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    雙斑東方鲀海盤蟲病病原鑒定和鰓組織病理觀察

    2022-03-22 01:39:14吳建紹陸振楊求華朱志煌周宸葛輝
    關(guān)鍵詞:病魚蟲體病原

    吳建紹,陸振,楊求華,朱志煌,周宸,葛輝

    (1.福建省水產(chǎn)研究所,福建 廈門 361013;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所,浙江 溫州 325005)

    海盤蟲Haliotremasp.隸屬于扁形動(dòng)物門Platyhelminthes單殖亞綱Monogenea錨首蟲科Ancyrocephalidae海盤蟲屬Haliotrema,是海水魚類常見的寄生蟲[1],常寄生于石斑魚、真鯛、大黃魚、鱸、東方鲀等海水養(yǎng)殖魚類鰓上,嚴(yán)重感染后會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類發(fā)病,甚至大量死亡。根據(jù)Boeger等[2]和Kritsky等[3]分類系統(tǒng)描述的海盤蟲,種類已超過(guò)100多種,國(guó)內(nèi)已報(bào)道發(fā)現(xiàn)50多種[4]。海盤蟲具有一定的宿主特異性,如黑鯛海盤蟲H.kurodai寄生于黃鰭鯛Acanthopagruslatus、黑鯛A.schlegelii,約氏海盤蟲H.johnii寄生于紫紅笛鯛Lutjanusargentimaculatus、勒氏笛鯛L.russellii、金帶笛鯛L.vaigiensis,鲬海盤蟲H.platycephali寄生于鲬Platycephalusindicus等[1]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于海盤蟲研究主要集中在分類鑒定和宿主方面[5-10],而相關(guān)海盤蟲病病原研究報(bào)道較少,僅張劍英等[11]報(bào)道石斑魚海盤蟲H.epinepheli引發(fā)赤點(diǎn)石斑魚Epinephelusakaara和真鯛Pagrusmajor發(fā)生海盤蟲病。有關(guān)雙斑東方鲀海盤蟲病病原鑒定、流行病學(xué)調(diào)查和組織病理研究等目前尚未見詳細(xì)報(bào)道,因此,有必要對(duì)雙斑東方鲀海盤蟲病進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

    雙斑東方鲀Takifugubimaculatus是一種已在福建沿海規(guī)?;B(yǎng)殖的特色經(jīng)濟(jì)魚類,其肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美,深受消費(fèi)者喜歡[12]。隨著雙斑東方鲀養(yǎng)殖高密度化或管理措施不當(dāng),易導(dǎo)致海盤蟲病暴發(fā),如果生產(chǎn)上未采取防治措施,會(huì)造成幼魚和成魚大量死亡,給東方鲀養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為了對(duì)雙斑東方鲀海盤蟲病深入了解,本項(xiàng)目組于2016年6月—2019年6月,對(duì)福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀海盤蟲病流行情況進(jìn)行調(diào)查,利用蟲體形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)發(fā)生病原進(jìn)行鑒定,并觀察了病魚鰓組織病理變化情況,通過(guò)研究確認(rèn)了雙裂海盤蟲H.bilobatus為福建池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀海盤蟲病感染病原,這是雙裂海盤蟲引起雙斑東方鲀疾病在國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道,該研究成果可為海水魚類海盤蟲病病原鑒定和防控提供科學(xué)參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗(yàn)用患病雙斑東方鲀魚取自福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地養(yǎng)殖池塘。

    主要試劑:DNA試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司;PCR擴(kuò)增引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成;固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;乙醇購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司;海水細(xì)菌培養(yǎng)基2216E和弧菌培養(yǎng)基(TCBS)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查及臨床檢查 于2016年6月—2019年6月期間調(diào)查池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀海盤蟲病流行發(fā)生、發(fā)病魚大小、病魚感染、發(fā)病期間死亡及病魚活動(dòng)情況,了解發(fā)病時(shí)池塘水溫、鹽度等水質(zhì)理化情況。取臨床典型癥狀的病魚(瀕死)解剖,觀察病魚體表體征、鰓及內(nèi)臟器官,描述體表、鰓絲及臟器典型性表觀病理特征。

