNZ-Afa的增殖抑制活性是否來自于細胞凋亡誘導作用.從圖4可以看出，不同濃度的QNZ-Afa處理48 h后顯著地誘導了Hela細胞凋亡的發(fā)生，并且具有濃度依賴關系，15 mM的QNZ-Afa使細胞凋亡的比例超過了65%.ROS清除劑NAC預處理后可明顯地逆轉QNZ-Afa所誘導的細胞凋亡，而NAC單獨作用不會引起細胞凋亡的發(fā)生.這與細胞毒性測定中得到的結果相一致.以上結果也證實了QNZ-Afa誘導的細胞凋亡是其細胞增殖抑制活性機制的重要部分，并且這個過程中ROS扮演著重要的角色.

2.4 QNZ-Afa誘導Hela細胞中ROS的大量產生

基于前期實驗所證實的ROS的重要作用，采用流式細胞儀對Hela細胞內ROS的水平進行了檢測.結果如圖5所示，化合物QNZ-Afa能顯著地誘導Hela細胞中ROS的產生，ROS水平隨著濃度的增大而升高，從不同時間點的數(shù)據可以看出ROS的產生有時間依賴性.15 μM的QNZ-Afa作用9 h后可將細胞內ROS的水平提升到對照組水平的3.5倍.

圖5 QNZ-Afa作用后Hela細胞內ROS水平的變化及抗氧化劑NAC、VE對QNZ-Afa誘導的細胞內ROS累積的影響

值得注意的是，采用NAC或者VE都會導致QNZ-Afa促進ROS生成的能力大大削弱甚至喪失，在抗氧化劑的預孵育1 h后，同樣作用9 h，15 μM的QNZ-Afa對細胞內的ROS的水平幾乎沒有影響(圖5).而抗氧化劑NAC或VE單獨預處理1 h后以不含QNZ-Afa的培養(yǎng)基孵育相同時間，測得的胞內ROS含量與對照組也無明顯變化(圖5).上述結果表明，QNZ-Afa的促氧化能力很大程度上貢獻了其細胞凋亡誘導的活性，并且Michael受體單元也起到了必不可少的作用.

3 總結

本文基于NF-κB抑制劑QNZ與EGFR抑制劑阿法替尼的結構共性，通過分子骨架雜合，設計合成了一種新型喹唑啉類親電分子QNZ-Afa.并首次證實QNZ-Afa是一種優(yōu)異的選擇性抗癌試劑，它可以選擇性地阻滯Hela細胞的增殖，而對正常細胞HUVEC的細胞毒性卻大大減弱.抗氧化劑NAC或VE對QNZ-Afa抗癌細胞增殖能力的逆轉作用明確地表明了ROS在QNZ-Afa對Hela細胞增殖抑制的活性機制中發(fā)揮著重要的作用.值得一提的是，與非親核性抗氧化劑VE不同，作為含有巰基的抗氧化劑，NAC既可作為抗氧化劑清除ROS也可以作為親核試劑與QNZ-Afa發(fā)生反應從而消除其Michael加成活性位點.相比VE，NAC能更徹底地消除QNZ-Afa對Hela細胞的增殖抑制活性.這一結果清晰地表明：ROS的產生對QNZ-Afa的細胞毒性有著很大的貢獻，且Michael受體單元在其中也作出了一定貢獻.另一方面，細胞凋亡的發(fā)生是QNZ-Afa抑制Hela細胞增殖的關鍵原因，而在這一過程中，Michael受體依賴的ROS的產生也發(fā)揮著至關重要的作用.同時，也證實了QNZ-Afa作用后的確可以顯著地引起Hela細胞內ROS水平的升高，并且NAC與VE均可以完全逆轉QNZ-Afa誘導的ROS累積，這也進一步支持了ROS作為細胞凋亡重要調控者的結論.綜上所述，本文設計了一種新型喹唑啉類化合物QNZ-Afa，并發(fā)現(xiàn)它通過Michael受體依賴的促氧化作用而表現(xiàn)出選擇性的抗癌活性.QNZ-Afa可作為親電分子靶向癌細胞氧化還原缺陷，誘導Hela細胞內ROS的大量累積進而引發(fā)細胞內氧化還原平衡體系的崩潰，ROS升高，最終導致細胞凋亡.以上結論可為基于促氧化策略設計喹唑啉類抗癌試劑提供有價值的依據.