原位甲酯法耦合GC-MS快速分析裂殖壺藻中EPA和DHA含量

唐傳球 甘莉 劉心雨 劉煌 章平平

摘要 以裂殖壺藻為研究對(duì)象，選取料液比、硫酸濃度、浸提溫度、抗氧化劑BHT用量4個(gè)單因素考察原位甲酯法對(duì)EPA和DHA提取率的影響，并與Bligh-Dyer甲酯法進(jìn)行對(duì)比。正交優(yōu)化試驗(yàn)表明，料液比1∶20（g∶mL）、硫酸濃度3.5%（V/V）、浸提溫度80 ℃、BHT用量20 mg為原位甲酯法最佳工藝。通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)，2種方法在脂肪酸甲酯組成上沒(méi)有明顯差別，原位甲酯法中EPA和DHA產(chǎn)量分別占總脂肪酸的0.6%和32.4%，稍低于Bligh-Dyer甲酯法的1.4%和34.3%，但與文獻(xiàn)測(cè)定結(jié)果相近，且制備步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，所用化學(xué)試劑較少，更適合應(yīng)用于快速篩選高產(chǎn)DHA微藻。

關(guān)鍵詞 裂殖壺藻;EPA;DHA;原位甲酯法;GC-MS

中圖分類號(hào) O657.63? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）05-0166-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.042

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Rapid Analysis of EPA and DHA Contents in Schizochytrium sp. by In-situ Methylester Method Coupled with GC-MS

TANG Chuan-qiu， GAN Li， LIU Xin-yu et al

（School of Chemistry and Environmental Engineering， Hanjiang Normal University， Shiyan，Hubei 442000）

Abstract Taking Schizochytrium sp. as the research object， four single factors including solid-liquid ratio， sulfuric acid concentration， extraction temperature and antioxidant BHT dosage were selected to investigate the effect of in-situ methylester method on the extraction rate of fatty acids， compared with Bligh-Dyer methylester method. The results of orthogonal experiment showed that the optimum conditions of in-situ methyl ester method were as follows： the solid-liquid ratio was 1∶20（g∶mL）， sulfuric acid concentration was 3.5%（V/V）， the extraction temperature was 80 ℃， and the BHT dosage was 20 mg. GC-MS analysis showed that there was no significant difference in the composition of fatty acid methyl esters between the two methods. The production of EPA and DHA by in-situ methylester method accounted for 0.6% and 32.4% of the total fatty acids， respectively， which was slightly lower than that by Bligh-Dyer methylester method （1.4% and 34.3%）. However， it was basically consistent with the results of literature. Moreover， the preparation steps were relatively simple and less chemical reagents were used， which was more suitable for the rapid analysis of fatty acids for screening high-yield DHA microalgae strains.

Key words Schizochytrium sp.;EPA;DHA;In-situ methylester method;GC-MS

基金項(xiàng)目 湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目（B2019189）;湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃中青年人才項(xiàng)目（Q20173102）。

作者簡(jiǎn)介 唐傳球（1980—），男，安徽池州人，副教授，碩士，從事分離材料合成與應(yīng)用研究。*通信作者，副教授，碩士，從事現(xiàn)代分離分析技術(shù)研究。

收稿日期 2021-06-17

ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是指從脂肪酸碳鏈甲基端算起，第一個(gè)雙鍵出現(xiàn)在第3位碳原子上的多不飽和脂肪酸，主要包括十八碳三烯酸（ALA，C18∶3）、二十碳五烯酸（EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（DHA，C22∶6）。EPA 和DHA因具有降低心血管疾病、延緩腦衰老、抑制腫瘤生長(zhǎng)和提高人體免疫機(jī)能等重要功能，備受人們關(guān)注[1-2]。長(zhǎng)久以來(lái)，深海魚類是人們獲取EPA 和DHA 的傳統(tǒng)原料。后期研究表明，海洋微藻才是 EPA 和DHA 等多不飽和脂肪酸的原始生產(chǎn)者，有些藻體內(nèi)DHA或 EPA的相對(duì)含量高達(dá)5%～6%細(xì)胞干重。

目前被世界各國(guó)批準(zhǔn)可用于商業(yè)化生產(chǎn)DHA的微藻主要有裂殖壺藻（Schizochytrium sp.）、寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii）、吾肯氏壺藻（Ulkenia amoeboida）3類。其中裂殖壺菌是一種單細(xì)胞球形異養(yǎng)海洋真菌，胞內(nèi)油脂含量達(dá)70%以上，通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化及改造菌株的方法，生物量達(dá)140～190 g/L，DHA含量可達(dá)40%[3]。目前國(guó)內(nèi)在大規(guī)模培養(yǎng)微藻獲取EPA和DHA的中試放大試驗(yàn)工作還處于起步階段，大量工作仍集中在篩選高產(chǎn)EPA和DHA藻株領(lǐng)域。

