CLDN9與胃癌糖酵解水平的相關(guān)性及臨床意義

韓延敏，李云榮，周而樂，宋 健，李 紅，曹 璋，吳淑華

胃癌是常見的危害人類健康的惡性腫瘤，近年胃癌的手術(shù)治療、化療及靶向治療等均取得較大進(jìn)展，但是胃癌患者的術(shù)后5年生存率仍不理想[1-2]。研究表明，緊密連接蛋白(Claudin)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[3]。CLDN9(Claudin-9)作為緊密連接的重要組成部分，其表達(dá)異常影響緊密連接的功能。CLDN9在多種腫瘤如肺癌、肝癌中表達(dá)異常，可作為評估腫瘤預(yù)后的指標(biāo)之一[4-5]。新近研究表明，CLDN9與子宮內(nèi)膜癌、食管腺癌的糖酵解水平相關(guān)[6-7]。目前，有關(guān)CLDN9與胃癌糖酵解水平的研究尚未見報道。本文通過檢測CLDN9與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(GLUT-1)及糖酵解關(guān)鍵限速酶PKM2、LDHA在胃癌中的表達(dá)水平，分析CLDN9、GLUT-1、PKM2、LDHA與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，著重探討CLDN9和胃癌糖酵解水平的相關(guān)性，為胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制及預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床資料 從TCGA基因庫中篩選343例胃癌和30例正常胃黏膜組織中mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料。收集2014年1月～2016年3月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的胃腺癌標(biāo)本91例及相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織，根據(jù)WHO(2019)消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放、化療及生物學(xué)治療。其中，男性58例，女性33例，年齡44～83歲，中位年齡64歲；腫瘤直徑1.2～11 cm，平均5.0 cm；分化程度：高分化17例，中分化34例，低分化40例；浸潤深度：黏膜層或黏膜下層合計19例，肌層9例，漿膜下層及漿膜層63例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者61例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例。隨訪截至2021年3月或患者死亡。

1.1.2試劑 兔抗人CLDN9多克隆抗體購自Proteintech公司。兔抗人LDHA、PKM2多克隆抗體購自Abcam公司。兔抗人GLUT-1多克隆抗體和免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析 登錄TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)，獲取343例胃腺癌和30例正常胃黏膜組織中mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，并下載患者臨床數(shù)據(jù)。使用R-studio軟件中的“edgeR”和“l(fā)imma”對TCGA數(shù)據(jù)庫來源的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，對CLDN9在胃腺癌及正常胃黏膜上皮組織中的表達(dá)進(jìn)行比較。將從TCGA數(shù)據(jù)庫下載的同一患者ID的mRNA基因數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行合并，以CLDN9基因表達(dá)的中位數(shù)為界，將胃癌患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，使用R-studio軟件中的“survival”和“survminer”制作Kaplan-Meier生存分析曲線，觀察目的基因高、低表達(dá)差異對患者生存期的影響。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化EnVision法染色，常規(guī)石蠟組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，EDTA修復(fù)抗原，3% H2O2孵育去除內(nèi)源性過氧化物酶，加入山羊血清封閉，滴加一抗CLDN9(1 ∶100)、PKM2(1 ∶100)、LDHA(1 ∶150)、GLUT-1，置于4 ℃過夜孵育。PBS洗滌2次后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，洗滌后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，分化，脫水透明，中性樹膠封固。

1.3 結(jié)果判定CLDN9、LDHA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；GLUT-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；PKM2陽性為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中出現(xiàn)彌漫棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果判定采用半定量積分法，根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評分。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項評分結(jié)果相乘作為最終結(jié)果：≥4分為陽性，<4分為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件、GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用率表示，資料分組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearson關(guān)聯(lián)性分析，生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，采用Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析CLDN9 mRNA在胃癌中的表達(dá)及預(yù)后從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取的25例配對胃腺癌組織中有18例CLDN9 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常胃黏膜上皮組織(圖1)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001 8)。根據(jù)CLDN9 mRNA表達(dá)的中位數(shù)(5.315)將343例胃癌患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，Kaplan-Meier生存分析顯示，CLDN9低表達(dá)組中位生存時間為1 294天，預(yù)后明顯優(yōu)于高表達(dá)組(649天，P=0.048，圖2)。

圖1 胃癌及配對正常胃黏膜組織中CLDN9 mRNA的表達(dá)量

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中CLDN9 mRNA表達(dá)量對胃癌患者總生存期的影響

2.2 胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，CLDN9主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖3)，GLUT-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜(圖4)，PKM2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖5)，LDHA主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(圖6)，四者在癌旁正常胃黏膜組織的陽性率分別為8.2%(7/85)、1.1%(1/85)、16.4%(14/85)、14.1%(12/85)，在胃癌組織中的陽性率分別為65.9%(60/91)、61.5%(56/91)、86.8%(79/91)、78.0%(71/91)，均高于癌旁正常胃黏膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，圖7)。

