貴州民族藥石吊蘭不同種質(zhì)資源藥材的品質(zhì)評(píng)價(jià)研究

龍 毅， 劉 趣， 徐文芬， 孫慶文， 趙武霞， 王 波， 陳 亮

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴陽 550025)

石吊蘭為2020年版《中國(guó)藥典》一部收載品種，也為2003年版《中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載的貴州少數(shù)民族常用藥物，又名巖豇豆，來源于苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)的干燥地上部分，具有止咳化痰、軟堅(jiān)散結(jié)、健脾消積之功效，常用于治療咳嗽痰多、瘰疬痰核等疾病，民間常用來治療慢性支氣管炎、肺結(jié)核、風(fēng)濕疼痛、跌打損傷等病癥[1-2]。其原植物主要生長(zhǎng)于喀斯特地貌地區(qū)的巖石上或樹上，海拔300～2 000 m[3-4]。目前，市場(chǎng)上石吊蘭藥材主要依賴野生資源，隨著臨床需求越來越大，導(dǎo)致野生資源量逐漸減少，而石吊蘭的人工栽培馴化尚缺乏系統(tǒng)科學(xué)的研究基礎(chǔ)，嚴(yán)重影響了民族藥資源的保護(hù)與可持續(xù)利用，加之各方面基礎(chǔ)研究較薄弱，這將是制約貴州特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)穩(wěn)步健康發(fā)展的瓶頸問題。

種質(zhì)資源對(duì)藥材質(zhì)量存在根本性的影響，是中藥材規(guī)?；?guī)范化基地建設(shè)的先決條件[5-8]。因此，開展對(duì)石吊蘭野生種質(zhì)資源品質(zhì)評(píng)價(jià)，篩選其優(yōu)良種源是該藥材規(guī)范化種植研究的關(guān)鍵，本課題組開展了石吊蘭藥材引種馴化、野生撫育與品質(zhì)評(píng)價(jià)等研究，發(fā)現(xiàn)連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、5,4′-二羥基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(以下簡(jiǎn)稱Ⅰ)及7-羥基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黃酮苷(以下簡(jiǎn)稱Ⅱ)均對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2 B體外支氣管炎有較強(qiáng)的抑制作用，其中吊蘭素是現(xiàn)行《中國(guó)藥典》收載石吊蘭質(zhì)量控制指標(biāo)。本文擬以石吊蘭素、連翹脂苷B等上述5種有效成分為指標(biāo)，采用超高效液相色譜法(UPLC)建立多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法[9-12]，分析評(píng)價(jià)產(chǎn)自不同地域的石吊蘭種源藥材質(zhì)量，篩選出最優(yōu)石吊蘭種質(zhì)資源。本研究將為科學(xué)地種植和可持續(xù)利用石吊蘭藥材提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試藥及供試樣品

連翹脂苷B對(duì)照品(批號(hào)：111811-201603)、毛蕊花糖苷對(duì)照品(批號(hào)：111530-201512)、石吊蘭素對(duì)照品(批號(hào)：111555-200602)均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；Ⅰ與Ⅱ均由實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜等波譜技術(shù)結(jié)合文獻(xiàn)鑒定結(jié)構(gòu)，采用UPLC峰面積歸一化法測(cè)定，其純度均達(dá)98%以上，可供含量測(cè)定用，以下分別用Ⅰ、Ⅱ表示。乙腈、甲醇(美國(guó)天地有限公司，色譜級(jí))；甲酸、甲醇、乙醇等、均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水。

供試藥材樣品(S 1～S 30)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)的新鮮或干燥全草，凈制后于40 ℃低溫烘干、粉碎、過三號(hào)篩，備用。樣品信息見表4。

1.1.2儀 器

Agilent 1290超高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，雙二元梯度泵)；AG 135電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FN 101-2 A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(長(zhǎng)沙儀器儀表廠)等。

1.2 方 法

1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-Aq(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈，梯度洗脫(洗脫程序見表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)為332 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.2溶液的制備

1) 對(duì)照品溶液的制備：分別取連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ的對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇溶液溶解制成質(zhì)量濃度分別為5.006 mg/mL、2.500 mg/mL、0.400 0 mg/mL、0.160 0 mg/mL及1.004 mg/mL的單一對(duì)照品溶液，作為儲(chǔ)備液。然后精密吸取各儲(chǔ)備液0.5 mL并置于容量瓶中，加80%甲醇溶液制成每1 mL分別含連翹脂苷B為100.1 μg、毛蕊花糖苷為50.00 μg、石吊蘭素為8.000 μg、Ⅰ為3.200 μg及Ⅱ?yàn)?0.08 μg的混合對(duì)照品溶液，置4 ℃下冷藏，備用。

2) 供試品溶液的制備：取粉碎過三號(hào)篩的石吊蘭藥材粉末0.5 g，準(zhǔn)確稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液15 mL，搖勻，密塞，稱定其重量，超聲處理20 min，取出，冷卻至室溫，以相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，過濾，即得供試品溶液。

1.2.3專屬性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率試驗(yàn)

1) 專屬性試驗(yàn)。分別取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液，以80%甲醇溶液為空白溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液的色譜圖及待測(cè)成分色譜峰的紫外吸收光譜圖。

2) 線性關(guān)系考察。取上述單一對(duì)照品溶液，分別制備成一系列梯度濃度對(duì)照品溶液，按照優(yōu)化確定的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

3) 精密度試驗(yàn)。取上述混合對(duì)照品溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄各待測(cè)成分峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD值。

4) 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批藥材粉末(S 29)6份，每份0.5 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，將各待測(cè)成分峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并計(jì)算其含量的RSD值。

5) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取石吊蘭藥材粉末(S 29)0.5 g，精密稱定，按1.2.2方法制備供試品溶液，在優(yōu)化確定的色譜條件下分別于0、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄各待測(cè)成分峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD值。

6) 加樣回收試驗(yàn)。取已知含量的石吊蘭藥材粉末(S 29)0.25 g，精密稱定，按1∶1的比例加入對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，按優(yōu)化確定的色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，將各待測(cè)成分峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量，并計(jì)算回收率和RSD值。

1.2.4樣品測(cè)定

分別取30批貴州不同種源石吊蘭藥材，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并按優(yōu)化確定的色譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄各待測(cè)成分的峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算干燥品石吊蘭藥材中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ、Ⅱ的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性、專屬性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性，連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ 5種成分的色譜峰，色譜峰彼此之間及與雜質(zhì)峰之間的分離度均≥1.5，峰形對(duì)稱，且理論塔板數(shù)均不低于3 000。專屬性如圖1所示，供試品溶液中的待測(cè)成分色譜峰與對(duì)照品溶液中的連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、Ⅰ、Ⅱ及石吊蘭素的保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖一致，且各色譜峰的純度因子均>0.991，分離度均>1.5，達(dá)到基線分離；空白溶液在相應(yīng)的保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，說明空白溶液對(duì)待測(cè)成分無干擾，表明該方法專屬性良好。線性關(guān)系，5種待測(cè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表2，結(jié)果表明，連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ的進(jìn)樣量分別在0.004 806～15.02 μg，0.002 400～7.500 μg，0.001 920～1.200 μg，0.007 500～0.480 0 μg，0.000 963 8～3.012 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。精密度，連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ?qū)φ掌贩迕娣e的RSD值分別為1.1%、1.8%、0.53%、1.9%、0.84%，均符合2020年版《中國(guó)藥典》四部(通則0512)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)要求，表明儀器精密度良好。重復(fù)性，6份供試品中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ及Ⅱ的平均含量分別為1.5%、0.058%、0.34%、0.008 8%、0.13%，其RSD值分別為1.1%、1.3%、1.0%、2.5%、1.2%，均符合2020年版《中國(guó)藥典》四部(通則9101)相關(guān)要求，表明此方法測(cè)定的重復(fù)性良好。穩(wěn)定性，供試品中5種待測(cè)成分峰面積的RSD值分別為1.4%、2.3%、0.35%、1.0%、0.40%，均小于3.0%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

注：A為空白溶液；B為供試品溶液；C為對(duì)照品溶液；1為連翹酯苷B；2為毛蕊花糖苷；3為5,4′-二羥基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)；4為7-羥基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黃酮苷(Ⅱ)；5為石吊蘭素。

表2 5種待測(cè)成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍結(jié)果

2.2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ、Ⅱ的回收率分別為96.75%、104.68%、101.34%、100.88%、105.31%，其RSD值分別為2.5%、1.8%、3.5%、2.8%、2.0%，均符合2020年版《中國(guó)藥典》四部(通則9101)相關(guān)要求，表明該方法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 樣品測(cè)定結(jié)果

30批石吊蘭不同種源藥材干燥樣品中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、Ⅰ、Ⅱ的含量，結(jié)果見表4和圖2。

表4 30批石吊蘭不同種源藥材中5種有效成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

圖2 30批石吊蘭不同種源藥材中5種有效成分含量

3 討 論

通過測(cè)定30批貴州石吊蘭不同種質(zhì)資源藥材中連翹脂苷B、毛蕊花糖苷、石吊蘭素、5,4′-二羥基-6,7-二甲氧基-8-C-β-D-葡萄糖苷(Ⅰ)及7-羥基-6,8,4′-三甲氧基-5-O-β-D-葡萄糖黃酮苷(Ⅱ)的含量，不同種源藥材中5種有效成分的含量差異均表現(xiàn)為連翹酯苷B>毛蕊花糖苷>Ⅱ>石吊蘭素>Ⅰ。結(jié)果顯示，以貴州惠水大龍鄉(xiāng)、長(zhǎng)順代化鎮(zhèn)、冊(cè)亨戴家坡、安龍仙鶴坪產(chǎn)地的總含量較高。這一結(jié)果驗(yàn)證了不同的環(huán)境會(huì)引起同一藥材原植物性狀和代謝產(chǎn)物的差異。根據(jù)本研究結(jié)果，上述4個(gè)產(chǎn)地的石吊蘭可作為最佳引種種質(zhì)，建議可以通過引種觀察及野生馴化研究，為民族藥石吊蘭的良種選育及規(guī)模化規(guī)范化種植研究提供前期基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)在前期石吊蘭指紋圖譜測(cè)定和文獻(xiàn)基礎(chǔ)上分別對(duì)流動(dòng)相、色譜柱、波長(zhǎng)、柱溫等進(jìn)行優(yōu)化后確定色譜條件。同時(shí)為了最大限度地提取待測(cè)成分，提高檢測(cè)的靈敏度，先后對(duì)提取方法、提取溶劑、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行考察，其中以提取溶劑和料液比的影響較大，提取方法、提取時(shí)間考察結(jié)果差異不明顯，所以從提取操作方便和試劑成本角度出發(fā)，最終確定上述供試品溶液制備方法。

本研究在闡明石吊蘭抗支氣管炎藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)上，建立了石吊蘭藥材多有效成分指標(biāo)含量測(cè)定方法，能夠較全面地反映石吊蘭藥材的內(nèi)在質(zhì)量，為石吊蘭不同種質(zhì)資源藥材質(zhì)量的客觀評(píng)價(jià)奠定了理論基礎(chǔ)。同時(shí)，所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為石吊蘭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了參考。