裂殖壺藻中的總油脂由中性脂類和極性脂類組成，中性脂類有甘油三酯，極性脂類主要有游離脂肪酸、甘油二酯和單甘酯，其沸點(diǎn)較高不容易汽化。為了分離提純其中的脂肪酸，必須通過(guò)酯交換反應(yīng)生成沸點(diǎn)較低且比較穩(wěn)定的脂肪酸甲酯[4-7]。傳統(tǒng)微藻樣品進(jìn)行脂肪酸測(cè)定時(shí)，通常采用Bligh-Dyer法先抽提出藻油，再進(jìn)行皂化處理成沸點(diǎn)低、極性小、易揮發(fā)的脂肪酸甲酯（簡(jiǎn)稱Bligh-Dyer甲酯法），但該方法煩瑣、消耗溶劑量大，不適宜快速分析脂肪酸組成[8-10]。

筆者以裂殖壺藻為原料，采用硫酸-甲醇原位甲酯法，集萃取與酯化為一體，耦合GC-MS，快速有效地揭示裂殖壺藻中EPA、DHA組成的特征與差異;分別選取料液比、硫酸濃度、浸提溫度、抗氧化劑用量對(duì)方法工藝進(jìn)行優(yōu)化，以便于得到最佳的優(yōu)化參數(shù)及較高的DHA提取率，旨在確立DHA微藻最佳不飽和脂肪酸分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

該研究中使用的裂殖壺藻粉末由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻類生物學(xué)研究中心提供。硫酸、硫酸鈉、甲醇、三氟化硼均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;正己烷，色譜純，購(gòu)于Fisher Scientific公司;37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（Supelco 37 Component FAME Mix）購(gòu)于Merck 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）;KQ-1000VDB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;Avanti JXN-26 低溫高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）;WH-3漩渦混合器（常州市金壇晨陽(yáng)電子儀器廠）;ME204電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）;JXMINI-80迷你干式恒溫器（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 色譜條件

HP-88石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 m），載氣為高純He（99.99%）;進(jìn)樣口溫度250 ℃;升溫程序：175 ℃保持5 min，以3 ℃/min的速率升至220 ℃，停留5 min;進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣方式20∶1分流進(jìn)樣;柱流量1.0 mL/min;GC-MS接口溫度250 ℃。

1.4 質(zhì)譜條件

EI源;離子源溫度 230 ℃;傳輸線溫度230 ℃;電離電壓70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z 40～460。

1.5 原位甲酯法

取研磨過(guò)的微藻粉末100 mg于15 mL具塞試管中，加入2 mL 4%硫酸-甲醇溶液（V/V）和一定劑量的抗氧化劑，渦旋搖勻，80 ℃水浴加熱1 h后，冷卻，加入1 mL正己烷和內(nèi)標(biāo)液搖勻，再加入1 mL飽和氯化鈉溶液搖勻，離心取上層溶液進(jìn)行GC-MS分析。

由于DHA 和 EPA含有多個(gè)不飽和雙鍵，所以它在光、氧、熱、金屬元素（Fe2+、Cu2+有催化作用）及自由基等因素的作用下，非常容易發(fā)生氧化、酸敗、聚合和雙鍵共軛化等化學(xué)反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生一些揮發(fā)和非揮發(fā)性物質(zhì)，如醛、酮、醇、酸和羰基化合物。防止DHA微藻氧化的最有效方法是添加高效抗氧化劑[11]。該研究綜合考慮抗氧化劑的安全性和成本，選定二丁基羥基甲苯（BHT）為抗氧化劑組分[12]。

1.6 Bligh-Dyer甲酯法

采用Bligh-Dyer法提取裂殖壺藻中的脂肪油，參照Araujo等[13]的方法將脂肪酸水解形成脂肪酸甲酯，獲得待氣質(zhì)聯(lián)用儀分析的樣品;采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)脂肪酸甲酯進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bligh-Dyer甲酯法和原位甲酯法流程對(duì)比

如圖1所示，通過(guò)Bligh-Dyer甲酯法提取微藻脂肪酸的各個(gè)階段與原位甲酯法相比，流程相當(dāng)冗長(zhǎng)。原位甲酯法集萃取與酯化為一體，既節(jié)省了勞力，又減少了大量萃取劑的消耗。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)微藻DHA得率的影響。

在硫酸濃度3%（V/V）、浸提溫度80 ℃、BHT用量20 mg條件下，研究料液比對(duì)微藻DHA得率的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，隨著料液比的降低，DHA得率總體呈上升趨勢(shì)。但在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，料液比越大，大大增加了生產(chǎn)成本和環(huán)境成本，且溶劑蒸發(fā)問(wèn)題不容忽視，因此，1∶20（g∶mL）為相對(duì)較合適的料液比用量。