    每次發(fā)病期間,剪取30尾以上病魚的半鰓,置解剖鏡(Olympus-SZX12)下檢查,并采集蟲體和計(jì)數(shù),按文獻(xiàn)方法確認(rèn)病魚蟲體感染強(qiáng)度[13]:輕度感染(半鰓感染量≤10枚,用“+”表示);中度感染(10<半鰓感染量<50枚,用“++”表示);重度感染(半鰓感染量≥50枚,用“+++”表示)。

    1.2.2 細(xì)菌檢查 無(wú)菌操作條件下,從病魚的鰓、肝臟、脾臟和腎臟等器官組織分離細(xì)菌,劃線接種于2216E平板培養(yǎng)基和弧菌選擇性培養(yǎng)基(TCBS)上,置于恒溫箱(28 ℃)倒置培養(yǎng)24~48 h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

    1.2.3 病原蟲體形態(tài)學(xué)觀察與特征鑒定 剪取病魚半鰓片置于培養(yǎng)皿,經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇處理后,在解剖鏡下用解剖針隨機(jī)輕挑撥離30條微麻醉蟲體,用吸管吸取蟲體置于玻片,制成水浸片置于光學(xué)顯微鏡(Lw200-20T)下觀察并拍照,描述蟲體形態(tài)特征,并測(cè)量蟲體、交接器、中央大鉤、聯(lián)結(jié)片和邊緣小鉤等分類特征的大小,即平均值和范圍值。

    1.2.4 分子生物學(xué)分析

    1)蟲體DNA提取、模板制備及18S rDNA和28S rDNA序列擴(kuò)增。依形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,隨機(jī)選取用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇保存的蟲體(采集),清洗,TE 緩沖液(pH 8.0)浸泡過(guò)夜后,分別裝入1.5 mL Eppendorf 管中,用DNA 提取試劑盒(捷瑞GK4002-100)提取蟲體DNA,于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩R韵x體DNA為模板,采用核糖體基因的18S rDNA和28S rDNA序列擴(kuò)增。

    18S rDNA序列擴(kuò)增引物[14]:Worm-A,5′GCGAATGGCTCATTAAATCAG 3′;Worm-B,5′CTTGTTACGACTTTTACTTCC 3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL):DNA模板2 μL,PCRMix 25 μL,上、下游引物(Worm)各2 μL,ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃下預(yù)變性3 min;94 ℃下變性30 s,52 ℃下復(fù)性30 s,72 ℃下延伸120 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下溫育10 min,4 ℃下保存。

    28S rDNA序列擴(kuò)增引物[15]:C1-28S-F,5′ACCCGCTGAATTTAAGCAT 3′;D2-28S-R,5′TGGTCCGTGTTTCAAGAC 3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μL):DNA模板2 μL,PCRMix 25 μL,上、下游引物(C1-28S)各2 μL,ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃下預(yù)變性5 min;94 ℃下變性30 s,55 ℃下復(fù)性30 s,72 ℃下延伸90 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下溫育7 min,4 ℃下保存。18S rDNA和28S rDNA序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各自用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

    2)擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。18S rDNA和28S rDNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至Invitrogen 公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的基因序列經(jīng)BLAST程序與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)序列進(jìn)行比對(duì)分析?;?8S rDNA和28S rDNA基因序列從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)選取相似、相近的單殖吸蟲序列(含本研究中測(cè)得序列),利用ClustalX 1.83軟件對(duì)選取序列進(jìn)行多重匹配比對(duì)并聚類分析,用MEGA 7.0軟件鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.5 鰓組織病理觀察 取病魚鰓于波恩氏液中固定,然后將固定后的鰓用梯度乙醇脫水,二甲苯溶液透明,石蠟包埋,經(jīng)連續(xù)切片、脫蠟,蘇木精-伊紅(H.E)染色,干燥后用中性樹膠封片,最后將封片置于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 流行病學(xué)調(diào)查及病魚臨床癥狀

    2016年6月—2019年6月調(diào)查期間,福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地池塘養(yǎng)殖的雙斑東方鲀每年均會(huì)發(fā)生海盤蟲病,發(fā)病水溫為23~31 ℃,鹽度為1.019~1.022,發(fā)病時(shí)間多在春末夏初(5—6月)和秋季(9—10月),幼魚和成魚都會(huì)發(fā)病,該病有時(shí)與車輪蟲病并發(fā)(表1)。

