氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27和裸鼠移植瘤模型的抑制作用

黃義新 劉煒

胃癌(gastric cancer)是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率極高。因胃癌預(yù)后差，發(fā)病率不斷上升，已成為世界性的重大健康問題[1]。盡管外科手術(shù)是治療胃癌的關(guān)鍵方式，但化療和放化療對(duì)于改善可切除惡性腫瘤的預(yù)后是必不可少的[2]。目前，化療已成為治療中晚期胃癌的主要手段之一。作為一種標(biāo)準(zhǔn)的抗癌藥物，紫杉醇(paclitaxel，PTX)在許多腫瘤的治療中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，單一抗癌藥物紫杉醇治療中晚期胃癌的有效率為11%～23%，而聯(lián)合用藥的有效率為50%～60%[3]。目前，中藥聯(lián)合化療藥的治療模式已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，且取得可觀的療效[4]。氧化苦參堿(Oxymatrine，Oxy)是從豆科植物苦參中分離出來的一種生物堿，主要成分是氧化苦參堿，也含有少量的氧化槐果堿，具有清熱解毒、利尿、抑制病毒和抗腫瘤等多種功效。近年來，氧化苦參堿已用于腫瘤化療引起的白細(xì)胞減少癥的治療，已成為腫瘤化療研究的新熱點(diǎn)[5,6]。然而，Oxy與PTX聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人胃癌的協(xié)同抗腫瘤作用尚不清楚。因此，本研究探討Oxy聯(lián)合PTX對(duì)人胃癌HGC-27細(xì)胞和裸鼠移植瘤的抑制作用，以提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 氧化苦參堿注射液購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；紫杉醇注射液購自海南卓泰制藥有限公司；0.9%氯化鈉溶液購自武漢普諾賽生命科技；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；MTT檢測試劑和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；除抗體外Western blot檢測所需相關(guān)試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；PCNA和Cleaved Caspase-3單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自美國CST公司。

1.2 細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (1)人胃癌HGC-27細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，HGC-27細(xì)胞復(fù)蘇后置于RPMI-1640培養(yǎng)液中，并加入體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS，放置在37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至單層貼壁后，使用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)增殖期的HGC-27細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。(2)28只健康清潔級(jí)BALB/c裸鼠，4周齡，雌性，體重(20.0±2.0)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)裸鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度調(diào)整為20～25℃，相對(duì)濕度在40%～70%，本實(shí)驗(yàn)獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 HGC-27細(xì)胞分組處理 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)期的HGC-27細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并接種到96孔板中，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，放置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后分為4組：對(duì)照組(不處理)、氧化苦參堿組(氧化苦參堿2 mg/ml)、紫杉醇組(紫杉醇10 μmol/ml)和氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組(氧化苦參堿2 mg/ml+紫杉醇10 μmol/ml)，4組細(xì)胞加入相應(yīng)藥物處理24 h或48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。本研究加藥濃度參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率 4組HGC-27細(xì)胞藥物處理24、48 h后，吸去舊培養(yǎng)液，每孔細(xì)胞中加入100 μl MTT試劑(終濃度為5 mg/ml)，放回37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞，除去細(xì)胞上清液，再向每孔細(xì)胞中添加150 μl DMSO，振蕩溶解沉淀，以只添加培養(yǎng)液不加細(xì)胞的孔為空白調(diào)零孔，使用酶標(biāo)儀測定570 nm處各孔細(xì)胞的光密度(OD)值，計(jì)算4組HGC-27細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(藥物組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 HGC-27細(xì)胞分組處理48 h后，除去上清液，收集4組HGC-27細(xì)胞，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，制成濃度1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，向細(xì)胞懸液中添加Annexin V-FITC 5 μl，避光孵育5 min，后加入PI染液5 μl，混勻后，室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測4組HGC-27細(xì)胞凋亡情況，用ModFit LT軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測PCNA和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá) HGC-27細(xì)胞分組處理48 h后，加入適量裂解液，在冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心，上清即所需蛋白，采用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量測定，蛋白樣品與緩沖液混合后于沸水中加熱致蛋白變性，取40 μg蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后將膜放置在含10%脫脂奶粉的封閉液中孵育2 h，取出膜并洗滌3次，加入相應(yīng)稀釋的單抗，PCNA和Cleaved Caspase-3單抗均為1∶800稀釋，放置在4℃條件下雜交，次日取出膜并洗滌3次，加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育1.5 h，取出膜并洗滌3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，分析各條帶灰度值。計(jì)算HGC-27細(xì)胞中PCNA和Cleaved Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 動(dòng)物模型與分組 人胃癌HGC-27細(xì)胞與基底膜基質(zhì)按照體積比1∶1的比例進(jìn)行混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/ml，放置在冰盒中備用，BALB/c裸鼠采用3%～4%異氟醚進(jìn)行麻醉，每只裸鼠右前腋皮下接種約1×107個(gè)細(xì)胞，接種7 d后，當(dāng)移植瘤平均體積約144 mm3時(shí)(參考文獻(xiàn)[7]的方法判斷構(gòu)建模型是否成功)，將28只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為4組(每組7只)：對(duì)照組(Mock組：0.9%氯化鈉溶液)、氧化苦參堿組(Oxy組：氧化苦參堿75 mg/kg)、紫杉醇組(PTX組：紫杉醇10 mg/kg)和氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組(Oxy+PTX組：氧化苦參堿75 mg/kg+紫杉醇10 mg/kg)，4組每天通過腹腔注射給藥，持續(xù)給藥28 d，觀察并記錄裸鼠狀態(tài)。