2.1.2 硫酸濃度對(duì)微藻DHA得率的影響。

在料液比1∶20、浸提溫度80 ℃、BHT用量20 mg條件下，研究不同硫酸濃度對(duì)微藻DHA得率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，硫酸濃度在1%～4%（V/V）時(shí)，得率呈上升趨勢(shì);之后隨硫酸濃度的進(jìn)一步提高，得率呈下降趨勢(shì)，在4%時(shí)最佳。

2.1.3 浸提溫度對(duì)微藻DHA得率的影響。

在料液比1∶20、硫酸濃度4%、BHT用量20 mg條件下，研究浸提溫度對(duì)微藻DHA得率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著浸提溫度的提高，微藻DHA得率呈上升趨勢(shì);當(dāng)浸提溫度為80 ℃時(shí)，微藻DHA得率達(dá)到最大;當(dāng)浸提溫度為45～80 ℃時(shí)，微藻DHA得率上升較快;當(dāng)浸提溫度為80 ℃以上時(shí)，微藻DHA得率增速呈下降趨勢(shì)。因此，選擇浸提溫度為80 ℃。

2.1.4 BHT用量對(duì)DHA得率的影響。

在料液比1∶20、硫酸濃度4%、浸提溫度80 ℃條件下，研究BHT用量對(duì)微藻DHA得率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，BHT用量對(duì)微藻DHA得率的影響總體上呈隨用量增加而提高的趨勢(shì)。在BHT用量10～30? mg時(shí)，上升趨勢(shì)明顯;30 mg之后趨于平緩，微藻DHA得率變化不大，BHT用量增加對(duì)微藻DHA得率的影響并不大。因此，30 mg為相對(duì)較合適的抗氧化劑用量。

2.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取的工藝條件是料液比1∶10～1∶30、硫酸濃度3.5%～4.5%、浸提溫度70～90 ℃、BHT 用量20～40 mg，選用L 9（34）正交表（表1）對(duì)試驗(yàn)影響因素進(jìn)行優(yōu)化。

從正交試驗(yàn)分析結(jié)果（表2）可知，原位甲酯法影響因素的主次順序?yàn)镃>A>B>D，即浸提溫度>料液比>硫酸濃度>BHT用量。故確定最優(yōu)工藝條件時(shí)，首先應(yīng)滿足浸提溫度的要求。所以可以確定最優(yōu)水平組合為A 2B 1C 2D 1，即料液比1∶20、硫酸濃度3.5%、浸提溫度80 ℃、BHT用量20 mg。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

將優(yōu)化好的

原位甲酯法和Bligh-Dyer甲酯法處理的DHA微藻經(jīng)GC-MS檢測(cè)，其總離子流圖（TIC）如圖6所示。從圖6可以看出，原位甲酯法和Bligh-Dyer甲酯法在脂肪酸甲酯組成上差別較小。2 種方法提取的脂肪酸組分均為C13～ C22的飽和及不飽和脂肪酸組成。原位甲酯法以C15∶0、C16∶0、C22∶6為特征脂肪酸，其中EPA含量占總脂肪酸的0.6%，DHA 含量占總脂肪酸的32.4%，與康晶等[14]的研究結(jié)果基本相一致。Bligh-Dyer甲酯法則由以C14∶0、C15∶0、C16∶0、C22∶6為特征脂肪酸，其中EPA含量占總脂肪酸的1.4%，DHA 含量占總脂肪酸的34.3%。

從表3可以看出，原位甲酯法雖然EPA、DHA產(chǎn)量稍低于Bligh-Dyer甲酯法，但DHA含量與文獻(xiàn)的研究結(jié)果接近[15-17]，且分析步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，所用化學(xué)試劑較少，也不失為一種篩選高產(chǎn)DHA海洋微藻的脂肪酸快速分析方法。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)考察原位甲酯法分析裂殖壺菌粉脂肪酸的影響因素，4個(gè)主要因素的主次順序依次為浸提溫度、料液比、硫酸濃度、BHT用量。試驗(yàn)較佳的分析條件為料液比1∶20、硫酸濃度3.5%、浸提溫度80 ℃、BHT用量20 mg。通過(guò)與Bligh-Dyer甲酯法驗(yàn)證對(duì)比，在脂肪酸甲酯組成上2種方法沒(méi)有明顯差別。相對(duì)于Bligh-Dyer甲酯法，原位甲酯法因消耗溶劑少、操作簡(jiǎn)單，更適合應(yīng)用于篩選高產(chǎn)EPA和DHA藻株的脂肪酸分析法。

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