    發(fā)病期病魚蟲體感染情況:幼魚階段(體長(zhǎng)7.6~8.0 cm),病魚平均半鰓感染量為26枚/尾,感染強(qiáng)度屬于中度感染,發(fā)病情況嚴(yán)重;而成魚階段(19.3~21.5 cm),病魚嚴(yán)重發(fā)病時(shí)平均半鰓感染量分別為164、176枚/尾,感染強(qiáng)度屬于重度感染;嚴(yán)重發(fā)病時(shí),幼魚和成魚蟲體感染率均為100%(表1)。該病發(fā)病初期,發(fā)病魚少量死亡;發(fā)病高峰期,出現(xiàn)大量死亡;如果未采取防控措施,該病累計(jì)死亡率可達(dá)70%以上。

    表1 2016年6月—2019年6月池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀海盤蟲病的發(fā)生情況Tab.1 Occurrence of haliotremasis in twin-spot puffer Takifugu bimaculatus cultured in ponds from June 2016 to June 2019

    發(fā)病時(shí)病魚活動(dòng)情況:病魚緩游于水面,動(dòng)作異常、遲緩,食欲減退或不攝食。外觀病魚體色蒼白,體形消瘦,尾鰭和臀鰭缺損(圖1A);解剖內(nèi)臟發(fā)現(xiàn)其肝臟、脾臟充血嚴(yán)重(圖1B);取鰓鏡檢發(fā)現(xiàn),鰓絲上有大量單殖吸蟲蟲體,蟲體扁平而長(zhǎng),用后吸器吸附固著鰓,蟲體不斷地伸縮擺動(dòng),移動(dòng)時(shí)做尺蠖狀動(dòng)作(圖1C);病魚鰓片黏液多,部分鰓有蟲卵,蟲卵一端有極絲(圖1D)。除了2017年6月發(fā)生海盤蟲病的病魚有拌生車輪蟲外,其余幾次發(fā)病時(shí)間顯微鏡檢病魚體表皮膚、鰭條和內(nèi)臟器官等組織,未發(fā)現(xiàn)有其他病原體寄生。

    2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

    取所采病魚的鰓、肝臟、脾臟和腎臟等器官組織病料,接種于2216E平板和TCBS培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng),28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h后,所接種的培養(yǎng)基均未觀察到優(yōu)勢(shì)致病菌。

    2.3 病原蟲體初步觀察

    2016年6月—2019年6月發(fā)病期間采集的病原蟲體經(jīng)顯微鏡觀察,蟲體大小約1 mm左右,內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰、典型(圖2A):頭器3對(duì),前端有眼點(diǎn)2對(duì),后一對(duì)眼點(diǎn)明顯大于前一對(duì),咽呈橢圓形;交接器簡(jiǎn)單,基部連接于杯形基座;后吸器與前體部區(qū)分明顯,具2對(duì)中央大鉤、2根聯(lián)結(jié)片和7對(duì)邊緣小鉤;卵黃腺沿腸支分布于身體兩側(cè),腸支簡(jiǎn)單,明顯地分開,但在身體后端匯合。病原蟲體符合錨首蟲科海盤蟲屬特征[1],確定該寄生蟲為海盤蟲。結(jié)合病魚特征、感染蟲體形態(tài)和鰓蟲數(shù)量情況,確認(rèn)雙斑東方鲀感染海盤蟲病[11]。

