甲醛固定石蠟包埋切片經(jīng)特殊染色后熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測的再利用

魏 雪，葉勝兵，章如松，夏秋媛，饒 秋，馬恒輝，吳 楠

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的特異性炎癥，在甲醛固定石蠟包埋組織切片中查見MTB是確診結(jié)核的“金標準”。目前，結(jié)核病診斷的主要輔助檢測方法是特殊染色和qRT-PCR檢測。在臨床病理診斷中，部分結(jié)核病患者由于獲取標本困難，穿刺標本微小，病理組織多被用于HE染色、特殊染色，所剩組織太少無法進行相關(guān)分子檢測。在全載玻片成像掃描技術(shù)應(yīng)用下，將病理切片實現(xiàn)全數(shù)字化，形成數(shù)字切片，保存現(xiàn)有病理圖像的同時，再利用特殊染色過切片進行qRT-PCR檢測的可行性分析在國內(nèi)鮮有報道。本實驗通過對結(jié)核病患者組織切片經(jīng)特殊染色后應(yīng)用qRT-PCR檢測，比較特殊染色處理前、后qRT-PCR檢測結(jié)果的符合率，以期探討標本回收利用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年1月～2020年1月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床送檢診斷為結(jié)核標本30例，其中穿刺活檢標本10例，手術(shù)切除標本20例；肺組織23例，肺外組織7例，病變部位主要為肺、肝、腎臟等；男性23例，女性7例；年齡20～58歲，平均(39.0±19.0)歲。所有組織標本納入標準為腫瘤細胞含量≥20%[1]，均行特殊染色及qRT-PCR檢測。

1.2 組織處理及方法標本均采用10%中性福爾馬林進行固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片7張，分別用于HE染色、特殊染色和qRT-PCR檢測。大組織標本每張切片至少切取2張蠟片，小組織標本每張切片上至少切取3張蠟片。抽取其中3張切片作為實驗組先進行特殊染色再行qRT-PCR檢測，剩余3張切片納入對照組單獨進行qRT-PCR檢測。

1.3 特殊染色采用PAS染色、PASM染色和抗酸染色，具體實驗方法參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學分冊》中的染色方法進行[2]。

1.4 qRT-PCR檢測實驗組切片浸入二甲苯中直至蓋玻片自然脫落，無水乙醇漂洗，風干后刮片收集組織；對照組切片直接浸入二甲苯脫蠟，無水乙醇漂洗，風干后刮片收集組織。操作嚴格按Qlamp DNA FFPE Tissue Kit操作說明書進行，收集樣本DNA，后續(xù)步驟按MTB檢測試劑盒說明書進行。

1.5 結(jié)果判定(1)PAS染色真菌呈紫色，細胞核呈藍色。PASM染色真菌呈黑色，細胞核呈藍色?？顾崛旧玀TB呈亮紅色，表現(xiàn)為細桿狀/短樣狀、菌體清晰、不折光，或者為稍彎的念珠樣細桿狀物，常可見黑色的著絲點，位于MTB的一端或其他部位，與組織切片位于同一水平面上[3]。非MTB及其他成分呈淡藍色或亮紅色，有折光性，背景染色呈淡藍色。(2)qRT-PCR檢測按MTB核酸檢測試劑盒產(chǎn)品說明書進行，檢測樣本Ct值≥27和無數(shù)值時，判斷為陰性；檢測樣本Ct值<27時，判斷為陽性。

1.6 統(tǒng)計學分析應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用Kappa一致性檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

30例結(jié)核標本組織學形態(tài)表現(xiàn)為上皮樣肉芽腫性病變(圖1)?？顾崛旧玀TB呈亮紅色細桿狀、菌體清晰、不折光，背景染色呈淡藍色(圖2)。qRT-PCR檢測實驗組MTB陽性11例(36.7%)，陰性19例(63.3%)。對照組MTB陽性11例，另外19例同樣檢測陰性。實驗組和對照組檢測結(jié)果符合率一致，Kappa系數(shù)為1.000(P<0.001，表1，圖3)。