1.8 動(dòng)物模型與分組相對(duì)移植瘤體積、體質(zhì)量和抑瘤率 每周測量2次裸鼠腫瘤體積(游標(biāo)卡尺測定裸鼠移植瘤的長徑和短徑)，在28 d時(shí)采用頸椎脫臼法處死裸鼠，完整分離移植瘤，稱重，測量腫瘤體積，計(jì)算抑瘤率。腫瘤體積=(長徑×短徑2)/2；抑瘤率=(1-給藥組平均移植瘤體積/對(duì)照組平均移植瘤體積)/×100%=(1-給藥組平均移植瘤體重/對(duì)照組平均移植瘤體重)/×100%。

2 結(jié)果

2.1 HGC-27細(xì)胞存活率變化 MTT檢測結(jié)果顯示，藥物處理24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)；與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，氧化苦參堿組和紫杉醇組細(xì)胞存活率有不同程度的降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。藥物處理48 h時(shí)，與對(duì)照組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)，與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞的存活率明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組HGC-27細(xì)胞存活率比較

2.2 HGC-27細(xì)胞凋亡率變化 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氧化苦參堿組、紫杉醇組和氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖1,表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測HGC-27細(xì)胞凋亡情況

表2 4組HGC-27細(xì)胞凋亡率比較

2.3 HGC-27細(xì)胞中PCNA和Cleaved Caspase-3表達(dá)的變化 Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，氧化苦參堿組和氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與氧化苦參堿組和紫杉醇組相比，氧化苦參堿聯(lián)合紫杉醇組HGC-27細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖2,表3。

表3 4組HGC-27細(xì)胞中PCNA和Cleaved Caspase-3水平比較

圖2 Western blot檢測4組HGC-27細(xì)胞中PCNA和Cleaved Caspase-3的表達(dá)

2.4 裸鼠移植瘤體積和抑瘤率比較 與Mock組相比，Oxy組、PTX組和Oxy+PTX組移植瘤體積均明顯降低(P<0.05)；與Oxy組和PTX組相比，Oxy+PTX組腫瘤體積明顯降低(P<0.05)，抑瘤率明顯增加(P<0.05)。見表4。