圖3 A.正常胃黏膜組織中CLDN9呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中CLDN9呈陽性，EnVision法 圖4 A.正常胃黏膜組織中GLUT-1呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中GLUT-1呈陽性，EnVision法 圖5 A.正常胃黏膜組織中PKM2呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中PKM2呈陽性，EnVision法 圖6 A.正常胃黏膜組織中LDHA呈陰性，EnVision法；B.胃腺癌組織中LDHA呈陽性，EnVision法

圖7 胃腺癌及正常胃黏膜組織中CLDN9、GLUT-1、PKM2與LDHA的表達(dá)

2.3 胃癌中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃腺癌組織中CLDN9、GLUT-1表達(dá)與患者中位年齡、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PKM2表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；LDHA表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征均無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 胃腺癌中CLDN9、GLUT-1、PKM2和LDHA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 胃癌中CLDN9與GLUT-1、PKM2、LDHA的相關(guān)性分析根據(jù)免疫組化染色結(jié)果將91例胃腺癌分為CLDN9陽性組和陰性組，并分析其與GLUT-1、PKM2、LDHA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CLDN9陽性組中GLUT-1、PKM2、LDHA的陽性率分別為70.0%、93.3%、85.0%，均高于CLDN9陰性組(45.2%、74.2%、64.5%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示，胃腺癌組織中CLDN9表達(dá)與GLUT-1、PKM2、LDHA表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.242，r=0.268，r=0.234)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 胃腺癌中CLDN9與GLUT-1、PKM2、LDHA蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.5 預(yù)后91例胃癌患者中位生存時間為54個月，平均5年生存率為39.6%。Kaplan-Meier生存分析顯示，胃腺癌患者預(yù)后與CLDN9、PKM2、LDHA、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，CLDN9陽性胃癌患者比CLDN9陰性胃癌患者預(yù)后差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖8)。Cox多因素回歸模型分析顯示，CLDN9、PKM2、腫瘤直徑、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯均是胃腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05，表3)。

圖8 胃腺癌預(yù)后生存分析：A.CLDN9預(yù)后生存分析；B.PKM2預(yù)后生存分析；C.LDHA預(yù)后生存分析；D.腫瘤大小預(yù)后生存分析；E.分化程度預(yù)后生存分析；F.浸潤深度預(yù)后生存分析；G.脈管侵犯預(yù)后生存分析；H.神經(jīng)侵犯預(yù)后生存分析；I.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)后生存分析

表3 胃腺癌患者預(yù)后Cox多因素分析

3 討論

Claudin蛋白是細(xì)胞間緊密連接的重要組成成分，具有調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞間的防御和屏障功能，維持細(xì)胞間黏附、分化和極性，其異常表達(dá)能夠?qū)е戮o密連接功能失常，影響細(xì)胞間的黏附，促進(jìn)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[8]。Claudins是一個由至少27個成員組成的多基因跨膜蛋白家族，基本結(jié)構(gòu)包括4個跨膜(TM)螺旋結(jié)構(gòu)、2個細(xì)胞外環(huán)(ECLs)、1個N-末端和1個C-末端[9]。部分Claudin，如CLDN1、CLDN4、CLDN7、CLDN18.2已被證實與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。CLDN1在胃癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，與患者預(yù)后不良相關(guān)，有望成為胃癌早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物[10-11]。與正常胃黏膜組織相比，CLDN4在胃癌組織中表達(dá)降低，其表達(dá)與胃癌分化程度、侵襲、遷移呈負(fù)相關(guān)，CLDN4過表達(dá)預(yù)示患者具有更好的預(yù)后[12-13]。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)CLDN7在胃癌組織中的表達(dá)明顯升高，且CLDN7過表達(dá)可抑制E-cadherin的表達(dá)水平，促進(jìn)胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移能力。CLDN11在胃癌中因其啟動子的高甲基化而表達(dá)下調(diào)，增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的生長、增殖和遷移[15-16]。在正常組織中CLDN18.2僅在分化型胃黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，并在胃黏膜上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時被激活，在彌漫型胃癌中常高表達(dá)。目前，針對CLDN18.2的靶向藥物IMAB362在臨床試驗中已取得較好的療效[17-18]。

CLDN9是一種與細(xì)胞通訊連接發(fā)育相關(guān)的蛋白，在人聽力中起至關(guān)重要的作用，其破壞會導(dǎo)致感音性神經(jīng)聽力損失[19]。CLDN9的破壞不僅影響機(jī)體的生理功能，在腫瘤進(jìn)展期緊密連接功能的破壞會使細(xì)胞極性丟失以及細(xì)胞間的信號通路發(fā)生障礙。CLDN9在垂體瘤中的表達(dá)增加，且在侵襲性垂體瘤中CLDN9的表達(dá)水平高于非侵襲性垂體瘤，CLDN9的表達(dá)量增加與腫瘤侵襲性呈正相關(guān)[20]。CLDN9在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，通過激活Tyk2/Stat3信號通路促進(jìn)肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移[4]。CLDN9過表達(dá)還與肺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，敲除CLDN9可顯著抑制肺癌的轉(zhuǎn)移[5]。Yu等[21]通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)CLDN9在胃癌和正常組織中存在差異性表達(dá)，且在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。因此，本實驗采用生物信息學(xué)技術(shù)和免疫組化分析CLDN9在胃腺癌和癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示CLDN9在胃腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜組織，并與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)。目前，有關(guān)CLDN9與Claudin其它家族成員間的關(guān)系，在胃癌進(jìn)展轉(zhuǎn)移研究中尚未見報道。