圖1 肉芽腫性炎伴壞死 圖2 MTB呈亮紅色細絲狀，抗酸染色

圖3 A.實驗組擴增曲線Ct值小于27.0，檢測結(jié)果為陽性；B.對照組擴增曲線Ct值小于27.0，檢測結(jié)果為陽性；紅色為陽性對照，綠色為陰性對照，藍色為檢測標本

表1 qRT-PCR檢測MTB

3 討論

常用的結(jié)核病原學主要檢測項目為特殊染色和qRT-PCR檢測。PAS、PASM染色陽性結(jié)果顯示莢膜結(jié)構(gòu)，提示是否存在新型隱球菌、球孢子菌、曲菌病及皮膚真菌感染等?？顾崛旧z測MTB，可有效結(jié)合組織形態(tài)學進行定位觀察，具有操作簡單、直觀準確、特異性高的優(yōu)點，但其靈敏度略低?？顾崛旧栃越Y(jié)果既可能是MTB，也可能是非MTB或者麻風桿菌等，故需要應(yīng)用其它檢測手段。qRT-PCR檢測直接測定MTB的DNA，WHO推薦其為結(jié)核診斷的最佳檢測方法，選擇相對保守的病原體核酸片段進行PCR擴增與熒光信號收集，具有靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好的優(yōu)點，檢出率高于抗酸染色，具有較高的診斷價值[4-5]。無論是哪一類檢測方法，均不可避免出現(xiàn)假陰性，由于存在石蠟雜質(zhì)，抑制試劑反應(yīng)，故在檢測過程中應(yīng)嚴格按照試劑盒說明書要求，盡量減少誤差，避免交叉污染?？傊?，在常規(guī)工作中客觀看待兩種檢測方法各自的局限性，讓兩者恰如其分地輔助結(jié)核病的診斷，并結(jié)合患者的病史、臨床癥狀及影像學資料，有效地提高結(jié)核病病理診斷的準確性。

MTB可通過呼吸道、消化道或皮膚損傷侵入易感機體，引起多組織器官的結(jié)核病，其中以肺部最為常見。本組中肺結(jié)核占大部分，尤其是肺穿刺組織標本，其穿刺標本較微小，前期的常規(guī)檢測使蠟塊上的組織已所剩無幾，難以再行切片；或者部分會診患者帶來的白片數(shù)量有限，而無法在短時間內(nèi)重新獲得切片，都使得qRT-PCR檢測無法進行，無法明確患者的病理診斷結(jié)果，延誤診治。本組著重探討標本回收利用的新方法，有效利用僅存的切片進行后續(xù)輔助檢查。將病理切片圖像信息通過全玻片成像掃描技術(shù)形成數(shù)字切片，保存現(xiàn)有病理圖像的同時，再利用特殊染色過的切片進行分子檢測，滿足病理診斷需求。

特殊染色是將組織細胞中的待檢測物質(zhì)直接與染料結(jié)合而被染上顏色，從而顯示與確定組織或細胞中的正常結(jié)構(gòu)或病理過程中出現(xiàn)的異常物質(zhì)、病變及病原體等。qRT-PCR檢測是針對MTB特異性設(shè)計相應(yīng)的引物和探針，應(yīng)用PCR法體外擴增，通過熒光信號的變化測定DNA，從而特異性診斷MTB。特殊染色及qRT-PCR檢測無論是從檢測對象、檢測步驟、所用試劑等均不相同，不會互相干預(yù)影響組織切片的檢測結(jié)果，理論上經(jīng)過特殊染色過的切片再進行qRT-PCR檢測是可行的。此次實驗也證實了這一理論，特殊染色前、后qRT-PCR檢測結(jié)果具有高度的一致性，利用特殊染色后的切片可以滿足分子病理檢測的需求。

隨著腫瘤研究角度和研究方法的不斷更新，腫瘤靶點的個體化分子檢測越來越受到臨床重視，組織標本的珍貴性顯而易見。實驗已經(jīng)證明，組織切片經(jīng)特殊染色后能夠進行qRT-PCR檢測，不僅節(jié)省了標本的使用量，更減少了患者二次取材的可能性，為臨床實驗項目更全面的開展提供一定幫助，是值得推廣的技術(shù)新方法。