    2.4 海盤蟲病病原形態(tài)學(xué)鑒定

    上述發(fā)病期間,病原經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查確認(rèn)為同一種海盤蟲蟲體,該蟲體較大,體長(zhǎng)1.058 mm,中部寬0.225 mm,體長(zhǎng)與體寬比約為4.7,咽直徑0.075 mm(圖2A);后吸器幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)由2對(duì)中央大鉤、2個(gè)聯(lián)結(jié)片和7對(duì)邊緣小鉤組成(圖2B);腹中央大鉤粗壯,基部膨大,內(nèi)外突分化,腹中央大鉤長(zhǎng)0.048 mm,鉤柄寬0.035 mm,鉤尖長(zhǎng)0.018 mm(圖2B(g));腹聯(lián)結(jié)片棒狀,近中部具兩突起,兩端稍細(xì),長(zhǎng)0.068 mm,中間寬0.016 mm(0.014~0.017 mm)(圖2B(h));背中央大鉤粗壯,基部膨大,外側(cè)有裂刻,內(nèi)外突分化明顯,背中央大鉤長(zhǎng)0.046 mm,鉤柄寬0.036 mm,鉤尖長(zhǎng)0.017 mm(圖2B(i));背聯(lián)結(jié)片呈“弓”形,兩端膨大分叉,長(zhǎng)0.060 mm,中間寬0.010 mm(0.009~0.011 mm)(圖2B(j));7對(duì)邊緣小鉤,為形態(tài)相似的胚鉤,鉤尖凸起,長(zhǎng)0.011 mm(圖2B(k));交接器為細(xì)長(zhǎng)彎管,長(zhǎng)0.085 mm,基部稍膨大,連接于杯形基座,有圓形支持片(圖2C)(表2)。

    A—病魚體型消瘦,尾鰭、臀鰭缺損;B—肝臟、脾臟充血;C—鰓上有大量的海盤蟲;D—鰓絲分布蟲卵及黏液(ⅰ—黏液,ⅱ—蟲卵,?!x體)。A—sick fish with emaciated body,defect of caudal and anal fins;B—severely hemorrhagic liver and spleen;C—a large number of Haliotrema sp.on the gills;D—worm eggs and mucus on gill filaments(ⅰ—mucus,ⅱ—worm eggs,ⅲ—worm body).圖1 患海盤蟲病的雙斑東方鲀Fig.1 Twin-spot puffer Takifugu bimaculatus with haliotremasis

    通過(guò)與已報(bào)道的海盤蟲測(cè)量值進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)(表2),本文描述蟲種除了蟲體和咽徑稍大外,與文獻(xiàn)[16]描述的雙裂海盤蟲最相似,包括幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)(背、腹中央大鉤、聯(lián)接片和邊緣小鉤)形態(tài)和量度相似,背中央大鉤外側(cè)有裂刻,交接器為簡(jiǎn)單細(xì)長(zhǎng)彎管,連接杯形基座,有一圓形支持片。

    表2 寄生于不同宿主的海盤蟲形態(tài)特征比較Tab.2 Morphological comparison of parasite Haliotrema sp.from different hosts mm

    A—蟲體整體圖;B—后吸器幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu);C—交接器。a—頭器;b—眼點(diǎn);c—咽;d—交接器;e—卵黃腺;f—后吸器;g—腹中央大鉤;h—腹聯(lián)結(jié)片;i—背中央大鉤;j—背聯(lián)結(jié)片;k—邊緣小鉤。A—dorsal view of a whole worm;B—chitin structure of haptor;C—copulatory complex.a—head organ;b—eyespot;c—pharynx;d—copulatory complex;e—vitelline gland;f—haptor;g—ventral anchor;h—ventral bar;i—dorsal anchor;j—dorsal bar;k—hooklet.圖2 雙裂海盤蟲的顯微觀察Fig.2 Microscopic observation of parasite Haliotrema bilobatus

    故認(rèn)為二者是同一蟲種,屬于雙裂海盤蟲H.bilobatus,而雙斑東方鲀?yōu)槠渌拗餍掠涗洝?/p>

    2.5 蟲體18S rDNA序列分析

    測(cè)得蟲體18S rDNA序列長(zhǎng)度為1 282 bp,上傳序列至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)ZL-2019,登錄號(hào)MN309840.1),通過(guò)BLAST比對(duì),結(jié)果顯示,編號(hào)ZL-2019的蟲體18S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中櫛齒刺尾鯛海盤蟲H.ctenochaeti(登錄號(hào)EU836220.1)、絲蝴蝶魚海盤蟲H.aurigae(登錄號(hào)AY820610.1)和大棘海盤蟲H.macracantha(登錄號(hào)EU836229.1)等基因序列相似,一致性達(dá)97.68%~98.30%,這表明該蟲體為海盤蟲蟲種。