腫瘤細(xì)胞通過代謝重編程能在營養(yǎng)匱乏的微環(huán)境下存活和增殖，其中糖代謝異常在維持腫瘤的惡性特征中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下仍以糖酵解的方式獲取生長增殖所必需的能量，而不是依賴于氧化磷酸化，腫瘤的這種特殊生物學(xué)特征被稱為Warburg效應(yīng)[22]。腫瘤糖酵解效率主要依賴蛋白質(zhì)和糖酵解關(guān)鍵酶，尤其是GLUT-1、PKM2、LDHA。

GLUT-1與Warburg效應(yīng)密切相關(guān),是葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的重要載體，作為糖酵解的重要調(diào)節(jié)因子之一，下調(diào)GLUT-1會抑制葡萄糖的攝取和乳酸的產(chǎn)生，研究表明GLUT-1高表達(dá)對胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲至關(guān)重要[23-25]。Xi等[26]發(fā)現(xiàn)GLUT-1在喉癌中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)GLUT-1會抑制喉癌的增殖和轉(zhuǎn)移。Yang等[27]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)GLUT-1與直腸癌T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征呈正相關(guān)，提示GLUT-1過表達(dá)可能是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。PKM2是丙酮酸激酶最常見的亞型，是糖酵解重要的調(diào)節(jié)點，通過將高能磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到ADP中，使磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從而生成ATP。PKM2被認(rèn)為是腫瘤生長及代謝的重要調(diào)節(jié)因子，有研究表明在胃癌中敲除PKM2后抑制糖酵解水平，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖[28-31]。Kim等[32]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外PKM2激活EGFR-PKC導(dǎo)致CLDN1表達(dá)增強(qiáng)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力。LDHA通過催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸促進(jìn)糖酵解過程，降低腫瘤微環(huán)境的pH值，在胃癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤的遷移、侵襲[33]。Cai等[34]發(fā)現(xiàn)LDHA在口腔鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)，通過促進(jìn)癌基因和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展。本實驗通過對GLUT-1、PKM2、LDHA在胃腺癌中的表達(dá)及與胃腺癌臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GLUT-1、PKM2、LDHA均在胃腺癌中高表達(dá)，且GLUT-1、PKM2表達(dá)與腫瘤浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。由此可見，胃癌中存在較高的糖酵解水平，產(chǎn)生有利于腫瘤生長的酸性微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

新近研究表明，CLDN9與腫瘤糖代謝具有相關(guān)性。Wang等[6]通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中548例子宮內(nèi)膜癌患者mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CLDN9等9個基因與子宮內(nèi)膜癌糖酵解水平及總生存率密切相關(guān)。Kang等[7]通過數(shù)據(jù)庫分析CLDN9與食管腺癌糖酵解相關(guān)，常會導(dǎo)致預(yù)后不良。本實驗結(jié)果顯示胃腺癌組織中CLDN9與GLUT-1、PKM2、LDHA表達(dá)呈正相關(guān)，且在CLDN9陽性組中GLUT-1、PKM2、LDHA的表達(dá)均高于CLDN9陰性組。因此，我們認(rèn)為CLDN9表達(dá)與胃癌糖代謝相關(guān)，為胃癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制研究提供理論支持。

CLDN9不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲有關(guān)，其高表達(dá)還會影響患者預(yù)后[35]。影響胃癌患者預(yù)后的因素諸多，有研究表明脈管侵犯可作為晚期胃癌及非轉(zhuǎn)移胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素，且神經(jīng)侵犯與胃癌不良預(yù)后關(guān)系密切[36-38]。本組結(jié)果表明CLDN9、PKM2、LDHA、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與患者預(yù)后相關(guān)，且CLDN9陽性者的生存率明顯低于陰性者，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致；Cox回歸模型分析顯示CLDN9、PKM2、腫瘤直徑、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯是胃腺癌預(yù)后的獨立危險因素。由此推測，高表達(dá)的CLDN9影響腫瘤的生物學(xué)行為，參與腫瘤糖酵解的調(diào)控，抑制其表達(dá)可能會延長患者生存時間，改善患者預(yù)后。CLDN9有望成為提示胃癌患者預(yù)后不良的生物學(xué)標(biāo)志物，對臨床治療策略有一定的指導(dǎo)意義，但其生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步分析。

總之，本實驗結(jié)果表明CLDN9、GLUT-1、PKM2及LDHA在胃腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，CLDN9、GLUT-1及PKM2表達(dá)均與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，且CLDN9、PKM2作為胃腺癌預(yù)后的獨立危險因素，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。CLDN9表達(dá)可能與腫瘤糖代謝相關(guān)，在胃癌進(jìn)展中起重要作用，有望成為胃癌診斷和治療的新靶點。