表4 裸鼠移植瘤體積和抑瘤率比較

2.5 裸鼠移植瘤重量和抑瘤率比較 與Mock組相比，Oxy組、PTX組和Oxy+PTX組移植瘤腫瘤均明顯降低(P<0.05)；與Oxy組和PTX組相比，Oxy+PTX組腫瘤重量明顯降低(P<0.05)，抑瘤率明顯增加(P<0.05)。見表5。

表5 裸鼠移植瘤重量和抑瘤率比較

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，早期診斷率低。胃癌的預(yù)后與治療時(shí)間密切相關(guān)，早期內(nèi)鏡下可行根治性切除，5年生存率>90%[8]。但我國絕大多數(shù)患者診斷為晚期或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)這些患者來說，全身治療(以化療為主)仍是晚期胃癌患者的最佳選擇，但胃癌化療的發(fā)展已進(jìn)入瓶頸階段，生存期的提高較為有限[9]。PTX是治療胃癌的重要藥物，能有效延長晚期胃癌患者的生存時(shí)間，提高患者的生活質(zhì)量。然而，近年來的大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，某些類型的惡性腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胃癌，會(huì)對(duì)PTX產(chǎn)生主要或次要的抵抗作用[10-13]。此外，高劑量的PTX不僅能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也存在殺傷作用，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的毒副作用。因此，探討一種提高PTX抗癌作用的新方法具有重要意義。

以往大量研究顯示，藥物輔助治療在癌癥治療中取得較大進(jìn)展，已成為多數(shù)研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[14,15]。Li等[16]研究顯示，黃芩素聯(lián)合吉西他濱能夠有效抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且在胰腺癌CFPAC-1細(xì)胞移植小鼠模型中，黃芩素和吉西他濱聯(lián)合治療可顯著降低腫瘤重量和體積，抑制腫瘤生長。苗金鈺等[17]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素和雷公藤紅素聯(lián)合使用可有效抑制胃癌的發(fā)展。王康等[18]實(shí)驗(yàn)顯示，二氫楊梅素和依托泊苷聯(lián)合使用可明顯增強(qiáng)抑制絨毛膜癌JAR細(xì)胞生長的作用，并且聯(lián)合用藥能夠減少化療藥依托泊苷的用量。眾所周知，腫瘤的發(fā)生是由于細(xì)胞增殖和凋亡之間的不平衡。PCNA是一種在細(xì)胞周期的G1期和S期后期合成的核蛋白，用于監(jiān)測細(xì)胞生長狀態(tài)的變化[19]。PCNA表達(dá)的調(diào)控是細(xì)胞增殖早期變化的一個(gè)重要指標(biāo)，為Oxy和PTX抑制細(xì)胞增殖提供了可能的機(jī)制。本研究結(jié)果表明，Oxy和PTX通過抑制PCNA在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)來抑制細(xì)胞增殖。以前的研究表明，凋亡受Caspase家族調(diào)控，活化的Caspase-3能夠誘導(dǎo)染色體分裂和細(xì)胞凋亡[20]。在本研究中，觀察到Oxy和PTX均能夠促進(jìn)Cleaved Caspase-3的表達(dá)，而兩種藥物聯(lián)合使用后效果更顯著。提示Oxy和PTX聯(lián)合誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Cleaved Caspase-3表達(dá)有關(guān)。目前的研究結(jié)果表明，Oxy和PTX聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)使用兩種藥物更有效地抑制胃癌細(xì)胞的生長。此外，本研究通過裸鼠移植瘤體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該結(jié)論，Oxy和PTX單獨(dú)或聯(lián)合使用均能夠降低移植瘤的重量和體積，且聯(lián)合用藥效果更優(yōu)。

綜上所述，Oxy和PTX聯(lián)合給藥在抑制增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡方面比單一藥物更有效。初步證明Oxy與PTX具有協(xié)同抗癌作用。因此，為達(dá)到同樣的抑制作用，Oxy可以減少PTX的劑量，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)PTX的敏感性，減弱大劑量化療藥物對(duì)機(jī)體多系統(tǒng)的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為臨床應(yīng)用單味中藥Oxy和化療藥物PTX治療胃癌提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。