    選取18S rDNA序列相似度高的海盤蟲蟲種繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,雙裂海盤蟲單為獨(dú)立分支,然后與絲蝴蝶魚海盤蟲、大棘海盤蟲等聚為一支,這表明與他們親緣關(guān)系較近(圖3)。

    圖3 基于18S rDNA序列構(gòu)建的海盤蟲系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Haliotrema sp.based on the gene sequence of 18S rDNA

    2.6 蟲體28S rDNA序列分析

    測(cè)得蟲體28S rDNA(C1~D2區(qū))核酸片段長(zhǎng)度為886 bp,上傳序列至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)ZL-2019,登錄號(hào)MN310381.1),通過(guò)BLAST比對(duì),結(jié)果顯示,編號(hào)ZL-2019的蟲體28S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中鐮莖海盤蟲H.sicklocirrus(登錄號(hào)KJ571015.1)基因序列最相似,但一致性僅為90.28%,而與東沙海盤蟲H.dongshaense(登錄號(hào)KJ571014.1)、絲蝴蝶魚海盤蟲H.aurigae(登錄號(hào)EU836198.1)一致性分別為88.49%和88.26%,為基因數(shù)據(jù)庫(kù)未登記海盤蟲屬蟲種。

    選取相似或相近的12種單殖吸蟲28S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4),結(jié)果顯示,蟲體ZL-2019首先單為獨(dú)立分支,然后與鐮莖海盤蟲、東沙海盤蟲、絲蝴蝶魚海盤蟲等海盤蟲聚為一大支,這表明蟲體ZL-2019與他們的親緣關(guān)系相對(duì)較近;而大鉤海盤蟲H.magnihamus、大彎管海盤蟲H.grossecurvitubus、駝背鱸海盤蟲H.cromileptis等海盤蟲聚為另一大支,這表明蟲體ZL-2019與他們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    圖4 基于28S rDNA序列(C1~D2區(qū))構(gòu)建的海盤蟲及其他外類群系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Haliotrema sp.and out groups based on the gene sequence of 28S rDNA (C1-D2 dormain)

    2.7 鰓組織病理學(xué)觀察

    雙斑東方鲀發(fā)生海盤蟲病,病變損害最嚴(yán)重的器官是鰓。通過(guò)病魚鰓組織病理學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)海盤蟲蟲體依托中央大鉤或邊緣小鉤寄生于鰓絲基部(圖5A),或鰓絲中部(圖5B),或次級(jí)鰓絲組織軟骨上(圖5C),并機(jī)械擠壓導(dǎo)致次級(jí)鰓絲變形,鰓小片傾斜排列且扭曲,破壞了鰓絲組織完整性;寄生周圍區(qū)域的初級(jí)鰓絲上皮組織出現(xiàn)增生或腫脹,甚至造成有的上皮細(xì)胞脫落,引起鰓絲局部損傷(圖5A、B)。感染嚴(yán)重時(shí),蟲體寄生區(qū)域鰓小片上皮細(xì)胞壞死,鰓小片不完整或崩解,鰓小片毛細(xì)血管斷裂、出血,大量黏液浸潤(rùn)鰓絲,鰓絲間彌散解離細(xì)胞和黏液(圖5C~E);而與蟲體寄生處相對(duì)側(cè)的鰓上皮組織增生、增厚嚴(yán)重(圖5E)。

    A—感染蟲體寄生于鰓絲基部;B—感染蟲體寄生鰓絲中部;C—感染蟲體寄生于鰓絲軟骨;D、E—蟲體嚴(yán)重感染時(shí),鰓病變嚴(yán)重;F—鰓感染海盤蟲和車輪蟲。a—蟲體;b—中央大鉤;c—鰓小片;d—上皮細(xì)胞;e—鰓絲軟骨;f—黏液;g—紅細(xì)胞;h—毛細(xì)血管;i—車輪蟲。A—parasites colonizing on the base of gill filaments;B—parasites colonizing on the middle of gill filaments;C—parasites colonizing on the gill filament cartilage;D and E—the pathological changes in the gill after severe infection with Haliotrema bilobatus;F—gills infected with Haliotrema and Trichodina.a—worm;b—anchor;c—gill lamella;d—epithelial cell;e—gill filament cartilage;f—mucus;g—red blood cell;h—capillary;i—Trichodina.圖5 病魚鰓組織病理切片圖Fig.5 Histological sections (H.E)of gills of the diseased fish

    3 討論

    3.1 雙斑東方鲀海盤蟲病病原鑒定

    海盤蟲種類繁多,形態(tài)相近,目前種類鑒定和分類主要依據(jù)蟲體后吸器和交接器的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)[4-10]。本研究中,根據(jù)現(xiàn)有蟲體形態(tài)學(xué)證據(jù)和幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)特征將雙斑東方鲀海盤蟲病病原鑒定為雙裂海盤蟲。雙裂海盤蟲首次被描述記錄于1953年[18],于1970年正式確認(rèn)為H.bilobatus,其宿主記錄為斑點(diǎn)雞籠鯧Drepanepunctata[19],國(guó)內(nèi)學(xué)者于1993年發(fā)現(xiàn)該蟲體,并命名為雙裂海盤蟲[1],袁少穎[16]于2006年發(fā)現(xiàn)星點(diǎn)東方鲀T.niphoble為其宿主記錄。本研究中則首次確認(rèn)雙裂海盤蟲能引起養(yǎng)殖的雙斑東方鲀發(fā)病,且雙斑東方鲀?yōu)槠湫碌乃拗饔涗?。生產(chǎn)過(guò)程中,作者還發(fā)現(xiàn)同一池塘養(yǎng)殖的菊黃東方鲀T.flavidus也會(huì)感染雙裂海盤蟲病,這表明該蟲對(duì)東方鲀屬魚類具有高度的宿主特異性。

    因單殖吸蟲種間幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)微、差異小,常因試驗(yàn)方法、觀察角度(顯微)及測(cè)量誤差等因素造成研究者描述形態(tài)有差異[20],且宿主、地理分布和生活水溫等變化也可造成同一蟲種形態(tài)結(jié)構(gòu)變異[21],故依賴形態(tài)學(xué)進(jìn)行種類鑒別比較煩瑣、困難,單純依靠幾丁質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)特征鑒定闡明蟲種間親緣關(guān)系也有一定局限性[22]。近年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于單殖吸蟲分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[23-26],包括利用18S rDNA、28S rDNA和rDNA-ITS等靶基因序列分析,該技術(shù)為海盤蟲屬種類鑒別、種間親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育等研究提供有效補(bǔ)充途徑[27]。為了對(duì)雙斑東方鲀海盤蟲病病原的了解更加全面,本研究中在形態(tài)學(xué)鑒別基礎(chǔ)上,選用單殖吸蟲界常用的核糖體18S rDNA和28S rDNA作為分子標(biāo)記,對(duì)病原進(jìn)行分子生物學(xué)測(cè)定,結(jié)果表明,雙裂海盤蟲為NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)未登記海盤蟲屬蟲種,其18S rDNA序列與櫛齒刺尾鯛海盤蟲、絲蝴蝶魚海盤蟲等蟲體相似,一致性達(dá)97.68%~98.30%;而28S rDNA序列與鐮莖海盤蟲最相似,但有9.72%的差異,與鐮莖海盤蟲、東沙海盤蟲和絲蝴蝶魚海盤蟲等親緣關(guān)系較近。

    3.2 雙斑東方鲀海盤蟲病的發(fā)生

    海盤蟲病是魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)上主要致死性病害之一,主要危害是大量蟲體寄生于鰓上,造成養(yǎng)殖魚類鰓黏液增多,呼吸困難,食欲減退而死亡,或?qū)е缕渌≡?包括車輪蟲(圖5F)、刺激隱核蟲、瓣體蟲等)繼發(fā)感染從而造成死亡。鰓是魚類最重要的呼吸器官,是魚體與外界氣體交換的場(chǎng)所,具有參與滲透調(diào)節(jié)和氯化物排泄等功能[28]。從患病魚鰓組織病理學(xué)分析,雙裂海盤蟲大量感染導(dǎo)致雙斑東方鲀病魚鰓受損嚴(yán)重,其損傷結(jié)果為蟲體用后吸器固著于鰓并做尺蠖式移動(dòng),造成鰓絲機(jī)械損傷,致使上皮組織增生,大量黏液浸潤(rùn),甚至引起鰓病變或出血,阻礙鰓組織與外界環(huán)境氣體交換,影響了鰓滲透調(diào)節(jié)、排泄等功能;重度感染,引起鰓組織壞死、崩解,導(dǎo)致病魚呼吸困難,造成魚體缺氧死亡。該研究結(jié)果與李立偉等[13]報(bào)道的花鱸逆轉(zhuǎn)指環(huán)蟲病病理學(xué)、李海燕等[29]報(bào)道的叉尾斗魚關(guān)睪蟲病鰓組織病理學(xué)、蘇翠蓮[30]報(bào)道的黃鰭鯛鱗盤蟲病鰓組織病理學(xué)中多鉤類單殖吸蟲病鰓病理的研究結(jié)果基本一致。

    不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的雙斑東方鲀均可發(fā)生海盤蟲病,但海盤蟲感染強(qiáng)度不同,幼魚階段中度感染即可嚴(yán)重發(fā)病,成魚階段則需重度感染才能嚴(yán)重發(fā)病,這可能與不同生長(zhǎng)發(fā)育階段宿主魚耐受程度及鰓面積大小有關(guān)。有研究報(bào)道[31-32]認(rèn)為,單殖吸蟲平均感染強(qiáng)度與宿主魚體長(zhǎng)呈顯著正相關(guān),而雙裂海盤蟲感染強(qiáng)度是否與雙斑東方鲀體長(zhǎng)呈正相關(guān)還有待進(jìn)一步考證。郝翠蘭等[33]認(rèn)為,單殖吸蟲對(duì)宿主魚不同鰓片具有明顯選擇性,而本研究中發(fā)現(xiàn)雙裂海盤蟲對(duì)雙斑東方鲀左、右鰓腔的分布無(wú)選擇性,但對(duì)左、右鰓腔的居中鰓片有寄生偏好。作者在2016—2019年常規(guī)調(diào)查期間,福建漳浦東坂、云霄前江等東方鲀池塘養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)在春末夏初和秋季也時(shí)有發(fā)生由雙裂海盤蟲感染引起雙斑東方鲀海盤蟲病,這表明雙裂海盤蟲感染是池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀發(fā)生海盤蟲病的主要病因。劉君[17]研究發(fā)現(xiàn),黑鯛海盤蟲可大量寄生于海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的雙斑東方鲀鰓上,其交接器呈“S”狀,背聯(lián)結(jié)片呈倒“V”形,腹聯(lián)結(jié)片呈“一”字形,與雙裂海盤蟲差異明顯,聯(lián)結(jié)片和中央大鉤度量均比雙裂海盤蟲小(表2)。但本研究中在池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)有黑鯛海盤蟲感染,猜測(cè)發(fā)生海盤蟲病病原種類可能與東方鲀養(yǎng)殖環(huán)境相關(guān)。目前生產(chǎn)上可用漁用敵百蟲或甲苯咪唑等抗單殖吸蟲藥物(敏感魚類慎用)對(duì)海水養(yǎng)殖魚類海盤蟲病進(jìn)行有效防治,同時(shí),還需要伴飼投喂抗生素以防止病魚發(fā)生繼發(fā)性細(xì)菌感染。

    國(guó)內(nèi)外對(duì)于海水養(yǎng)殖魚類海盤蟲病的流行病學(xué)、病原鑒定和組織病理學(xué)的研究較少,所以本研究中開展具有一定的實(shí)踐意義,該研究可為海水養(yǎng)殖魚類海盤蟲病的病原鑒定和防控提供技術(shù)參考依據(jù)。

    4 結(jié)論

    1)本研究中確認(rèn)了雙裂海盤蟲為福建池塘養(yǎng)殖雙斑東方鲀海盤蟲病的感染病原,這是雙裂海盤蟲引起雙斑東方鲀海盤蟲病在國(guó)內(nèi)的首次報(bào)道。該病在春末夏初和秋季易發(fā)。

    2)從鰓組織病理學(xué)分析,雙裂海盤蟲大量感染導(dǎo)致發(fā)生海盤蟲病的雙斑東方鲀病魚鰓受損嚴(yán)重。重度感染會(huì)引起鰓組織壞死、崩解,導(dǎo)致病魚呼吸困難而死亡。

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